Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única
10 de novembro de 2023
Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.
Nossa pesquisa visa investigar as alterações transcriptômicas que ocorrem durante o desenvolvimento e disfunção gastrointestinal em larvas de zebrafish. Aqui, fornecemos um novo protocolo que permite o isolamento de diferentes tipos de células dentro do intestino do peixe-zebra, que tem aplicações potenciais na compreensão da saúde e da doença gastrointestinal. Nos últimos anos, tem havido crescente interesse em explorar a interação entre o sistema nervoso entérico e outros tipos de células intestinais durante o desenvolvimento e a doença.
Compreender essas dinâmicas complexas usando técnicas avançadas, como o sequenciamento de RNA de célula única, tem o potencial de revelar insights críticos sobre neuromiopatias entéricas, levando a diagnósticos e tratamentos mais precisos. Usando este protocolo, identificamos com sucesso vários tipos de células intestinais, incluindo epiteliais, estromais, sangue, músculos, células imunes e até neurônios entéricos e glia, que não foram capturados antes nesta quantidade usando abordagens semelhantes. Assim, fornecemos uma técnica confiável para estudar a composição gastrointestinal durante o desenvolvimento e disfunção.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo inovador para o isolamento de células intestinais de larvas de peixe-zebra com 5 dias pós-fertilização, facilitando a análise de sequenciamento de RNA de célula única. O método tem como objetivo aprimorar a compreensão do desenvolvimento e disfunção gastrointestinal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Saúde Gastrointestinal
Antecedentes
- Investigação das trocas de transcriptoma durante o desenvolvimento gastrointestinal.
- Foco nas interações entre o sistema nervoso anterior e os tipos celulares intestinais.
- Importância de técnicas avançadas no estudo de neuromiopatias.
- Potencial para diagnósticos e tratamentos aprimorados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para o isolamento de diversos tipos de células intestinais.
- Aprimorar a compreensão da composição gastrointestinal durante o desenvolvimento.
- Explorar as implicações para a saúde e doenças gastrointestinais.
Métodos Utilizados
- Isolamento de diferentes tipos celulares no intestino de peixe-zebra.
- Aplicação de sequenciamento de RNA em única célula.
- Identificação de células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares, imunes e gânglios neurais entéricos.
- Utilização de um protocolo inovador para maior captura celular.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de diversos tipos de células intestinais.
- Novas perspectivas sobre a saúde gastrointestinal e a dinâmica das doenças.
- Compreensão aprimorada das neuromiopatias anteriores.
- Técnica confiável para o estudo da composição gastrointestinal.
Conclusões
- O protocolo representa um avanço significativo no isolamento de células intestinais.
- Abre caminhos para pesquisas adicionais sobre a saúde gastrointestinal.
- Potencial para aprimorar a compreensão dos processos de desenvolvimento e de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sequenciamento de RNA de célula única do intestino de larvas de peixe-zebra permite o mapeamento de alta resolução da diversidade celular intestinal durante o desenvolvimento e a modelagem de doenças. Este protocolo apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em portfólios de pesquisa gastrointestinal. A abordagem aumenta a confiança preditiva na seleção de sistemas relevantes para doenças e na descoberta de biomarcadores translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de transcriptomas específicos de tipos celulares em um modelo vertebrado.
- Apóia a validação funcional de alvos ao isolar neurônios entéricos, células gliais e células imunes.
- Facilita a desmistificação mecanicista de alvos neuromusculares e epiteliais em distúrbios gastrointestinais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece suspensões viáveis e validadas de células únicas para ensaios transcriptômicos subsequentes.
- Padroniza o isolamento e a classificação celular para obter saídas quantitativas reprodutíveis.
- Permite o preparo escalonável de células derivadas do intestino para plataformas de triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a composição celular do intestino de peixe-zebra com a biologia gastrointestinal humana relevante para doenças.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos gastrointestinais.
- Permite o avanço ajustado ao risco de alvos candidatos com base em perfis de expressão específicos ao tipo celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir o isolamento e o perfilamento de tipos celulares intestinais para identificação de alvos, validação e estudos mecanicistas.
- Biologia de Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre o desenvolvimento e disfunção do trato gastrointestinal com resolução em nível de célula única.
- Triagem: Fornece populações celulares viáveis e reprodutíveis para ensaios transcriptômicos e fenotípicos.
- Análise de Dados: Fornece dados quantitativos de expressão gênica para análise comparativa entre tipos celulares e condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a biologia gastrointestinal de peixe-zebra e humana para alinhamento de biomarcadores e modelagem de doenças.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para isolamento de células intestinais e análise em nível de célula única em diversos programas de pesquisa gastrointestinal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos gastrointestinais e na compreensão mecanicista.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento e a classificação celular para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir ao permitir insights transcriptômicos específicos por tipo celular.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos gastrointestinais e modelos de doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manejo de peixes-zebra, dissecação e protocolos de célula única.
- Requer acesso a instrumentação de FACS e plataformas de sequenciamento de RNA de célula única.
- Exige padronização entre equipes para isolamento e separação celular reprodutível.
- Pode ser necessária adaptação para outros estágios de desenvolvimento ou organismos modelo.
- A viabilidade e o rendimento celular dependem de etapas precisas de dissecação e dissociação enzimática.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
1:22
Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation
2:50
Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells
5:25
FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq
