Name: Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a isolar células intestinais de larvas de zebrafish para sequenciamento de RNA de célula única. Este protocolo permite identificar tipos celulares epiteliais, estromais, sanguíneos, musculares, imunes e gânglios neurais entéricos.

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Este trabalho foi financiado pelos amigos da Fundação Sophia (SSWO WAR-63).

Toda a criação e experimentos de zebrafish foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais do Erasmus MC e legislação de bem-estar animal. O uso de larvas de peixe-zebra aos 5 dias após a fertilização se enquadra na categoria de experimentos que não exigem aprovação ética formal, conforme descrito pelos regulamentos holandeses.
1. Obtenção de 5 dias pós-fertilização (dpf) de larvas selvagens e tg(phox2bb:GFP)
<ol><li>Montar a reprodução de zebrafish selvagem e coletar 50 ovos em meio E3 tamponada com HEPES (doravante denominado E3) em uma placa de Petri de 15 cm. Use esses peixes como um controle negativo para a classificação de células ativadas por fluorescência (FACs).</li>
	<li>Montar a reprodução do zebrafish tg(phox2bb:GFP) e coletar aproximadamente 300 ovos em E3 em uma placa de Petri de 15 cm.</li>
	<li>Manter os ovos fertilizados em E3 (máximo de 50 ovos/prato) em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h, em incubadora a 28,5 °C.</li>
	<li>Em 1 dpf, remova os óvulos não fertilizados e deixe os fertilizados se desenvolverem até 5 dpf.</li>
	<li>Selecione larvas tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.</li>
</ol>2. Dissociação de larvas inteiras selvagens
<ol><li>Anestesiar larvas de 5 dpf com 0,016% de tricaína.</li>
	<li>Pique 30 peixes-zebra em pedaços pequenos usando uma lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo 1 mL de solução de tripsina-EDTA 10x.</li>
	<li>Transferir o peixe-zebra picado para um tubo de microcentrífuga com um volume total de 2 mL de solução de tripsina-EDTA 10x e deixar no gelo por 3 h. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta P1000 a cada hora para estimular a dissociação.</li>
</ol>3. Isolamento intestinal
<ol><li>Colocar 6-10 larvas de 5 dpf anestesiadas com Tricaína a 0,016% seguidas, em placa de agarose a 1,8% (0,45 g de agarose em 25 mL de E3), sob microscópio de dissecção</li>
	<li>Coloque um pino de inseto na cabeça do peixe-zebra.</li>
	<li>Remova todo o E3 restante usando um tecido.</li>
	<li>Isole o intestino usando outro pino de inseto, sem perturbar quaisquer outros órgãos. Certifique-se de que a gema é removida (Figura Suplementar S1A).</li>
	<li>Uma vez isolado, inspecione o intestino e remova todo o material não intestinal (por exemplo, pele, gordura, fígado), se necessário.</li>
	<li>Coletar o intestino com uma pinça e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga, contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), sobre gelo. OBS: Um mínimo de 244 intestinos deve ser isolado, mantendo-se o tempo total de dissecção em 3 h. Isso é viável com duas pessoas trabalhando em paralelo.</li>
</ol>4. Dissociação intestinal
<ol><li>Imediatamente após a dissecção de todos os intestinos, centrifugar o tubo de microcentrífuga a toda velocidade (13.800 × g) por 30 s.</li>
	<li>Remova o PBS/10% FCS, mas deixe uma pequena quantidade (~100 μL) para evitar que os intestinos sequem. Adicionar 500 μL de 2,17 mg/mL de papaína em HBSS contendo CaCl2 e MgCl2, para dissociar as células.</li>
	<li>Ativar papaína com 2,5 μL de cisteína (1 M).</li>
	<li>Incubar as vísceras em banho-maria a 37 °C durante 10 min. Pipetar para cima e para baixo na metade do caminho (após 5 min) para estimular a digestão enzimática do tecido.</li>
	<li>Transfira as células para um tubo FACS usando um filtro celular de 35 μm, pré-umedecido com 0,5 mL de PBS/10% FCS.</li>
	<li>Lave o filtro adicionando um total de 2 mL de PBS/FCS a 10% em passos de 0,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 700 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 300 μL de PBS/10% FCS.</li>
	<li>Adicionar 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar as células mortas (1:1.000) e incubar por 5 min para permitir sua exclusão durante a FACS.</li>
</ol>5. Enriquecimento FACS
<ol><li>Use a amostra wildtype para definir as portas da população de células classificadas registrando 3.000 células no citômetro de fluxo (Figura suplementar S1B-E).</li>
	<li>Use um bocal de 100 μm, ajuste a precisão de classificação na pureza e coloque o tubo de coleta contendo 200 μL de PBS/5% FCS, na máquina FACS.</li>
	<li>Carregar a suspensão celular das vísceras e classificar células vivas (DAPI-negativas), unicélulas no tubo de coleta (Figura 2C), excluindo-se duplos (Figura 2B) e células mortas (Figura 2C). NOTA: Para o peixe-zebra tg(phox2bb), a proporção de células GFP+ é verificada apenas para referência, pois todas as células vivas individuais são classificadas.</li>
	<li>Mantenha o tubo de coleta no gelo após a triagem celular.</li>
	<li>Conte a suspensão celular com um hemocitômetro, incluindo uma verificação de viabilidade com azul de tripano. Se a viabilidade for de pelo menos 80%, continue com o próximo passo.</li>
	<li>As células agora estão prontas para processar para scRNAseq (ou seja, plataforma 10x Genomics Chromium). Use aproximadamente 20.000 células por amostra.</li>
</ol>

Processamento de células intestinais de larvas de peixe-zebra para sequenciamento de RNA de célula única

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Aqui, apresentamos um método para isolamento e dissociação do intestino de larvas de 5 dpf de zebrafish usando FACS. Com este método, diferentes tipos celulares intestinais foram coletados e analisados com sucesso por scRNA-seq, utilizando a plataforma 10x Genomics Chromium. Selecionamos a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), pois queríamos uma indicação de que células viáveis do ENS também seriam isoladas (Figura 2D). No entanto, é importante notar que este método pode ser pronta...

O trato gastrointestinal (GI) é um sistema complexo que desempenha um papel vital na saúde geral e bem-estar. É responsável pela digestão e absorção de nutrientes, bem como pela eliminação de resíduos 1,2. O trato gastrointestinal é composto por múltiplos tipos celulares, incluindo células epiteliais, células musculares lisas, células imunes e sistema nervoso entérico (ENS), que se comunicam estreitamente para regular e manter a função intestinal adequada 3,4,5. Defeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal podem ter efeitos de longo alcance em vários aspectos, como absorção de nutrientes, composição da microbiota, eixo intestino-cérebro e ENS, levando a vários distúrbios neuromusculares entéricos, como a doença de Hirschsprung e a pseudo-obstrução intestinal crônica 6,7. Esses distúrbios são caracterizados por dismotilidade intestinal grave causada por alterações em várias células-chave, como as células intersticiais de Cajal, as células musculares lisas e a ENS 6,8,9. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal ainda são pouco compreendidos.
O peixe-zebra é um valioso organismo modelo para estudar o desenvolvimento e a disfunção gastrointestinal devido ao seu rápido desenvolvimento embrionário, transparência durante os estágios embrionário e larval e tratabilidade genética 10,11,12,13,14. Numerosas linhagens transgênicas de zebrafish expressando proteínas fluorescentes estão disponíveis. Um exemplo dessa linhagem é o peixe-zebra tg(phox2bb:GFP), comumente usado para estudar a ENS, pois todas as células phox2bb+, incluindo os neurônios entéricos, são marcadas15,16. Aqui, usando a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), apresentamos um método de isolamento intestinal de larvas 5 dias pós-fertilização (dpf) para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>10x Tripsina (0,5%)-EDTA (0,2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de 5 mL com tampa de filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de Fundo Redondo 5 mL (tubos FACS) tampa de pressão</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina</td> do classificador Olympus SZX16 <td></td><td></td> FACSAria III do microscópio da dissecação de DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542 <td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS com CaCl2 and MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>O inseto fixa</td><td>ferramentas</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaine</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Gato#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento intestinal de larvas de zebrafish para sequenciamento de rna de célula Única

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

O trato gastrointestinal (GI) desempenha uma série de funções essenciais para a vida. Defeitos congênitos que afetam seu desenvolvimento podem levar a distúrbios neuromusculares entéricos, ressaltando a importância da compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal. Neste estudo, apresentamos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias pós-fertilização para obtenção de células vivas viáveis que podem ser usadas para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Este protocolo baseia-se na dissecção manual do intestino do peixe-zebra, seguida de dissociação enzimática com papaína. Posteriormente, as células são submetidas à triagem celular ativada por fluorescência, e células viáveis são coletadas para scRNA-seq. Com esse método, conseguimos identificar com sucesso diferentes tipos de células intestinais, incluindo células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares e imunes, bem como neurônios entéricos e glia. Portanto, consideramos ser um recurso valioso para o estudo da composição do trato gastrointestinal na saúde e na doença, utilizando o peixe-zebra.

Com este protocolo, obtivemos sucesso no isolamento e dissociação de intestinos inteiros de larvas de 5 dpf. Usando papaína como enzima de dissociação, aumentamos significativamente a viabilidade celular, permitindo a captura de 46.139 eventos envolvendo células únicas viáveis (6,4% de todas as células) de 244 intestinos isolados (Figura 2A). Larvas inteiras selvagens foram usadas como controle para garantir que o processo de triagem fosse otimizado, permitindo a identificação e triagem celu...

Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Nossa pesquisa visa investigar as alterações transcriptômicas que ocorrem durante o desenvolvimento e disfunção gastrointestinal em larvas de zebrafish. Aqui, fornecemos um novo protocolo que permite o isolamento de diferentes tipos de células dentro do intestino do peixe-zebra, que tem aplicações potenciais na compreensão da saúde e da doença gastrointestinal. Nos últimos anos, tem havido crescente interesse em explorar a interação entre o sistema nervoso entérico e outros tipos de células intestinais durante o desenvolvimento e a doença.Compreender essas dinâmicas complexas usando técnicas avançadas, como o sequenciamento de RNA de célula única, tem o potencial de revelar insights críticos sobre neuromiopatias entéricas, levando a diagnósticos e tratamentos mais precisos. Usando este protocolo, identificamos com sucesso vários tipos de células intestinais, incluindo epiteliais, estromais, sangue, músculos, células imunes e até neurônios entéricos e glia, que não foram capturados antes nesta quantidade usando abordagens semelhantes. Assim, fornecemos uma técnica confiável para estudar a composição gastrointestinal durante o desenvolvimento e disfunção.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Este vídeo descreve um protocolo para isolar neurônios, macrófagos e microglia de cérebros de larvas de peixe-zebra, interrompendo mecanicamente o tecido cerebral. As populações de células purificadas podem ser usadas para análise genômica.

Isolamento de células cerebrais de larvas de peixe-zebra: uma técnica para obter neurônios, macrófagos e microglia intactos do tecido cerebral do peixe-zebra

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.

De células T isolamento da população Side em Myc induzida por leucemia linfoblástica aguda no peixe-zebra

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

Aqui, apresentamos um método para alinhar e criosseccionar várias amostras de larvas de peixe-zebra (Danio rerio) e coletá-las em uma única lâmina para análise transcriptômica espacial.

Arranjo Espacialmente Compacto de Seções de Larvas de Peixe-Zebra para Análise Transcriptômica Espacial

Aprenda a isolar células intestinais de larvas de zebrafish para sequenciamento de RNA de célula única. Este protocolo permite identificar tipos celulares epiteliais, estromais, sanguíneos, musculares, imunes e gânglios neurais entéricos.

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

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