Name: Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprenda a capturar a agitação citoesquelética do núcleo em ovócitos de camundongo usando técnicas avançadas de imagem. Este método permite estudar a transmissão de forças mecânicas e a dinâmica do RNA nuclear em biologia reprodutiva.

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A.A.J. e M.A. co-escreveram o manuscrito e todos os coautores comentaram sobre o manuscrito. M. A. é apoiado pelo CNRS e "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. é apoiado pela Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel e Fondation du Collège de France.

Impacto do citoesqueleto na forma nuclear e na dinâmica do condensado em oócitos de camundongos

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

As principais etapas desse protocolo incluem a microinjeção adequada de ovócitos sem afetar sua sobrevivência ou função normal 9,10,11, bem como a microinjeção de quantidades pré-definidas de cRNA que permitiriam a visualização correta de estruturas relevantes, como manchas nucleares.
Estabelecer a ligação entre a dinâmica citoplasmática e a dinâmica (intra)-nuclear é essencial quando se estuda como o citoesqueleto agita o núcleo ou seu interior. Este protocolo, com pequenas modificações, permite correlacionar as intensidades de agitação citoplasmática com a dinâmica nuclear das gotículas de YFP-Rango ou SRSF2-GFP (como em11). Para prosseguir, os ovócitos devem primeiro ser filmados por 120 s no modo de campo claro para capturar agitação citoplasmática, antes de serem imediatamente filmados por 120 s com um laser de 491 nm para capturar o contorno nuclear ou a dinâmica das gotículas. No caso de gotículas nucleares SRSF2-GFP, a correlação pode ser simplesmente avaliada comparando-se seus coeficientes de difusão efetivos (ver etapa 7 neste protocolo) com os valores de intensidade máxima invertida de agitação citoplasmática obtidos usando análises de correlação de imagem (ver etapa 4 neste protocolo). Outro ponto importante é o tamanho dos condensados escolhidos para análises das flutuações da superfície das gotículas. Gotículas de diâmetro semelhante devem ser selecionadas para análises comparativas para evitar viés, pois o tamanho modula a intensidade das flutuações da superfície.
Existem algumas limitações para este protocolo. As análises das flutuações do contorno nuclear dependem de colorações intranucleares completas, como YFP-Rango ou NLS-GFP. Para análises em manchas nucleares, a microinjeção de quantidades excessivas de cRNA SRSF2-GFP pode levar a alterações aparentes nas propriedades de separação de fases desse marcador de condensado (Figura 3C), como previamente revisado por outros26. Verificar-se se os perfis de expressão proteica exógena são comparáveis aos endógenos é, portanto, fundamental. Além disso, gotículas relativamente pequenas (raio de <2 μm) devem ser excluídas dos pipelines de análise de flutuação superficial devido a limitações de resolução espacial com as ferramentas aqui definidas. Esse problema de resolução geralmente pode ser resolvido com o uso de microscópios mais resolutivos que, por exemplo, poderiam ser necessários para sondar flutuações superficiais de condensados menores no núcleo do ovócito ou no núcleo significativamente menor das células somáticas.
Em geral, este protocolo permite a captura da agitação baseada no citoesqueleto de actina e microtúbulos do núcleo do ovócito de camundongo através de escamas. Especificamente, permite a documentação da mobilização do citoplasma baseada no citoesqueleto, flutuações do contorno nuclear, juntamente com deslocamentos de pontilhados nucleares semelhantes a líquidos e flutuações de superfície. Embora alguns estudos em outros tipos celulares abordem algumas dessas questões 38,39,40 por meio de protocolos distintos de complexidade variável em escalas espaciais individuais, este protocolo simples fornece as ferramentas necessárias para abordar a dinâmica celular mencionada em múltiplas escalas em um único pipeline de trabalho pela primeira vez. Além disso, os dados gerados a partir dessa abordagem, quando complementados com modelagem biofísica como em10,11, permitem uma avaliação minimamente invasiva de: i) alterações na mecânica nuclear10; ii) a transmissão de forças ativas baseadas no citoesqueleto no citoplasma para condensados no núcleo11; e iii) a dissipação dessa energia ativa pelos diferentes compartimentos celulares10,11. É importante ressaltar que esse protocolo é versátil, pois pode ser adaptado não apenas a outros condensados nucleares, como o nucléolo23, mas também a outros tipos celulares, como as células cancerosas, onde mudanças no comportamento do citoesqueleto e do condensado nuclear foram documentadas 17,41.

O posicionamento nuclear é essencial para múltiplas funções celulares e de desenvolvimento 1,2,3,4,5. As células germinativas femininas de mamíferos denominadas ovócitos remodelam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, apesar de sofrerem uma divisão assimétrica no tamanho, que depende da descentralização cromossômica6 (Figura 1). Essa centralização do núcleo prediz o sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos 7,8 e, portanto, seu potencial embriogênico (Figura 1).
O remodelamento citoplasmático em ovócitos de camundongos é conduzido principalmente pelo citoesqueleto da actomiosina9(Figura 2). Sua atividade gera forças mecânicas que agitam, reposicionam e penetram no núcleo10 (Figura 2). Consequentemente, essa transmissão de força citoplasmática para nucleoplasmática sintoniza a dinâmica das organelas processadoras de RNA mensageiro nuclear denominadas speckles nucleares11, uma das várias organelas sem membrana no núcleo conhecidas como condensados biomoleculares 12,13,14,15,16 (Figura 2).
A imagem ao vivo tem sido decisiva para decifrar as implicações funcionais da agitação nuclear. Filmes de migração nuclear ao longo de horas, bem como filmes de alta resolução temporal da tela de actina e do citoplasma em massa, contribuíram em grande parte para a elaboração de um modelo teórico de posicionamento nuclear, relacionando diferentes escalas detempo9. Além disso, filmes de alta resolução temporal do citoplasma, contorno nuclear e componentes nucleares, como cromatina e condensados nucleares, destacaram o papel da agitação do núcleo baseada no citoesqueleto no processamento de RNA e expressão gênica em ovócitos de camundongos, fazendo a ponte entre diferentes escalas espaço-temporais dentro dacélula10,11. Em conjunto, essa abordagem de cruzamento de escalas baseada em imagens ao vivo forneceu o primeiro raciocínio ligando a agitação do citoesqueleto do núcleo ao sucesso do desenvolvimento dos ovócitos.
O protocolo fornece o pipeline de análise de imagens e imagens usado para estudar a transmissão de forças citoplasmáticas (geradas principalmente por F-actina e em parte por microtúbulos) para o núcleo e seus componentes internos em ovócitos de camundongos. O resultado desses experimentos é capturar o contínuo de forças em escalas espaciais, desde o citoesqueleto no citoplasma até o interior nuclear, por meio de filmes de alta resolução temporal, como mostrado em dois estudos recentes10,11, que estabeleceram a ligação entre movimentos ativos citoplasmáticos, flutuações do contorno nuclear, bem como flutuações de movimento e superfície de um único tipo de condensados biomoleculares nucleares: manchas nucleares. A mesma abordagem pode ser aplicada a outros sistemas modelo onde se espera que as forças citoplasmáticas mudem, como no contexto de células cancerosasmalignas17.

<table><tbody><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td>Disco giratório <td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMI6000B microscópio&nbsp;</td>Microinjetor <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roda de filtro</td><td>Sutter Instruments Software Metamorph</td> FD35-100 da Roper Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodish</td><td>World Precision Instruments</td><td></td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Imagem Universal,&nbsp;</td><td></td><td>versão 7.7.9.0</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&nbsp;</td><td>Camundongos Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OF1 e C57BL/6&nbsp;</td>Kit de Rejeito Poly(A) <td>da Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>Câmera CCD <td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 3&nbsp;</td><td>Kit QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SC35 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab11826</td><td>Anticorpo de mancha nuclear; camundongo IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)</td></tr><tr><td>SRSF2-GFP plasmídeo&nbsp;</td><td>&nbsp; OriGene Technologies</td><td>MG202528</td><td>NM_011358</td></tr><tr><td>Micropipeta Stripper</td><td>&nbsp; XLAB Solutions</td><td></td><td>especializada para coleta de oócitos</td></tr><tr><td>T3 mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1384&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage mMachine&nbsp;</td>Câmara termostática <td>Thermo Fisher</td><td>AM13344</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Serviço de</td><td></td><td></td>Imagem de Vida</tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

Um grande desafio na compreensão das causas da infertilidade feminina é elucidar os mecanismos que regem o desenvolvimento das células germinativas femininas, denominadas ovócitos. Seu desenvolvimento é marcado pelo crescimento celular e subsequentes divisões, duas fases críticas que preparam o ovócito para a fusão com os espermatozoides para iniciar a embriogênese. Durante o crescimento, os ovócitos reorganizam seu citoplasma para posicionar o núcleo no centro celular, um evento preditivo do sucesso do desenvolvimento oocitário em camundongos e humanos e, portanto, de seu potencial embriogênico. Em ovócitos de camundongos, essa reorganização citoplasmática mostrou-se impulsionada pelo citoesqueleto, cuja atividade gera forças mecânicas que agitam, reposicionam e penetram no núcleo. Consequentemente, essa transmissão de força citoplasmática para nucleoplasmática sintoniza a dinâmica de organelas de processamento de RNA nuclear conhecidas como condensados biomoleculares. Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar, com alta resolução temporal, o impacto do citoesqueleto no núcleo através de escalas espaciais em ovócitos de camundongos. Detalha as etapas e ferramentas de análise de imagem e imagem necessárias para avaliar i) atividade citoesquelética no citoplasma do oócito, ii) agitação do núcleo do oócito baseada no citoesqueleto e iii) seus efeitos na dinâmica do condensado biomolecular no nucleoplasma do oócito. Além da biologia oocitária, os métodos aqui elaborados podem ser adaptados para uso em células somáticas para abordar similarmente a sintonia baseada no citoesqueleto da dinâmica nuclear em escalas.

Os painéis de imagem na Figura 3 mostram exemplos de um ovócito típico totalmente crescido (Figura 3A), o nucleoplasma em um ovócito totalmente crescido expressando YFP-Rango (Figura 3B), o nucleoplasma em um ovócito totalmente crescido expressando um correto (painel esquerdo; Figura 3C) ou um excessivo (painel direito; Figura 3C) dose de cRNA SRSF2-GFP e imunomarcação de manchas nucleares em um ovócito completamente crescido usando o anticorpo SC35 (Figura 3D). A dose correta de cRNA de SRSF2-GFP para microinjeção foi definida com base em comparações visuais entre perfis de expressão de SRSF2-GFP com perfis endógenos de manchas nucleares.
As forças de agitação citoplasmática em ovócitos, como mostrado por trabalhos anteriores do laboratório usando mapas vetoriais STICS e análise de correlação de imagens (ver9 e11), podem ser diminuídas por perturbações do citoesqueleto, tanto genéticas (por exemplo, camundongos mutantes FMN2) quanto químicas (por exemplo, Citocalasina D). Mapas STICS de ovócitos controle exibem numerosos vetores, com cores indicando altas velocidades de fluxo, enquanto mapas de ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas exibem menos vetores, com cores indicando baixas velocidades de fluxo. Da mesma forma, a correlação de imagem é perdida muito rapidamente em ovócitos de controle em comparação com ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas. Isso é observável em curvas de correlação, com uma diminuição mais rápida da curva para ovócitos de controle em comparação com ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas9 ou um aumento mais rápido quando a curva é invertida11.
As forças do citoesqueleto agitam o núcleo e suas organelas internas, em particular os condensados nucleares como manchas nucleares10,11. Na Figura 4A, o núcleo dos ovócitos controle está sujeito a importantes flutuações periféricas, o que é visível com o uso da sonda nuclear YFP-Rango. A forma do núcleo em ovócitos com forças citoesqueléticas interrompidas é estável ao longo do tempo (Figura 4C). A análise das flutuações do contorno nuclear é a chave para quantificar precisamente a agitação. Determinando-se a variância da distância do centroide do núcleo à sua periferia, (r-R)2 (Figura 4B), foi possível quantificar as flutuações, mostrando que a agitação nuclear é 6 vezes maior nos ovócitos de controle do que nos ovócitos com forças do citoesqueleto rompidas10. Na Figura 5A-B, manchas nucleares (gotículas SRSF2-GFP+) são mostradas em contextos de controle e ruptura de forças citoplasmáticas em alta resolução temporal. Nos controles, a superfície da gota flutua significativamente mais do que a superfície da gota em ovócitos com forças citoplasmáticas interrompidas, que podem ser visualizadas e quantificadas usando o plugin Radioak32. Visualmente, as cores verde e vermelho (saída Radioak vista nas imagens inferiores da Figura 5A-B) indicam ângulos onde o plugin detectou mudanças de superfície entre imagens consecutivas e o branco indica uma falta de mudanças de superfície.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração da oogênese tardia de camundongos e embriogênese precoce. Ilustração da centralização do núcleo que ocorre no crescimento tardio do ovócito, da descentralização do cromossomo que ocorre durante a divisão do ovócito e dos passos iniciais (estágios de 1 e 2 células) da embriogênese. Os genomas femininos (núcleo do ovócito e pró-núcleo feminino) estão em rosa, o pró-núcleo masculino está em azul. Os núcleos embrionários (após fusão dos genomas parentais) são roxos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig02.jpg"> Figura 2: Ilustração do remodelamento citoplasmático e nuclear através de escamas em ovócitos de camundongos em crescimento. Esta figura resume os principais achados de 9,10,11. Ilustração da remodelação baseada em actomiosina do citoplasma, agitação nuclear e remodelamento funcional do condensado biomolecular nuclear em escalas espaço-temporais. O remodelamento cruzado em escala de speckles nucleares aumenta as reações biomoleculares associadas à sua função (i.e., splicing de pré-mRNA). Vale ressaltar que este protocolo permite a avaliação da agitação nuclear apenas em escalas espaciais, mas não temporais, uma vez que todas as imagens são feitas com a mesma resolução temporal de 0,5 s entre os quadros das imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig03.jpg"> Figura 3: Imagens de amostra do ovócito totalmente crescido e do nucleoplasma. (A) Imagem de campo claro de um ovócito totalmente crescido mostrando cromatina (ciano) que circunda o nucléolo. Um círculo branco pontilhado delineia o núcleo. (B) Núcleo de ovócitos vivos expressando YFP-Rango; notar a ausência de fluorescência no nucléolo. (C) Exemplo de núcleo de oócito vivo expressando SRSF2-GFP após microinjeção de doses corretas de cRNA (painel esquerdo) ou altas doses de cRNA (painel direito); Observe as fases condensada (gotícula) e dissolvida à esquerda e sua ausência na condição à direita. (D) Imunomarcação nuclear speckle em ovócito fixo; observe o perfil de expressão endógeno comparável ao de C (painel esquerdo). Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig04.jpg"> Figura 4: Saídas de plug-in de controle e flutuações de contorno nuclear interrompidas. (A) Time-lapse de um núcleo de ovócito de controle expressando YFP-Rango (acima) e sua máscara binária correspondente gerada pelo plugin Ovocyte_nucleus (abaixo). (B) Princípio das medições das flutuações do contorno nuclear ao longo do tempo e em uma determinada direção. As direções são definidas por um ângulo giratório θ de 1° incremento de 0° a 360°. Duas formas representativas em t=0 s (amarelo) e t=135 s (roxo) são representadas. A forma azul corresponde à forma média ao longo do tempo. (C) Flutuações do contorno nuclear de um núcleo em um ovócito com forças citoesqueléticas diminuídas devido à ruptura de F-actina (camundongo mutante FMN2) e microtúbulos (tratamento com nocodazol; como em10). Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig05.jpg"> Figura 5: Saídas de plug-in de controle e flutuações de superfície de gotículas interrompidas. (A) Colheita de uma gota nuclear SRSF2-GFP de controle fotografada a 500 ms por quadro e mostrada na Ice Look Up Table (LUT) (parte superior); máscara binária da mesma gota gerada por Fiji (centro); e saídas do plugin Radioak após análise das flutuações da superfície da gota (parte inferior), com verde e vermelho indicando ângulos onde o plugin detectou mudanças de superfície entre imagens consecutivas e branco indicando uma falta de mudanças de superfície. (B) Flutuações superficiais de uma gotícula nuclear em ovócitos com diminuição das forças citoesqueléticas devido à ruptura tanto da F-actina quanto dos microtúbulos (como em11). Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar 1: Exemplo de saída de análise de plug-in Ovocyte_nucleus. O mesmo núcleo analisado como o mostrado na Figura 4A. Theta (θ) é o ângulo em graus e t1 a t600 correspondem ao número do quadro, que pode ser convertido no tempo. Os raios estão em μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%201_Ovocyte_nucleus%20output%20example.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Planilha de amostra usada para calcular flutuações do contorno nuclear. O mesmo núcleo analisado como o mostrado na Figura 4A. Theta (θ) é o ângulo em graus e t1 a t600 correspondem ao número do quadro, que pode ser convertido no tempo. Tab Raw e média: Os raios estão em μm. Tab r-R: As distâncias r-R estão em μm. Tabela (r-R)2: Os valores de flutuação estão em μm2. As guias x e y correspondem às coordenadas cartesianas dos raios da guia Bruto e médio. Eles permitem desenhar a forma média do núcleo ao longo do tempo na guia de forma média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%202_Nuclear%20outline%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 3: Exemplo de saída de análise de plug-in Radioak. A mesma gota analisada como a mostrada na Figura 5A. Os raios medidos em momentos e ângulos distintos são mostrados. Os raios estão em μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%203_%20Radioak%20output%20example.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 4: Planilha de amostra usada para calcular flutuações na superfície de gotículas nucleares. A mesma gota analisada como a mostrada na Figura 5A. Theta (θ) é o ângulo em graus e t1 a t600 correspondem ao número do quadro, que pode ser convertido no tempo. Tab Raw e média: Os raios estão em μm. Tab r-R: As distâncias r-R estão em μm. Tabela (r-R)2: Os valores de flutuação estão em μm2. As abas x e y correspondem às coordenadas cartesianas dos raios da guia Raw e média. Clique <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%204_Droplet%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

O laboratório tem como objetivo compreender melhor os mecanismos envolvidos na aquisição da quantidade de gama feminina, que é essencial para a reprodução de espécies sexuadas utilizando o sistema modelo de ovócitos de camundongos. Recentemente, identificamos um novo processo de transdução mecânica que promove agitação do núcleo e seu conteúdo, levando à regulação fina de RNAs maternos em ovócitos de camundongos. O pipeline de análise de imagens e imagens apresentado neste protocolo permite destacar a transmissão de forças do citoesqueleto como um continuum através de escalas do citoplasma para o núcleo e seus componentes, incluindo corpos de processamento de RNA nuclear em ovócitos de camundongo.Este protocolo fornece ferramentas simples que nos permitem abordar a primeira transmissão em várias escalas celulares em um único pipeline pela primeira vez. Complementado com modelagem biofísica, este protocolo constitui uma técnica não invasiva para abordar mudanças na mecânica nuclear e dissipação de energia através dos compartimentos celulares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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