Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos
29 de setembro de 2023
Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.
Os portadores de solutos, ou SLCs, são responsáveis pela absorção de nutrientes e estão envolvidos em doenças humanas. No entanto, há poucos medicamentos direcionados aos SLCs porque eles são pouco estudados. Desenvolvemos abordagens eficientes para clonar, expressar e purificar SLCs.
Nosso fluxo de trabalho produz proteínas puras, permitindo estudos bioquímicos e estruturais e, finalmente, fornece insights para campanhas de descoberta de medicamentos. Com os inúmeros papéis nos processos biológicos, na doença e na liberação de fármacos, os SLCs têm recebido cada vez mais atenção e se tornado alvos terapêuticos atraentes. Os projetos privados e públicos ReSOLUTE IMI geraram recursos e dados de acesso aberto para permitir novas descobertas na função, fisiologia, patologia e direcionamento terapêutico da SLC.
Tradicionalmente, as SLCs eram difíceis de estudar, pois são proteínas integrais de membrana com vários substratos e diversos mecanismos de transporte. Recentemente, o Cryo-EM, o sistema de expressão BacMam e novos reagentes de solubilização levaram a uma mudança radical em sua caracterização. Amostras de proteína pura são necessárias para estudos bioquímicos e estruturais.
Em seres humanos, os portadores de solutos geralmente têm um baixo rendimento quando superexpressos e instáveis quando purificados. Portanto, no passado, cada meta exigia anos para desenvolver estruturas individuais para produzir a amostra de proteína para aplicações a jusante. Nosso método é otimizado para o estudo paralelo e econômico de múltiplos alvos ou construtos de um único alvo.
Portanto, equilibra flexibilidade experimental, custo, tempo e recursos de laboratório cuidadosamente. Além disso, oferecemos acesso aberto a todos os nossos protocolos e recursos neste artigo e no portal web ReSOLUTE.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se nos transportadores de solutos (SLCs), que são cruciais para a absorção de nutrientes e estão associados a diversas doenças humanas. Os pesquisadores desenvolveram métodos eficientes para clonagem, expressão e purificação dos SLCs, permitindo estudos bioquímicos e estruturais adicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Farmacologia
Contexto
- Os transportadores solutos desempenham um papel fundamental no transporte de nutrientes.
- Estão envolvidos em diversas doenças humanas.
- Apesar da sua importância, poucos medicamentos têm como alvo os SLCs devido à pesquisa limitada.
- Iniciativas recentes têm como objetivo aprimorar a compreensão das funções dos SLCs.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver métodos escalonáveis para o estudo de SLCs humanos.
- Produzir proteínas puras para análise bioquímica e estrutural.
- Facilitar os esforços de descoberta de fármacos direcionados a SLCs.
Métodos Utilizados
- Clonagem de genes otimizados em relação aos códons para SLCs.
- Expressão de proteínas SLC em sistemas apropriados.
- Purificação das proteínas para obtenção de amostras homogêneas.
- Utilização de recursos abertos de projetos IMI para acesso a dados.
Resultados Principais
- Métodos eficientes de clonagem e expressão foram estabelecidos.
- Proteínas SLC de alta pureza foram obtidas para estudos posteriores.
- O estudo fornece informações sobre as funções do SLC e seu potencial terapêutico.
- Os dados gerados apoiam pesquisas em andamento sobre a fisiologia e a patologia do SLC.
Conclusões
- Métodos desenvolvidos aprimoram significativamente o estudo dos SLCs.
- Os conhecimentos obtidos poderiam levar a novas estratégias de descoberta de fármacos.
- Um maior entendimento dos SLCs pode melhorar o direcionamento terapêutico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os transportadores de solutos humanos (SLCs) representam uma grande classe subutilizada de transportadores de membrana com potencial terapêutico significativo, porém sua caracterização estrutural e bioquímica tem ficado para trás devido aos desafios de expressão e purificação. Este fluxo de trabalho de alto rendimento permite a produção paralela e escalonável de proteínas SLC puras e funcionalmente ativas, abordando diretamente um gargalo fundamental na descoberta precoce de fármacos e na validação de alvos. Ao facilitar o acesso a amostras de SLC de alta qualidade, o método apoia a redução de riscos em toda a carteira e acelera a avaliação desses alvos para intervenção farmacêutica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação sistemática da função e especificidade de substrato de transportadores SLC.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao fornecer proteína bioquimicamente ativa e estruturalmente íntegra para testes de hipóteses.
- Facilita a validação de alvos por meio da produção reprodutível de múltiplos construtos SLC em paralelo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece proteínas SLC de alta pureza adequadas para ensaios bioquímicos e de transporte quantitativos.
- Padroniza a quantidade de proteína utilizada em ensaios de triagem em alto rendimento e estudos de interação posteriores.
- Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios ao garantir qualidade e rendimento consistentes das proteínas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite estudos estruturais que elucidam mecanismos de transportadores relevantes para doenças e sua farmacologia.
- Fornece preparações estáveis de proteínas para estudos de ligação e transporte de moléculas pequenas, alinhados ao desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, gerando dados sobre estabilidade e atividade da proteína.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, fornecendo reagentes fundamentais tanto para estudos mecanicistas quanto para campanhas de triagem.
- Biologia da Descoberta: Fornece proteínas SLC de alta qualidade para análise funcional e estrutural orientada por hipóteses.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios robustos e a triagem de compostos com entradas reprodutíveis de proteínas.
- Análises: Fornece resultados quantitativos, como concentração, pureza e monodispersão de proteínas, para comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia a identificação de SLCs relevantes para doenças e sua modulação farmacológica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e reutilizável para avaliação de alvos SLC em múltiplos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos SLC e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Otimiza a produção proteica com protocolos padronizados e de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção e melhora a alocação de capital ao permitir triagem mais precoce de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos SLC para avanço nas etapas de triagem e desenvolvimento pré-clínico.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em expressão, purificação e caracterização analítica de proteínas de membrana.
- Exige acesso a sistemas de expressão eucarióticos, infraestrutura de cromatografia e análises proteicas.
- Beneficia-se de protocolos padronizados e recursos de acesso aberto para reprodutibilidade entre equipes.
- Adaptável a diversos membros da família SLC e designs de construtos, favorecendo ampla aplicabilidade.
- A estabilidade e o rendimento da proteína podem variar conforme o alvo, exigindo otimização do construto e do tampão.
