Limpeza óptica e marcação para microscopia de fluorescência de folha de luz em imagens cerebrais humanas em larga escala
26 de janeiro de 2024
O presente protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para limpeza óptica rápida e simultânea, marcação multi-redonda e reconstrução volumétrica 3D de dezenas de cortes cerebrais humanos post-mortem, combinando a técnica de transformação de tecido curto (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) com imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz em um protocolo de alto rendimento de rotina.
O cérebro humano é um órgão complexo que abrange diferentes habilidades. Para entender sua funcionalidade, é essencial construir sensores celulares detalhados em todo o cérebro. Nosso protocolo de alto rendimento permite a análise da citoarquitetura 3D de áreas volumétricas do cérebro humano com resolução micrométrica, possibilitando sua caracterização estrutural.
A reconstrução volumétrica de grandes áreas do cérebro humano apresenta vários desafios experimentais ligados às dimensões maciças das amostras cerebrais, à complexa composição biológica, às variáveis condições de fixação e armazenamento post-mortem e aos sinais autofluorescentes dos pigmentos do tipo lipofuscina. Tudo isso pode comprometer a eficiência da limpeza óptica e a demonstração de qualidade. Em comparação com outras técnicas de clareamento, o método de transformação de tecido curto combinado com imagens de microscopia de folha de luz pode ser usado para processamento rápido e simultâneo de várias seções cerebrais humanas.
Estes resultam em reconstrução cerebral 3D com uma resolução subcelular.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo de alto rendimento para clareamento óptico simultâneo, marcação em múltiplas rodadas e reconstrução volumétrica tridimensional de seções cerebrais humanas post-mortem. Ao integrar a técnica S WITCH - H 2 O 2 - Recuperação de Antígeno - 2,2'-tiodietanol (TDE) CURTA com microscopia de fluorescência por folha de luz, a metodologia permite a caracterização estrutural detalhada com resolução micrométrica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Histologia
- Imunohistoquímica
Antecedentes
- O cérebro humano é um órgão complexo que exige exames intrincados em diferentes escalas.
- Os desafios incluem lidar com amostras cerebrais grandes e sinais de autofluorescência provenientes de pigmentos.
- O protocolo apresentado aborda as limitações das técnicas de clareamento existentes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simplificado para analisar a estrutura do cérebro humano.
- Aprimorar a eficiência da clareza óptica e a qualidade de imagem de seções de tecido cerebral.
- Permitir a reconstrução tridimensional com alto nível de detalhe e confiabilidade.
Métodos Utilizados
- O estudo emprega microscopia de fluorescência por folha de luz.
- O tecido cerebral humano é usado como modelo biológico, com etapas detalhadas de seccionamento e processamento descritas.
- As etapas principais incluem a inclusão de amostras em agarose, processamento com TDE e imunomarcação múltipla para diversos marcadores neuronais.
- Os tempos e temperaturas de incubação são definidos com precisão para garantir condições ideais de clareamento e imageamento.
Resultados Principais
- O protocolo leva à clareamento óptico eficaz e à obtenção de imagens de alta qualidade da substância cinzenta e branca.
- A coloração múltipla permite a visualização de populações neuronais distintas em seções cerebrais humanas.
- O método demonstra a capacidade de capturar detalhes subcelulares em reconstruções tridimensionais.
Conclusões
- Este estudo estabelece um método para análise abrangente da estrutura cerebral com resolução micrométrica.
- A abordagem destaca o potencial para avançar nosso entendimento da arquitetura cerebral e suas implicações para estudos neuronais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem 3D de tecido cerebral humano em larga escala e alta resolução é essencial para o avanço da validação de alvos e da compreensão mecanicista na pesquisa e desenvolvimento neurofarmacêutico&D. O protocolo SHORT, combinado com microscopia de fluorescência por folha de luz, permite a obtenção rápida de mapas estruturais multiplexados de subpopulações neuronais tanto na substância cinzenta quanto na branca. Essa capacidade apoia a confiança preditiva e a redução de riscos em estágios iniciais de descoberta e pontos de inflexão translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação detalhada da arquitetura neuronal e o mapeamento de subpopulações para validação de alvos.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao revelar o contexto citotectônico em tecido cerebral humano.
- Facilita a triagem de portfólios ao fornecer dados estruturais quantitativos de alto conteúdo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara seções de tecido multirotuladas e transparentizadas, adequadas para fluxos de trabalho quantitativos de imagem avançados.
- Padroniza o processamento de amostras para obtenção de imagens e análises reprodutíveis e de alto rendimento.
- Permite a detecção multiplex de marcadores neuronais, apoiando o desenvolvimento robusto de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha saídas de imagens estruturais com a arquitetura cerebral humana relevante para a doença.
- Proporciona continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo análise direta de tecido humano.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com dados abrangentes de citarquitetura 3D.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a imagem quantitativa de alto rendimento de seções cerebrais humanas para validação de alvos e estudos mecanicistas.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio do mapeamento neuronal detalhado.
- Triagem: Fornece amostras prontas para imagem multiplexada e reproduzível para análise quantitativa.
- Análise: Oferece dados com resolução subcelular e múltiplos canais para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e trabalhos pré-clínicos com relevância direta para tecidos humanos.
- Reutilização em Escala: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalável para uso repetido em programas neurobiológicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurobiológicos.
- Valor Operacional: Oferece processamento e imagem de tecidos padronizados, escalonáveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos neurofarmacêuticos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em processamento de tecidos, imunomarcação e microscopia avançada.
- Exige acesso à microscopia de folha de luz com fluorescência e infraestrutura de imagem multicanal.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras e aquisição de imagens.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes regiões cerebrais ou condições dos tecidos.
- Os parâmetros de manipulação e incubação das amostras devem ser rigorosamente controlados para obter resultados ideais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
