Injeção de espermátide redonda em camundongo

A injeção redonda de espermátide pode resolver o problema da reprodução em alguns pacientes com azoospermia não obstrutiva, mas sua eficiência é muito baixa. Nosso estudo usou camundongos como modelos para procurar métodos para melhorar a eficiência do desenvolvimento embrionário do ROSI em camundongos. Estatísticas incompletas indicam que menos de 200 fetos humanos concebidos por ROSI nasceram globalmente.

Um ponto de virada na compreensão do potencial da tecnologia ROSI ocorreu em 2015, quando Tanaka e colegas relataram os nascimentos bem-sucedidos de 14 fetos por meio da tecnologia ROSI, incutindo confiança renovada em sua aplicação clínica e viabilidade. O foco atual da pesquisa ROSI está em anormalidades nas modificações epigenéticas e ativação assistida por oócitos anormais, enquanto a identificação precisa de dados de espermatozoides redondos também é um desafio. A eficiência de desenvolvimento de embriões ROSI em camundongos já é muito alta em nosso laboratório, que é semelhante a outros laboratórios.

No entanto, a eficiência de desenvolvimento de não roedores, como humanos, ainda é muito nova. No futuro, vamos nos concentrar na melhoria da eficiência do desenvolvimento de não roedores. Para começar, injete um camundongo fêmea de seis a oito semanas de idade por via intraperitoneal com 7,5 unidades internacionais de gonadotrofina sérica de égua grávida às 17:00 e gonadotrofina coriônica humana 48 horas depois.

Certifique-se de que nenhum contato com camundongos machos ocorra após a injeção. Depois de sacrificar o rato, abra sua cavidade abdominal. Usando uma tesoura, corte as trompas de falópio perto de ambos os ovários e coloque-as em tampão M2 pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Sob a objetiva 10X de um microscópio vertical, localize a parte transparente e ampliada da trompa de Falópio. Em seguida, usando uma seringa de um mililitro, prenda a trompa de Falópio, corte a parte aumentada e colete os complexos do cumulus coronal do oócito. Para remover as células da granulosa, coloque o complexo de oócitos em uma solução operacional M2 pré-aquecida contendo 0,1% de hialuronidase e sopre suavemente através de uma pipeta oral.

Transfira o oócito em série para gotículas KSOMaa para enxaguar três vezes e coloque em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para começar, obtenha um camundongo C57BL / 6 macho de oito a 10 semanas de idade. Abra sua cavidade abdominal e excise suavemente o epidídimo próximo ao testículo com uma tesoura.

Coloque o prato contendo epidídimo em meio M2 sob a objetiva de 10X de um microscópio vertical. E usando uma seringa de um mililitro, excise suavemente o epidídimo para permitir que os espermatozóides fluam. Sifão os espermatozóides em suspensão para o fundo de um tubo contendo 0,5 mililitro de tampão M2.

Para isolamento redondo de espermátide, transfira o testículo dissecado para o tampão M2. Usando uma seringa de um mililitro, corte suavemente a membrana branca sob o microscópio e, em seguida, aperte e excise os túbulos seminíferos complicados. Após a extração da suspensão, filtrar com uma peneira de 400 mesh e centrifugar as células filtradas.

Descarte o sobrenadante e incube as células com 200 microlitros de Hoechst 33342 a 37 graus Celsius por 10 minutos. Coloque o tubo de citometria contendo as células coradas no citômetro de fluxo. Depois de ajustar a tensão, selecione a população de células com base na dispersão direta e lateral.

Em seguida, remova as aderências celulares de acordo com a dispersão direta e a largura do pulso do gatilho. Usando dois canais de detecção sob laser de comprimento de onda de 355 nanômetros, classifique as espermátides redondas e armazene-as a quatro graus Celsius. Ao microscópio, as espermátides redondas de camundongos tinham aproximadamente 10 micrômetros de diâmetro e exibiam uma estrutura nucléolo semelhante a uma protrusão no meio.

Para começar, obtenha oócitos e espermátides redondas de camundongos. Em seguida, prepare as agulhas de retenção e injeção com diâmetros apropriados. Coloque os oócitos em gotículas M2 de 10 microlitros com ou sem citocalasina B para amolecer e armazenar os gametas.

Em seguida, coloque as gotículas redondas de espermátides'M2 e monte a placa de operação na mesa de operação microscópica. Ajuste a posição da injeção e fixe a agulha. Usando polivinilpirrolidona, ou PVP, umedeça e limpe a agulha de injeção.

Em seguida, extraia a espermátide redonda para a agulha de injeção. Gire o oócito com a agulha de retenção para orientar o corpo polar dos oócitos na posição de 12 horas. Em seguida, coloque a agulha de injeção cuidadosamente na posição das três horas no oócito.

Usando um dispositivo PiezoXpert, crie um orifício na zona pelúcida dos oócitos. Em seguida, avance suavemente a agulha de injeção no oócito horizontalmente e rompa a membrana do oócito. Injete gradualmente a espermátide redonda no citoplasma do oócito.

Retire a agulha de injeção e aspire uma pequena quantidade da membrana dos oócitos perto da abertura para selá-la. Para injeção intracitoplasmática de espermatozoides, coloque os espermatozóides em uma pista de PVP. Aspirar os espermatozóides da cauda e posicionar o pescoço na boca da agulha de injeção.

Aplique um piezo para separar a cabeça do esperma da cauda. Em seguida, injete o esperma no oócito conforme demonstrado anteriormente, com uma agulha de injeção com diâmetro de nove a 10 micrômetros. Para ativação assistida de oócitos, coloque os oócitos em gotículas de 20 microlitros de meio CZB livre de cálcio e magnésio contendo cloreto de estrôncio hexahidratado.

Em seguida, transfira-os para o meio de cultura KSOMaa para cultivo. Simultaneamente, estabelecer um grupo para ativação da partenogênese sem injetar espermátides redondas ou espermatozóides para estudos embriológicos. Após a ativação, transfira para o meio de cultura KSOMaa para cultivo.

Embriões redondos injetados com espermátides exibiram eficiência de desenvolvimento reduzida em comparação com os injetados com espermatozóides intracitoplasmáticos.