Name: Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a avaliar a integridade da barreira hematoencefálica em células endoteliais bEnd.3 usando detecção de resistência elétrica transendotelial. Este método não invasivo facilita o rastreamento de fármacos para o sistema nervoso central.

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Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274207 e 82104533), do Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012) e do Projeto de Promoção de Pesquisa Acadêmica Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (XKTD2022013).

NOTA: Células endoteliais derivadas do cérebro de camundongos.3 (bEnd.3) foram inoculadas nas câmaras de uma placa de 24 poços para construir um modelo in vitro simples de BBB sob condições específicas de meio. O TEER das células normais e hipóxicas foi medido pelo medidor TEER (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparação da solução
<ol><li>Preparar o meio de cultura celular DMEM contendo FBS (10%, v/v), 100 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Preparar 100 mM de solução de CoCl2 adicionando 1,30 mg de CoCl2 a 100 μL de solução DMSO. NOTA: Todas as soluções acima foram armazenadas a 4 °C, e a solução-estoque foi diluída de acordo com a concentração desejada antes do uso.</li>
	<li>Preparar solução de hipoclorito de sódio a 5% (v/v) adicionando 2 ml de solução de hipoclorito de sódio a 38 ml de água bidestilada.</li>
</ol>2. Cultura e viabilidade celular
<ol><li>Sementes de 1 mL de células bEnd.3 em placa de cultura (100 mm) contendo meio DMEM na densidade de 1 x 106 células/mL e cultivo a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% CO2. Troque o meio a cada 2 a 3 dias e subculte as células 2x por semana.</li>
	<li>Após bEnd.3 as células crescem até 80 % de confluência, digerir as células com 0,25% de tripsina por 30 s.</li>
	<li>Faça uma suspensão de células bEnd.3 na densidade de 7 x 104 células/mL usando o meio DMEM através de um contador de células. Em seguida, semear 100 μL de suspensão de células bEnd.3 em uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Após a adesão celular, limpar as células com PBS e cultivar as células com 100 μL de meio de cultura ou meio contendo droga (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) por 24 h nas mesmas condições. Depois de remover o meio dentro da placa do poço e limpá-lo com PBS, adicionar 100 μL de solução de CCK-8. NOTA: Não gerar bolhas no poço, o que afetará os valores de densidade óptica (OD).</li>
	<li>Coloque placas de 96 poços a 37 °C e incube por 1 h. Meça a absorbância das placas de 96 poços a 450 nm usando um leitor de microplacas. NOTA: Para evitar diferenças intragrupo, as placas dos poços foram resfriadas à temperatura ambiente antes da detecção.</li>
	<li>Calcular a viabilidade celular induzida por diferentes concentrações de CoCl2 de acordo com a fórmula [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Selecionar a concentração de CoCl2 com uma diferença significativa na redução da viabilidade celular em comparação com o grupo controle para o próximo experimento.</li>
</ol>3. Montagem do modelo
<ol><li>Enxaguar a câmara superior das placas de 24 poços com PBS. NOTA: As células cresceram e se fundiram na parte inferior da câmara superior da placa de 24 poços, e junções apertadas entre as células gradualmente se formaram para desempenhar um papel de barreira. Se as células endoteliais usadas em alguns estudos não forem capazes de formar uma barreira completa nas membranas de PET de forma independente, o revestimento das membranas com solução de colágeno IV é necessário antes da inoculação celular.</li>
	<li>Misture as células bEnd.3 com o meio DMEM para fazer uma suspensão a uma densidade de 5 x 105 células/mL usando um misturador de vórtices. Em seguida, semear 200 μL de suspensão celular bEnd.3 na membrana PET na câmara superior de uma placa de 24 poços (0,33 cm2, tamanho de poro da membrana de 0,4 μm). NOTA: O estudo piloto deste protocolo não encontrou diferença nos resultados ao usar 5 a 10 passagens de células bEnd.3 para experimentos. Para garantir a probabilidade de modelagem bem-sucedida, consulte o intervalo de número de célula deste protocolo.</li>
	<li>Adicionar 1200 μL de meio completo à câmara inferior da placa para garantir que a pressão osmótica das câmaras superior e inferior tenda a estabilizar. Há diferenças no volume de meio adicionado dependendo do tipo; Certifique-se de que o nível de líquido das câmaras superior e inferior esteja nivelado.</li>
	<li>Troque o meio da câmara superior e da câmara inferior em um horário fixo todos os dias e monitore o valor da resistência ao mesmo tempo.<ol><li>Ao mudar o meio, a integridade da camada celular será prejudicada pelo toque artificial ou movimento excessivo. Para evitar a situação acima, remova lentamente o meio antigo de um lado com uma pipeta de pressão negativa e adicione lentamente um novo meio ao longo da parede durante a troca de fluidos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medição do TEER
<ol><li>Antes do início dos trabalhos, coloque o resistor, a solução de hipoclorito de sódio a 5%, o etanol a 75% e a solução de água bidestilada em uma mesa ultralimpa. Ligue a irradiação UV por 30 minutos para eliminar bactérias residuais e patógenos.</li>
	<li>Colocar os eletrodos em solução de hipoclorito de sódio a 5% com agitação lenta por 3 s a 5 s e, em seguida, imergir em etanol 75% por 15 min. Por fim, transfira para PBS ou solução de água bidestilada até o uso.</li>
	<li>Ligue o interruptor na parte traseira do medidor de resistor de célula, clique em Selecionar placa de acordo com os parâmetros na Tabela 1 e selecione Placa de 24 poços.</li>
	<li>De acordo com as necessidades da operação, selecione a sequência de detecção apropriada. Selecionamos o procedimento A1 neste estudo.</li>
	<li>Insira um resistor kΩ no plugue direito para calibrar o instrumento. Se o resultado da calibração for de 1000 ± 5 Ω, considere a precisão do instrumento normal.<ol><li>Se o resultado da calibração não for 1000 Ω, clique em Unidades de Modo na interface principal para selecionar OHMS e, em seguida, clique em Calibrar na tela principal para recalibrar o instrumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Puxe o resistor kΩ do lado direito e substitua o eletrodo de medição por um fio de conexão.</li>
	<li>Coloque o eletrodo na placa de 24 poços sem semear células verticalmente e clique em Manuseio em branco na tela principal do instrumento. O valor de fundo da resistência da placa sem células semeadas é de cerca de 134,4 Ω.</li>
	<li>Insira os dois eletrodos nas câmaras superior e inferior da placa semeada com células para que a camada de células fique entre eles e, em seguida, registre o valor da resistência pisando suavemente no pedal.<ol><li>Certifique-se de que o eletrodo não toque nas células da câmara superior e na parte inferior da câmara inferior. O tempo de embebição do eletrodo na solução não tem efeito sobre o valor da resistência, e é necessário apenas certificar-se de que o eletrodo está na posição correta.</li>
	</ol></li>
	<li>Obter valores TEER (Ωcm2) multiplicando os valores de resistência elétrica (ohms) com a área inferior (cm2) da câmara superior, como na equação: TEER (Ωcm2) = Resistência (Ω)x inserção S (cm2)</li>
	<li>Desenhe um gráfico de linhas de TEER-Time (em dias). Quando o valor da resistência não aumenta mais com o tempo (medido ao longo de dias), considere que a célula formou uma barreira. NOTW: O modelo BBB monocamada de células bEnd.3 será construído com sucesso através da cultura de células bEND.3 com os parâmetros deste estudo por cerca de 6 dias. O TEER do modelo de monocamada celular bEnd.3 variou de 16,49 ± 2,12 Ωcm2 a 27,59 ± 1,50 Ωcm2 em 6 dias (n=8, média ± DP).</li>
</ol>5. Destruição de barreiras e análise estatística
<ol><li>De acordo com a curva TEER - tempo, selecionar os poços com função barreira e dividi-los em grupo controle e grupo CoCl2 (n = 4).</li>
	<li>Adicionar o meio de cultura e o meio de cultura contendo 300 μM de CoCl2 (200 μL) na câmara superior do grupo controle e CoCl2 , respectivamente.</li>
	<li>Detectar os valores de resistência dos grupos controle e CoCl2 em 12 h e 24 h de incubação a 37 °C usando o procedimento descrito na etapa 4.</li>
	<li>Utilizar software comercial para mapear a tendência dos valores TEER da barreira de células cultivadas com ou sem 300 μM de CoCl2.</li>
	<li>Utilizar software de análise estatística para analisar a diferença nos valores de resistência entre células tratadas com CoCl2 e células normais (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).</li>
</ol>

Medição da resistência transendotelial para avaliar a integridade da barreira celular

<ol><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLEC14A+deficiency+exacerbates+neuronal+loss+by+increasing+blood-brain+barrier+permeability+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).</li>
<li>Bagchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+screening+and+permeation+studies%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview.</a> Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).</li>
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<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> J Exp Med. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33(2013).</li>
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<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+model+of+blood-brain+barrier+on+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers.</a> Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+validation+of+the+simplified+in+vitro+3D+Co-culture+based+BBB+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).</li>
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<li>Burkhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+brain+capillary+endothelial+cells+in+primary+culture+with+defined+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 19(2015).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
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<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+alleviates+hypoxia-induced+blood-brain+barrier+injury+via+regulation+of+CLDN5+%28claudin+5%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5).</a> Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA%2FROCK-2+pathway+inhibition+and+tight+junction+protein+upregulation+by+catalpol+suppresses+lipopolysaccaride-induced+disruption+of+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability.</a> Molecules. 23 (9), (2018).</li>
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<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+modeling%3A+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li>
<li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells%3A+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li>
<li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial%2Ftransendothelial+electrical+resistance+%28TEER%29+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Blood-Brain+Barrier%22%5BJournal%5D)">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li>
<li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+%28BBB%29+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+Rep%22%5BJournal%5D)">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).</li>
<li>Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1%2C+P-gp%2C+SLC7A5+and+TFRC%2C+while+maintaining+barrier+integrity%2C+in+brain+capillary+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um dos órgãos corporais mais desenvolvidos, o cérebro controla uma ampla gama de processos fisiológicos intrincados, incluindo memória, cognição, audição, olfato e movimento27. O cérebro é um dos órgãos mais complicados e doentes do corpo humano ao mesmo tempo. A ocorrência de muitas doenças do sistema nervoso central apresenta tendência crescente ano após ano devido a fatores como poluição do ar, padrões alimentares irregulares e outros fatores 27,28,29.<sup cla...

A BHE é uma interface biológica única entre a circulação sanguínea e o tecido nervoso, que é composto por células endoteliais vasculares, pericitos, astrócitos, neurônios e outras estruturas celulares1. O fluxo de íons, produtos químicos e células entre o sangue e o cérebro é estritamente regulado por essa barreira. Essa homeostase protege os tecidos nervosos contra toxinas e patógenos, além de permitir o funcionamento adequado dos nervos cerebrais 2,3. A manutenção da integridade da BHE pode efetivamente prevenir o desenvolvimento e a progressão de distúrbios que afetam o sistema nervoso central, como disfunção neuronal, edema e neuroinflamação4. No entanto, as propriedades fisiológicas únicas da BHE impedem que mais de 98% dos medicamentos de pequenas moléculas e 100% dos fármacos macromoleculares entrem no sistema nervoso central5. Portanto, aumentar a penetração de medicamentos através da BHE durante o desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central é essencial para alcançar a eficácia terapêutica 6,7. Embora a triagem de substratos por simulação computacional tenha aumentado significativamente a probabilidade de candidatos a fármacos cruzarem o BBB, modelos de BBB confiáveis e acessíveis in vitro/in vivo ainda são necessários para atender às necessidades da pesquisa científica8.
Uma técnica rápida e acessível para triagem de fármacos em alto rendimento é o modelo in vitro 9. Para lançar luz sobre os processos fundamentais dos efeitos dos medicamentos na função BBB e sua participação no desenvolvimento e progressão da doença, uma série de modelos simplificados in vitro de BBB foi criada. Atualmente, os modelos de BHE in vitro comuns são os modelos monocamada, co-cultura, dinâmico e microfluídico 10,11,12, construídos por células endoteliais vasculares e astrócitos, pericitos ou micróglia 13,14. Embora as culturas de células 3D estejam mais alinhadas com a estrutura fisiológica do BBB15, sua aplicação como meio de triagem de drogas para BBB ainda é limitada por seu design intrincado e reprodutibilidade inferior. Em contraste, o modelo in vitro de monocamada é o mais frequentemente utilizado para pesquisar a BBB e é aplicável para determinar a expressão de transportadores de membrana e proteínas de junção apertada em células específicas.
A medição da resistência elétrica transmembrana (TEER) é uma técnica para avaliar e monitorar a camada de células através da resistência e avaliar a integridade celular e a permeabilidade da barreira. Inserindo-se simultaneamente dois eletrodos no meio de crescimento ou solução tampão de cada lado da monocamada, é possível medir a corrente alternada ou a impedância elétrica através da camada compacta da célula 16,17. Para determinar se o modelo de BBB in vitro foi adequadamente criado, a mensuração do TEER será usualmente empregada como padrão-ouro18. Por outro lado, a tendência da ação do medicamento sobre a permeabilidade da BHE pode ser predita com precisão medindo-se a mudança na resistência elétrica da camada celular após o envolvimento da droga19. Por exemplo, Feng e col. descobriram que o catalpol (o monômero ativo primário de rehmanniae) poderia efetivamente reverter a regulação negativa induzida por lipopolissacarídeo de proteínas de junção apertada no BBB e aumentar o valor TEER da camada de células endoteliais cerebrais de camundongos20.
A resposta neuroinflamatória costuma ser a principal causa de desequilíbrio da homeostase BBB21. O tratamento hipóxico para induzir lesão neuroinflamatória é o principal método para destruir a barreira hematoencefálica, incluindo principalmente métodos físicos e métodos de reagentes químicos. A primeira utiliza primariamente uma incubadora de três gases para variar o conteúdo de oxigênio no ambiente de crescimento celular para simular condições hipóxicas22, enquanto a segunda é obtida pela introdução artificial de reagentes desoxi como a CoCl2 no meio de cultura celular23. As células permanecerão em uma condição desoxigenada se Fe2+ for substituído por Co2+ no heme. Se o Fe2+ for substituído por Co2+ no grupo catalítico, a atividade da prolina hidroxilase e do aspartato hidroxilase será inibida, resultando em um acúmulo do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α)24. Sob hipóxia persistente, a desfosforilação do HIF-1α no citoplasma desencadeia a morte celular e ativa o fator de crescimento endotelial vascular, o que, em última instância, eleva a permeabilidade vascular. Em estudos prévios25,26, foi bem demonstrado que a hipóxia pode reduzir significativamente a expressão de proteínas de tight junction endotelial para aumentar a permeabilidade da BHE. Neste estudo, a curva de resistência temporal de células bEnd.3 semeadas em placas de 24 poços foi medida para criar um modelo de BBB simples. Usando este modelo, caracterizamos as mudanças na célula TEER após a intervenção com CoCl2, a fim de construir um modelo celular que possa ser usado para rastrear drogas para proteção BBB.

<table><tbody><tr><td>Placa transwell de 24 poços</td><td>Corning (Corning 3470, 0,33 cm2, 0,4 &micro; m)</td><td>10522023</td><td></td></tr><tr><td>75 % de etanol</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2023052901</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>220412-078-B</td><td></td></tr><tr><td>bEnd.3 células</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0049</td><td></td></tr><tr><td>Kit de contagem de células-8 (CCK-8)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>BG0025</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto (CoCl2)</td><td>Sigma</td><td>15862</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>meio de águia modificado de Dulbecco (1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td>GraphPad Software</td><td>9.0.0(121)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Contém colágeno IV)</td><td>MedChemexpress</td><td>HY-K6002</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS, 1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>hipoclorito de sódio</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2022091501</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de resistência transmembrana</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>VOM3 (versão 1.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

registro da integridade funcional da barreira em bend.3 células endoteliais vasculares via detecção de resistência elétrica transendotelial

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura fisiológica dinâmica composta por células endoteliais microvasculares, astrócitos e pericitos. Ao coordenar a interação entre o trânsito restrito de substâncias nocivas, a absorção de nutrientes e a depuração de metabólitos no cérebro, a BHE é essencial na preservação da homeostase do sistema nervoso central. A construção de modelos in vitro do BBB é uma ferramenta valiosa para explorar a fisiopatologia de distúrbios neurológicos e criar tratamentos farmacológicos. Este estudo descreve um procedimento para criar um modelo in vitro de células BBB monocamada por semeadura de células bEnd.3 na câmara superior de uma placa de 24 poços. Para avaliar a integridade da função de barreira celular, o voltímetro de células epiteliais convencional foi usado para registrar a resistência elétrica transmembrana de células normais e hipóxicas induzidas por CoCl2 em tempo real. Antecipamos que os experimentos acima fornecerão ideias eficazes para a criação de modelos in vitro de BBB e drogas para tratar distúrbios de doenças do sistema nervoso central.

Este protocolo permitiu o registro das mudanças nos valores de resistência das células de acordo com os parâmetros estabelecidos no resistor transendotelial. A viabilidade de células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas com diferentes concentrações de CoCl2 foi avaliada pelo ensaio CCK-8. O maior dano celular produzido pela CoCl2 foi representado pela menor viabilidade celular. Verificamos que 300 μM de CoCl2 foi significativamente citotóxico in vitro, e essa concentração fo...

Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Os estudos atuais normalmente usam testes de permeabilidade e expressão de proteínas associadas para verificar a precisão da detecção de TEER. O modelo BBB de células monocamadas, em virtude, é menos eficaz para a triagem de drogas, e o uso de mais células dificulta a construção do modelo. O protocolo deste estudo é relativamente simples, pois o procedimento não invasivo permite que as amostras celulares sejam utilizadas em outros experimentos após a detecção do TEA.A detecção de TEER para avaliar a permeabilidade de modelos celulares pode acelerar a triagem de drogas para tratamento e prevenção do sistema nervoso central para aumentar a taxa de sucesso do desenvolvimento de novas drogas. No futuro, detectaremos a expressão da proteína tight junction em células do compartimento superior da parede torácica para verificar se os resultados do teste TEER podem representar efetivamente a integridade da função da barreira BBB.

barrier-functional-integrity-recording-on-bend3-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resistência elétrica transendotelial (TEER) em células endoteliais microvasculares do cérebro de camundongos in vitro. Um valor TEER alto indica junções de células endoteliais intactas, enquanto a adição de células T ativadas reduz o valor TEER, refletindo a ruptura da barreira juncional.

Avaliação da resistência elétrica transendotelial em um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

O transistor Electrochemical orgânica é integrado com células vivas e utilizado para monitorizar o fluxo de iões através da barreira epitelial gastrointestinal. Neste estudo, um aumento no fluxo de iões, relacionada com a ruptura das junções apertadas, induzida pela presença de EGTA quelante de cálcio (ácido etileno glicol-bis (éter de beta-aminoetilo)-N, N, N ', N'-tetra-acético ácido), é medida.

Sensoriamento de Barreira rompimento do tecido com um transistor Eletroquímica Orgânica

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Esta publicação descreve a fabricação de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para a quantificação directa dos transendothelial de resistência elétrica (TEER). Para validação, a barreira hemato - encefálica foi imitada dentro deste dispositivo microfluidic e sua função de barreira foi monitorizada. Os métodos apresentados para integração de eletrodo e quantificação de TEER direta são geralmente aplicáveis.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.

Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

Aqui demonstramos a técnica de uso de biossensores baseados em impedância: ECIS e cellZscope, para medir a força da barreira endotelial cerebral. Detalhamos a preparação e a técnica de adição de vários estímulos a um modelo in vitro do endotélio cerebral. Medimos, registramos e fornecemos uma análise representativa dos resultados.

Medindo mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral com dois biossensores baseados em impedância em resposta a células cancerígenas e citocinas

Nós apresentamos um método de coleta de sinais eletrocorticográfica para fins de pesquisa de seres humanos que são submetidos a monitorização invasiva epilepsia. Nós mostramos como usar a plataforma de software BCI2000 para coleta de dados, processamento de sinal e apresentação do estímulo. Especificamente, nós demonstramos Sigfried, uma ferramenta BCI2000 baseado em tempo real de mapeamento cerebral funcional.

Gravação Humanos eletrocorticográfica (ECOG) Sinais para pesquisa neurocientífica e mapeamento em tempo real Funcional Cortical

Aprenda a avaliar a integridade da barreira hematoencefálica em células endoteliais bEnd.3 usando detecção de resistência elétrica transendotelial. Este método não invasivo facilita o rastreamento de fármacos para o sistema nervoso central.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial (Vídeo) | JoVE Journal

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

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