Análise de Microtomografia Computadorizada do Joelho em Cobaias Dunkin-Hartley Idosas após Injeção Intra-Articular

A osteoartrite, ou OA, é uma doença articular degenerativa que afeta 32,5 milhões de adultos nos EUA. Muitas vezes, os sintomas da OA aparecem somente depois que a doença se torna grave. A falta de medicamentos modificadores da doença decorre de uma má compreensão dos mecanismos que iniciam e impulsionam a doença.

Como resultado, há uma necessidade médica crítica e contínua de agentes aprimorados para o tratamento da OA. As cobaias Dunkin-Hartley são um modelo animal de OA estabelecido, pois desenvolvem naturalmente esta doença, oferecendo um modelo robusto para investigar os efeitos de novas terapêuticas administradas por injeção intra-articular na progressão da doença. Como o osso mineralizado tem excelente contraste na micro-TC, essa modalidade pode ser usada para avaliar características 3D e realizar análises quantitativas de alterações associadas à OA. Duas medidas quantitativas particularmente relevantes incluem a densidade mineral óssea e a espessura trabecular, pois ambas aumentam ao longo da progressão da doença. A metodologia descrita de injeções intra-articulares em cobaias e a subsequente análise dos dados de micro-CT ajudarão a reduzir a variabilidade do estudo e aumentar a eficiência das análises de dados.

Raspe o joelho com um barbeador elétrico. Anestesiar o animal e confirmar uma profundidade adequada de anestesia por falta de resposta de pinça do dedo do pé. Coloque lubrificante ocular estéril em ambos os olhos para evitar dessecação e lesões.

Limpe o local da injeção três vezes com movimentos circulares e alterne usando o esfoliante diluído e as soluções de álcool. Luvas estéreis devem ser utilizadas. Este vídeo inclui o uso de luvas nitro de autoclave.

A técnica asséptica deve ser utilizada durante todo o procedimento. Flexione o joelho a 90 graus, mova o dedo distal à patela para localizar o sulco do aspecto distal do espaço articular, flexionando e estendendo o membro posterior. A tíbia pode ser sentida como a estrutura óssea distal à patela.

Uma vez determinada a localização da tíbia e da patela, a articulação está entre elas. Insira a agulha de insulina cuidadosamente na linha média distal à patela dentro do espaço articular. A agulha deve ser inserida um a dois milímetros abaixo da pele.

Injete o volume lentamente. Massageie o joelho flexionando e estendendo a articulação algumas vezes para garantir a distribuição adequada do medicamento. Coloque amostras com formalina em um recipiente compatível.

Calibre a máquina micro-CT para exposições de campo escuro e campo claro, de acordo com as recomendações do fabricante. Digitalize a amostra com filtro de cobre de alumínio a 18 mícrons. Use a etapa de rotação de 0,7 graus para 360 graus com a câmera offset.

Selecione uma fatia das imagens de micro-CT. Verifique a compensação de desalinhamento. Em configurações, aplique suavização, endurecimento de viga, rotação de CS e artefato de anel.

Selecione Iniciar para iniciar a reconstrução. Selecione VOI e oriente a amostra para alinhar verticalmente para facilitar a análise posterior. Salve o VOI editado como uma nova pasta.

Selecione o intervalo de imagens a serem analisadas, começando com a placa subcondral. Recomenda-se dividir a análise da placa subcondral no osso trabecular, pois eles têm características ósseas diferentes. Selecione a região de interesse para cada imagem para garantir que ela esteja abrangendo o osso.

Selecione a seleção binária. Ajuste o histograma para que o fundo no osso fique completamente separado. Selecione a guia densidade mineral óssea.

Salve esses dados em uma nova pasta de dados de análise. Selecione o processamento personalizado. Primeiro, execute o limite e selecione Automático e depois execute.

Em seguida, selecione Remover manchas e escolha Remover manchas pretas. Repita Remover manchas e escolha Remover manchas brancas. Escolha a análise 3D e selecione os valores básicos e os valores adicionais.

A mostra um joelho dissecado com presença de corante azul de metileno dentro do espaço articular, mostrando injeção correta. B é uma injeção superficial que resulta na formação de uma bolha no espaço subcutâneo. C mostra a falta de corante azul de metileno no espaço articular, mostrando injeção incorreta.

Pode ser útil dividir a análise para a placa subcondral, que é mostrada em A, e o osso trabecular, que é mostrado em B, pois às vezes eles têm parâmetros diferentes para diferentes análises ósseas. Para a densidade mineral óssea, vemos que há um aumento na média das cobaias de 12 meses em comparação com as cobaias de cinco meses, e isso é verdade na placa subcondral e no osso trabecular, o que mostra que a densidade mineral óssea aumenta com o tempo. Além disso, para a espessura trabecular, vemos que há um aumento da espessura em milímetros entre a cobaia de 12 meses e a cobaia de nove meses e a cobaia de cinco meses, o que mostra que a espessura trabecular está aumentando com o tempo.

Os escores de Mankin modificados aumentam à medida que os porquinhos-da-índia envelhecem, como visto na figura A. As Figuras B a D mostram manchas de azul de toluidina. B é uma cobaia de cinco meses, C é uma cobaia de nove meses e D é uma cobaia de 12 meses. O asterisco preto na figura C mostra a perda de proteoglicanos, enquanto o asterisco preto na figura D mostra fissuras e o asterisco branco na figura D mostra hipocelularidade.

Atualmente, a única cura para a OA grave é a reposição, que é cara, invasiva e pode resultar em morbidade e mortalidade do paciente. Como resultado, há uma extrema necessidade de continuar a pesquisar com modelos animais de OA e o desenvolvimento sustentado de novas terapêuticas. Embora as injeções intra-articulares sejam parte integrante dos estudos de OA de cobaias, esse procedimento ainda não foi sistematicamente detalhado.

Procedimentos de injeção adequados são fundamentais para garantir o bem-estar animal e reduzir o número total de animais, particularmente para estudos que requerem injeções múltiplas ao longo de muitos meses. Para avaliar sistematicamente as alterações relacionadas à OA, descrevemos análises de micro-TC. A micro-TC fornece uma avaliação mais aprofundada das alterações da OA do que a revisão histológica dos exames em uma amostra inteira, em vez de uma ou poucas seções de tecido.

Embora as cobaias Dunkin-Hartley forneçam um modelo robusto para estudar a progressão da OA e os efeitos de novas terapêuticas, existem limitações para esse modelo. Os modelos espontâneos geralmente requerem um período de estudo mais longo em comparação com o rápido desenvolvimento de alterações após OA cirúrgica ou quimicamente induzida. Além disso, os pesquisadores podem reduzir o efeito da variabilidade interanimal aplicando tratamentos a um membro em cada animal, permitindo que o membro contralateral sirva como controle interno.