Injeções intrafemorais simplificadas usando camundongos vivos permitem análise contínua da medula óssea
10 de novembro de 2023
Este protocolo descreve a injeção intrafemoral de algumas células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas, incluindo células editadas por genes, em modelos de xenoenxerto murino, o que permitirá não apenas o transplante rápido e seguro de células, mas também análises seriadas da medula óssea.
Esta técnica destina-se a nos ajudar a entender melhor a biologia da hematopoiese normal e da doença na medula óssea, injetando e transplantando com segurança amostras valiosas de pacientes nos camundongos por via intraoral, seguida de aspiração da medula óssea. Há muito se sabe que é mais eficiente transplantar pequenas quantidades de amostras valiosas diretamente para a medula óssea de camundongos para experimentos feitos por injeção intravenosa. No entanto, não há vídeos técnicos reais, por isso geralmente era considerada uma técnica de alto obstáculo.
Nosso protocolo permite que qualquer amostra valiosa seja enxertada com facilidade e segurança no camundongo com um pequeno número de células. Há uma alta demanda por essa tecnologia e, com a ajuda deste vídeo, qualquer pessoa pode aprendê-la rapidamente. Esperamos que todos possam dominar essa tecnologia e contribuir significativamente para o avanço da ciência.
Para começar, prepare suspensões celulares com até 3 milhões de células de amostra usando 20 microlitros de tampão FACS ou meio de descongelamento. Mantenha-os no gelo antes da injeção. Desinfete a perna que contém o fêmur a ser injetado com três conjuntos de esfoliantes alternados usando um esfoliante de iodopovidona ou clorexidina e esponjas de gaze embebidas em etanol a 70%.
Estabilize a perna beliscando o fêmur com o polegar e o indicador. Empurre a tíbia com o dedo anelar ou o quinto dedo para manter a tíbia dobrada em relação ao fêmur. Garanta o posicionamento adequado para uma injeção bem-sucedida.
Use a ponta de uma agulha 27G estéril vazia para bicar o tendão patelar no topo do fêmur. Para garantir o melhor ponto de inserção, insira a agulha 27G com uma seringa acoplada logo abaixo do tendão patelar. Alojando-o com segurança entre os dois côndilos do fêmur, gire a agulha para fora e para cima para alinhá-la paralelamente à diáfise do fêmur.
Gire a agulha em círculos enquanto a avança para a cavidade da medula femoral. Insira a agulha até que haja uma redução perceptível na resistência. Confirme o posicionamento correto da agulha por movimento lateral.
Crie pressão negativa puxando o êmbolo da agulha para trás enquanto move a agulha dentro da cavidade da medula óssea. Verifique se há sangue ou medula na seringa para garantir que a agulha esteja na cavidade da medula óssea. Depois de garantir a colocação correta da agulha, remova-a lentamente e insira a célula contendo a seringa pela mesma raiz.
É importante lembrar a raiz e o ângulo da primeira injeção ao mudar para uma nova agulha. Assim que as células forem injetadas com sucesso no fêmur, remova cuidadosamente a agulha e a seringa, mantendo a pressão na seringa. Em seguida, remova o mouse do cone do nariz e coloque-o sobre uma toalha de papel limpa para evitar a aspiração da roupa de cama.
Para recuperação, mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ou outra superfície controlada. Garanta a recuperação da anestesia antes de colocá-los de volta no suporte do mouse. Observe os ratos em busca de sinais de angústia ou infecção nas próximas 24 horas.
Comece se preparando para o procedimento antes de aspirar a medula óssea, molhe uma seringa 27G de 0,5 mililitro com CSM enchendo e expelindo CSM duas a três vezes. Em seguida, aspire suavemente a medula óssea do camundongo anestesiado, produzindo 20 a 50 microlitros de medula óssea. Em seguida, remova totalmente a agulha do fêmur e suspenda a amostra aspirada em 500 microlitros de CSM.
Remova o mouse do cone do nariz e coloque-o sobre uma toalha de papel limpa para evitar a aspiração da cama durante a recuperação. Monitore todos os camundongos para verificar a recuperação da anestesia antes de colocá-los na parte de trás do rack do mouse. Células pellets da medula óssea com um giro de cinco minutos a 300G a quatro graus Celsius.
Aspire o sobrenadante e adicione tampão de lise ACK a cada tubo. Vortex as células para ressuspendê-las e coloque-as no gelo por 5 a 10 minutos. Filtre a suspensão celular através de malha de nylon em um novo tubo.
Enxágue o tubo original com tampão FACS e passe-o pela malha de náilon, pellet células novamente girando por cinco minutos a 300G a quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante das células peletizadas e adicionar a solução de coloração contendo os anticorpos desejados. Mantenha os tubos no gelo por 20 minutos.
Lave as células e prossiga para analisá-las de acordo com a configuração experimental. As técnicas de transplante podem ser facilmente avaliadas com invasão mínima de camundongos usando uma imagem de bioluminescência. Aqui, o transplante de uma linhagem celular K562 derivada humana com Acalook foi observado em um modelo de camundongo xenoenxerto no lado do fêmur injetado.
O transplante de HSPCs CD34 positivos resultou em mais de 10 a 20% do enxerto de células humanas oito semanas após o transplante. Da mesma forma, o transplante de HSCs derivados do sangue do cordão umbilical resultou em até 10% de enxerto humano oito semanas após o transplante. O transplante bem-sucedido adicional de HSPCs derivados da medula óssea adulta, células-tronco de leucemia, HSPCs derivados do sangue do cordão umbilical editados por CRISPR Cas9 e iPSCs de LMA derivados de pacientes foi alcançado usando este procedimento.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a técnica de injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas em modelos murinos. Este método facilita o transplante seguro e permite análises seriadas da medula óssea.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hematopoese
- Biologia das Células-Tronco
- Modelos de Xenotransplante
Antecedentes
- Compreender a hematopoese normal e as doenças relacionadas é fundamental para o avanço da ciência médica.
- A injeção direta na medula óssea é mais eficiente do que os métodos intravenosos.
- As técnicas anteriores careciam de recursos instrucionais acessíveis.
- Este protocolo tem como objetivo simplificar o processo para pesquisadores.
Objetivo do Estudo
- Permitir o enxerto seguro e eficiente de amostras valiosas de pacientes em camundongos.
- Fornecer um guia instrucional claro para pesquisadores.
- Aprimorar a compreensão das doenças hematopoiéticas.
Métodos Utilizados
- Preparação de suspensões celulares com tampão FACS.
- Desinfecção e estabilização do local de injeção.
- Técnica de injeção intrafemoral utilizando uma agulha estéril.
- Aspiração da medula óssea para análise após a injeção.
Resultados Principais
- Enxerto bem-sucedido de células-tronco derivadas de humanos em modelos murinos.
- Altas taxas de enxerto de células humanas demonstradas em oito semanas.
- Transplante bem-sucedido de diversos tipos de células-tronco, incluindo células editadas geneticamente.
- O protocolo permite mínima invasão do camundongo e monitoramento eficaz.
Conclusões
- Esta técnica fornece um método confiável para transplante de células-tronco em pesquisas.
- Ela atende à demanda por protocolos acessíveis na pesquisa hematopoiética.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar diversas condições hematológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A injeção intrafemoral direta e a aspiração serial de medula óssea em camundongos vivos permitem a análise contínua e minimamente invasiva do enxerto e da função de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC). Essa abordagem supera um gargalo crítico na hematologia pré-clínica, possibilitando a avaliação prospectiva e quantitativa de populações celulares residentes na medula óssea utilizando amostras limitadas, porém de alto valor. O método aumenta a confiabilidade preditiva para estudos translacionais e apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco na pesquisa de terapias celulares e doenças hematológicas em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta do enxerto de HSPC e da produção de linhagens em um nicho de medula óssea fisiologicamente relevante.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao permitir a recuperação serial e o fenotipamento de células transplantadas ao longo do tempo.
- Facilita a validação funcional de populações celulares editadas por engenharia genética ou derivadas de pacientes in vivo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema in vivo validado para avaliação da eficiência de enxertia e do destino celular utilizando pequenos números de amostras.
- Permite a medição reprodutível e quantitativa da quimeria da medula óssea e da composição celular após transplante.
- Apóia a padronização de ensaios para fluxos de trabalho de xenotransplante e transplante de células-tronco.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à modelagem relevante para doenças de distúrbios hematopoiéticos e intervenções terapêuticas.
- Permite o acompanhamento longitudinal do enxerto e da persistência de células humanas em modelos de xenotransplante murino.
- Apóia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais mediante a correlação entre os resultados da medula óssea e os desfechos funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica ao permitir a análise contínua e quantitativa do enxerto da medula óssea em modelos animais vivos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de HSPC e interações com o nicho por meio do acesso direto à medula óssea.
- Triagem: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis de enxerto para populações celulares candidatas.
- Análises: Permite a medição seriada de quimerismo da medula óssea e fenótipo celular para estudos comparativos.
- Pesquisa Translacional: Facilita a continuidade dos achados in vitro para validação in vivo em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e reutilizável para diversos programas de pesquisa em terapia celular e hematologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva do enxerto e da função de HSPC ao permitir análise direta e serial da medula óssea.
- Valor Operacional: Padroniza procedimentos minimamente invasivos para estudos de transplante de alto valor com baixo número de células.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de continuidade ou interrupção ao fornecer dados quantitativos robustos in vivo no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos em terapia celular e hematologia com base em resultados funcionais in vivo.
Considerações de Implementação
- Requer experiência técnica em manuseio de camundongos, anestesia e técnicas de injeção intrafemoral.
- Necessita de acesso à análise por FACS e infraestrutura de imagem para caracterização celular pós-análise.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de injeção e aspiração para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversas fontes celulares, incluindo HSPCs editadas geneticamente, derivadas de pacientes e de sangue do cordão umbilical.
- Limitado pela necessidade de monitoramento cuidadoso após o procedimento para assegurar o bem-estar animal e a integridade dos dados.
