Name: Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a fabricar organoides de câncer colorretal da linha SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta. Este método avalia morfologia, viabilidade e proliferação celular para avanços em medicina regenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah. Os autores reconhecem o Seed Fund Grant da KAUST e o Fundo de Inovação da KAUST concedido pela Inovação e Desenvolvimento Econômico da KAUST. Os autores gostariam de agradecer aos Laboratórios Centrais de Biociência e Imagem da KAUST por apoiar a caracterização biológica e as análises de microscopia.

1. Tampão e preparação da solução
NOTA: Todas as concentrações declaradas são concentrações finais.
<ol><li>Adicione soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina a uma concentração final de 10% e 1%, respectivamente, para preparar o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM). Conservar no escuro a 4 °C até 1 mês.</li>
	<li>Misture MgCl2 (3 mM), sacarose (300 mM) e Triton X-100 (0,5%) em tampão fosfato salino (PBS) para preparar o tampão de permeabilização. Conservar esta solução a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.</li>
	<li>Combine albumina de soro bovino (BSA, 1%), glicina (0,3 M) e Tween-20 (0,1%) em PBS para preparar um tampão de bloqueio. Conservar esta solução a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.</li>
	<li>Diluir 10x a 2x PBS com água ultrapura em condições estéreis. Armazene esta solução em temperatura ambiente por mais de 6 meses.</li>
	<li>Esterilize 3 mg do pó do peptídeo sob luz ultravioleta por 30 min. Adicione 500 μL de água ultrapura para dissolver usando um misturador de vórtice. NOTA: A concentração final deve ser o dobro da concentração alvo, ou seja, 6 mg/mL, pois a concentração de 1x será de 3 mg/mL.</li>
</ol>2. Fabricação de organoides de câncer colorretal de SW1222 em peptídeo
<ol><li>Descongelar uma alíquota durante a noite a 4 °C e mantê-la no gelo até que seja necessário preparar o controlo da matriz do embasamento.</li>
	<li>Coloque uma gota de 10 μL de solução peptídica 2x no centro de cada poço em uma placa de 24 poços. Deixe a placa incubar em temperatura ambiente por 10 min. Como alternativa, deposite 8 a 10 gotículas por poço em uma placa de 6 poços. NOTA: As amostras destinadas a serem usadas em microscopia confocal e eletrônica são mais acessíveis para manipular se semeadas em cima de uma lamínula estéril.</li>
	<li>Adicione 10 μL de 2x PBS. Misture a solução de PBS suavemente usando a ponta. Deixe os géis estabilizarem por pelo menos 20 min, garantindo que as gotículas permaneçam quase intactas. NOTA: O objetivo da adição e mistura suave de PBS é manter a integridade da gota e evitar espalhar o hidrogel em uma camada.</li>
	<li>Retire as células SW1222 usando solução de tripsina-EDTA a 0,125% (5 mL). Incubar as células com tripsina a 37 °C durante 5-10 min até se separarem do frasco. Abstenha-se de bater no balão para evitar a aglomeração de células.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio completo para inativar a tripsina. Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 30 μm. Em alternativa, utilizar uma seringa com uma agulha de 25 G para desmontar os agregados.</li>
	<li>Prepare uma suspensão celular de 0,4 × 106 células/mL e injete 2 μL da suspensão celular em cada gotícula peptídica usando uma micropipeta de 10 μL.</li>
	<li>Incubar as gotículas durante 30 min a 37 °C, 5% CO2. Adicione 0,5 mL de meio suplementado a cada poço após a incubação.</li>
	<li>Enquanto espera, prepare o controle da matriz da membrana basal diluindo o estoque principal (8-12 mg / mL, dependendo do lote) até uma concentração final de 3 mg / mL usando o meio suplementado. Adicionar células a esta solução (800 células por 25 μL). NOTA: A manipulação da membrana do porão deve ser feita no gelo o tempo todo. As pontas devem ser enxaguadas em PBS gelado antes de tocar no hidrogel. Caso contrário, a polimerização ocorrerá dentro das pontas.</li>
	<li>Plaquear gotículas de 20 μL da solução de membrana basal em cada poço. Deixe as gotículas gelificarem incubando por 20 min a 37 °C. Depois que o material estiver gelificado, adicione 0,5 mL de meio completo.</li>
	<li>Troque o meio a cada 3-4 dias. Observe as células se organizando e mostrando sinais de formação de lúmen já no dia 4.</li>
	<li>Células de imagem em campo claro no dia 1, dia 4 e dia 7 para avaliar o crescimento do organoide.</li>
</ol>3. Viabilidade e proliferação
<ol><li>Prepare três placas de poço preto para o ensaio de viabilidade e três placas de poço preto para o ensaio de proliferação. Adicione 25 μL de solução peptídica 2x por poço e gelatie usando o mesmo volume de 2x PBS. Semeie as células conforme descrito acima.</li>
	<li>Preparar três alvéolos para cada formulação de hidrogel peptídico a utilizar como brancos na placa de proliferação. Não semeie células neles.</li>
	<li>Remova o meio da placa do poço de viabilidade e lave com 1x PBS por 3 x 5 min.</li>
	<li>Diluir a calceína-AM e o homodímero de etídio a 8 μM do kit de viabilidade/citotoxicidade para células de mamíferos (ver Tabela de Materiais) no mesmo tubo cónico protegido contra a luz. Para preparar 2 mL desta solução para 2 mL de PBS em um tubo cônico protegido contra luz, adicione 4 μL da solução-mãe Calceína-AM e 8 μL da solução-mãe de homodímero-1 de Etídio.</li>
	<li>Adicione a solução de homodímero de calceína/etídio preparada na etapa 3.4 à placa de 96 poços. Adicione 100 μL por poço. Proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Lave por 3 x 5 min com 1x PBS. Visualize um mínimo de três campos (centro, superior, inferior) ao usar uma objetiva de 4x ou um mínimo de cinco campos (centro, superior esquerdo, superior direito, inferior esquerdo, inferior direito) ao usar uma objetiva de 10x e 20x sob um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Remova o meio da placa do poço de proliferação para garantir um volume final de 90 μL.</li>
	<li>Adicione 10 μL de solução de Alamar Blue (consulte a Tabela de Materiais) para atingir uma concentração final de 10%.</li>
	<li>Proteger da luz e incubar durante 2-4 h a 37 °C, 5% CO2</li>
	<li>Use um leitor de placa de poço para medir a fluorescência (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) ou absorbância (570 nm). Calcule a média dos valores obtidos para os brancos e subtraia-os dos valores de cada poço que contém células.</li>
	<li>Calcule os valores de proliferação calculando a média do sinal de cada condição e subtraindo a média de seus respectivos espaços em branco. Crie gráficos gerando um gráfico de caixa indexado de sinal relativo de absorbância/fluorescência em relação ao tempo.</li>
</ol>4. Ensaio de aderência das células à matriz
<ol><li>Prepare 100 μL de hidrogéis peptídicos em duas placas independentes de 96 poços.</li>
	<li>Semeie 20.000 células em cada poço e adicione 100 μL de meio. Incubar as placas durante 90 min a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Após a incubação, pegue apenas uma placa e ressuspenda cuidadosamente o meio usando uma micropipeta P200 por 20-30 s. Tenha cuidado para não romper o hidrogel, mantendo a ponta longe do gel. Alternativamente, se as propriedades mecânicas do hidrogel permitirem (G' > 8.000 Pa), bata nos quatro lados da placa do poço usando um vórtice móvel. NOTA: Ressuspender o meio (ou bater na placa do poço com o vórtice) removerá as células soltas e as células com adesão tênue à superfície da matriz. A fixação celular ocorrerá dentro de 90 min, embora a força dessa ligação varie dependendo dos hidrogéis peptídicos específicos e de suas propriedades adesivas e de ligação. Sabe-se que o crescimento do organoide colorretal é favorecido em matrizes com valores de rigidez inferiores a 2.000 Pa. Portanto, como os hidrogéis apresentados neste protocolo são macios e quebradiços, fazemos questão de usar um estresse mecânico suave.</li>
	<li>Remova 100 μL de meio de ambas as placas de poço e adicione a lavagem uma vez com 1x PBS.</li>
	<li>Preparar uma solução de DAPI de 1 μg/ml. Adicione 100 μL da solução DAPI a todos os poços e incube por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Imagem de um número representativo de campos sob um microscópio de fluorescência. Certifique-se de que todas as imagens sejam obtidas usando a mesma objetiva para manter a relação pixel/distância constante. NOTA: Imagem nove campos para uma objetiva de 10x ou 15 campos com uma objetiva de 20x.</li>
	<li>Carregue as imagens de fluorescência no software de análise de imagem (por exemplo, ImageJ) e analise as partículas em todas as imagens.<ol><li>No menu Imagem , selecione Tipo e clique em 8 bits.</li>
		<li>No menu Imagem , selecione Ajustar e clique em Brilho/Contraste. Clique no botão Auto | Aplicar.</li>
		<li>No menu Imagem , selecione Ajustar e clique em Limiar. Clique no botão Auto e feche a janela.</li>
		<li>No menu Analisar, clique em Analisar partículas. Marque a opção para resumir e clique em OK.</li>
		<li>Na janela Resumo , passe o mouse sobre o menu Arquivo e clique em Salvar para salvar os valores de resumo.</li>
	</ol></li>
	<li>Exporte os resultados de todas as imagens para o software de estatísticas padrão.</li>
	<li>Calcule a porcentagem de área coberta por células antes e depois do estresse. Faça um gráfico de caixa indexado da porcentagem de área em relação a cada condição.</li>
</ol>5. Imunocoloração de organoides em hidrogel peptídico
<ol><li>Semeie 800 células em gotículas de 20 μL de hidrogel peptídico por 4 dias, conforme descrito nas etapas 2.1-2.10.</li>
	<li>No dia 4, remova o meio e lave cada poço 2x usando 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 400 μL de uma solução de formaldeído a 4%. Incube a placa do poço por 30 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova a solução de formaldeído com um P1000 e lave uma vez com 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de permeabilização e incube por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o tampão de permeabilização com um P1000 e lave uma vez com 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de tampão de bloqueio e incube por 30 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o tampão de bloqueio com um P1000 e lave com 1x PBS.</li>
	<li>Diluir o anticorpo primário no tampão de bloqueio de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Adicione 200 μL a dois poços.</li>
	<li>Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Remova a solução de coloração com um P200 e lave uma vez com 1x PBS.</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário no tampão de bloqueio, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Adicione o conjugado de faloidina na proporção de 1:40 na solução de anticorpo secundário.</li>
	<li>Proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante no máximo 3 h. Remova a solução de coloração com um P200 e lave uma vez com 1x PBS.</li>
	<li>Preparar uma solução de DAPI de 1 μg/ml no tampão de bloqueio. Adicione 300 μL da solução DAPI a cada poço.</li>
	<li>Proteger da luz e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova a solução de coloração com um P200 e lave uma vez com 1x PBS.</li>
	<li>Proteger da luz e conservar a 4 °C até 7 dias.</li>
</ol>6. Imagem e análise de imagem de organoides em matriz
<ol><li>Visualize as amostras coradas usando um microscópio de epifluorescência a 10x. Use apenas os canais de faloidina e DAPI.</li>
	<li>Abra o software Cellopose e pressione ctrl + L para carregar uma imagem. Como o software terá acesso a todos os arquivos no local da imagem selecionada, certifique-se de salvar todas as imagens de fluorescência no local exato sem ter subpastas.</li>
	<li>Digite o diâmetro médio das colônias no painel Segmentação e clique em ENTER.</li>
	<li>Selecione um modelo personalizado para organoides de cólon e clique no botão Executar modelo . NOTA: Aqui, sugerimos o uso de dois modelos do zero no Cellpose2.029,30</li>
	<li>Pressione ctrl + s para salvar as máscaras como um arquivo .npy.</li>
	<li>Use as setas do teclado para percorrer as imagens da pasta e executar o modelo para organoides de dois pontos em todas as imagens da pasta.</li>
	<li>Faça uma cópia da pasta e repita as etapas 6.2-6.6 usando um modelo para o lúmen organoide do cólon.</li>
	<li>Abra o ImageJ e clique em Plugin | Macros | Correr... para executar o arquivo imagej_roi_converter.py disponível no site Cellpose Github e aguarde a exibição de uma janela.</li>
	<li>Selecione o primeiro arquivo da pasta organoide de dois pontos e clique em Abrir.</li>
	<li>Selecione o arquivo seg.npy correspondente ao primeiro arquivo e clique em Abrir. NOTA: O ImageJ converterá as máscaras em regiões de interesse e as sobreporá às imagens de fluorescência correspondentes.</li>
	<li>Clique em Selecionar tudo na janela Gerenciador de ROI e clique em Medir.</li>
	<li>Clique em Arquivo | Salvar como... na janela Resultados e salve os resultados. NOTA: Isso resultará em um arquivo .csv contendo todas as propriedades de forma de cada colônia no campo.</li>
	<li>Repita as etapas 6.8 a 6.12 para a mesma imagem na pasta para o lúmen do organoide do cólon.</li>
	<li>Carregue o OriginPro e pressione ctrl + 3 para abrir o Assistente de Importação. Clique no botão de três pontos e selecione os dois arquivos .csv correspondentes às propriedades de forma de organoide e lúmen para a mesma imagem.</li>
	<li>Copie e cole os resultados das propriedades da forma do lúmen em uma coluna ao lado dos resultados da colônia para garantir que cada medição de lúmen seja emparelhada com sua respectiva colônia.</li>
	<li>Em uma nova coluna, divida as áreas do lúmen e da colônia para obter a área relativa do lúmen de sua colônia que a contém.</li>
	<li>Selecione a coluna correspondente à circularidade de cada colônia e a área do lúmen. Clique em Plotar | 2D Básico | Dispersão.</li>
	<li>Clique com o botão direito do mouse na janela de plotagem e selecione Detalhes da plotagem. Clique na guia Centróide (PRO) e marque as opções que lêem Mostrar ponto centróide para subconjunto, Conectar a pontos de dados e Mostrar elipse.</li>
</ol>

Avaliação de peptídeos biofuncionais de automontagem para adesão celular e morfologia

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
<li>Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+self-assembling+peptides+as+building+blocks+for+modern+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices.</a> Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+tetrameric+peptides+allow+in+situ+3D+bioprinting+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).</li>
<li>Bilalis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptide-based+photoreactive+instant+glue+for+environmental+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Moretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+positioned+catechol+moiety+supports+ultrashort+self-assembling+peptide+hydrogel+adhesion+for+coral+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration.</a> Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).</li>
<li>Alhattab, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+three-dimensional+bone+marrow+niche-like+acute+myeloid+Leukemia+disease+model+by+an+automated+and+controlled+process+using+a+robotic+multicellular+bioprinting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system.</a> Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-based+nanostructures%3A+smart+nanomaterials+toward+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery.</a> Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+by+a+functionalized+silk+fibroin+hydrogel+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).</li>
<li>Hogrebe, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+control+of+matrix+adhesiveness+and+stiffness+within+a+3D+self-assembling+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel.</a> Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).</li>
<li>Wu, F. J., Lin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+self-assembly%2C+and+cell+responses+of+aromatic+IKVAV+peptide+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles.</a> Molecules. 27 (13), 4115(2022).</li>
<li>Cringoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioadhesive+supramolecular+hydrogel+from+unprotected%2C+short+d%2Cl-peptides+with+Phe-Phe+and+Leu-Asp-Val+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs.</a> Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).</li>
<li>Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+functionalized+self-assembled+peptide+hydrogels+in+in+vitro+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis.</a> Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).</li>
<li>Pérez-Pedroza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+lumen-forming+colorectal+cancer+organoids+using+a+newly+designed+laminin-derived+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).</li>
<li>Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+differentiation+and+lumen+formation+in+colorectal+cancer+cell+lines+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors.</a> Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).</li>
<li>Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+colorectal+cancer-derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Pachitariu, M., Stringer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose+2.0%3A+how+to+train+your+own+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose 2.0: how to train your own model.</a> Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate adhesion assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+frontal+and+rear+cell-substrate+adhesions+in+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).</li>
<li>Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+scaffold-free+3D+organoid+model+to+study+neoplastic+progression+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).</li>
<li>Puschhof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid+cocultures+with+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid cocultures with microbes.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).</li>
<li>Matthews, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrganoID%3A+A+versatile+deep+learning+platform+for+tracking+and+analysis+of+single-organoid+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics.</a> PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+%C3%97+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).</li>
<li>Bergdorf, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+cancer+spheroids+and+fine-needle+aspiration-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).</li>
<li>Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+hydrogels+to+engineer+3D+cell+microenvironments+for+cell+constructs+formation+and+precise+oncology+remodeling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer.</a> Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).</li>
<li>Yadav, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide-based+hydrogel+for+the+healing+of+critical+bone+defects+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).</li>
<li>Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+from+self-assembling+tetrapeptides+support+3D+spreading%2C+osteogenic+differentiation%2C+and+angiogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O vasto potencial dos SAPs na pesquisa biomédica é ressaltado por sua maleabilidade e adaptabilidade por meio da biofuncionalização. Com uma gama tão extensa de permutações, surge o desafio de testar e determinar com eficiência as configurações mais promissoras para aplicações específicas, especialmente na pesquisa de organoides. Uma solução rápida e econômica é fundamental. A linhagem celular SW1222, derivada do adenocarcinoma colorretal humano, surge como uma candidata fundamental para essa avaliação intensiva. Aqui, apresentamos um método para a avaliação e caracterização de organoides cultivados em uma matriz à base de peptídeos. Este protocolo promete uma estratégia integrativa e econômica que se concentra no monitoramento e análise de organoides usando avaliações de viabilidade e proliferação, ensaios de adesão, análise de forma e imunocitoquímica. A seleção de concentrações variadas de peptídeos em nossos experimentos de cultura de células é sustentada por uma lógica cuidadosamente considerada que se alinha com objetivos experimentais específicos e contribui significativamente para o avanço de nossa compreensão da cultura de organoides no contexto de matrizes peptídicas. Nossa jornada de pesquisa evoluiu ao longo do tempo, necessitando de uma abordagem diversificada para explorar diferentes formulações. Primeiro, a utilização de uma variedade de concentrações de peptídeos, de 1,5 mg / mL a 4,5 mg / mL, foi motivada pelo desejo de investigar um espectro de resultados potenciais. Ao empregar concentrações mais baixas, nosso objetivo foi avaliar a concentração mínima de peptídeos necessária para apoiar o crescimento e o desenvolvimento de organoides de forma eficaz. Essas informações são vitais para entender a viabilidade de aplicativos econômicos e com recursos mínimos. Por outro lado, concentrações mais altas foram escolhidas para examinar os limites superiores da concentração de peptídeos e seu impacto potencial no comportamento dos organoides, abordando questões relacionadas aos efeitos da saturação e possíveis desvantagens de concentrações excessivas de peptídeos.
Em segundo lugar, objetivos experimentais específicos guiaram nossas escolhas. Por exemplo, ao investigar a adesão celular, as concentrações de peptídeos foram empregadas para diminuir a fratura do hidrogel sob estresse. Por outro lado, em estudos com foco na viabilidade a longo prazo e maturação do tecido, concentrações mais baixas foram utilizadas para atingir os menores valores reológicos possíveis, ao mesmo tempo em que forneciam um gel. Além disso, os valores de proliferação foram escolhidos para mostrar os vários perfis obtidos ao longo do tempo na cultura organoide ao empregar formulações semelhantes. A importância dessa abordagem diversificada reside em sua capacidade de produzir um conjunto de dados abrangente que abrange um amplo espectro de condições e resultados. Ao examinar os efeitos de diferentes concentrações de peptídeos na cultura de organoides, podemos entender melhor a interação diferenciada entre as propriedades da matriz e o comportamento dos organoides.
A avaliação inicial envolve o monitoramento da progressão das células SW1222 ao longo de uma semana em uma placa de 24 poços usando imagens de campo claro. A análise geral da morfologia e da densidade celular é uma técnica de rotina para linhagens organoides9 que está sendo aplicada à linhagem celular. A natureza não invasiva deste protocolo permite a observação ininterrupta da cultura de células, permitindo-nos capturar dados cruciais sobre mudanças morfológicas e densidade celular para cada colônia em particular. Esta análise inicial pode fornecer informações valiosas sobre a adequação da matriz peptídica de automontagem ultracurta. Essas observações estabelecem as bases para análises mais aprofundadas, demonstrando a adequação da matriz peptídica como um andaime eficaz para apoiar o desenvolvimento e crescimento de organoides de câncer colorretal. Além disso, observações interessantes podem surgir do monitoramento do crescimento e das mudanças em cada colônia. Por exemplo, na Figura 4, podemos observar que as colônias que crescem em Matrigel podem colidir umas com as outras, mas parece que um limite é mantido de forma consistente. No entanto, as células cultivadas em peptídeos reorganizam o peptídeo de tal forma que, no dia 7, as localizações das células não são exatamente as mesmas de antes. Isso é algo a ser levado em consideração se esse protocolo for exportado para um sistema automatizado que marcaria e acompanharia o crescimento dos organoides.
O escrutínio subsequente envolve a avaliação da viabilidade e proliferação celular usando um ensaio de viabilidade baseado em homodímero de calceína e etídio. O ensaio de viabilidade fornecerá informações qualitativas sobre a população de células vivas em comparação com as células mortas. O ensaio de proliferação fornecerá informações quantitativas sobre o estado metabólico das células para avaliar a divisão celular31. Estes são ensaios padrão amplamente utilizados em cultura de células e fornecem uma visão geral do estado proliferativo das células. Embora as matrizes SAP tenham sido amplamente demonstradas como biocompatíveis, sabe-se que os organoides exibem viabilidade reduzida devido a condições de cultura abaixo do ideal, incluindo a matriz na qual estão incorporados. Além disso, as propriedades mecânicas das matrizes peptídicas podem influenciar a viabilidade celular. Se a matriz for muito rígida ou rígida, ela pode sujeitar as células a estresse mecânico, potencialmente levando a danos celulares. Por outro lado, se a matriz for muito mole ou instável, ela pode não fornecer suporte suficiente para a adesão e sobrevivência celular. Além disso, os motivos bioativos ou grupos funcionais presentes nos peptídeos podem interagir com receptores celulares específicos ou vias de sinalização, resultando potencialmente em morte celular. Portanto, é crucial monitorar continuamente a viabilidade e proliferação celular.
Em estudos anteriores25, o Peptídeo 1 e o Peptídeo 2 mostraram níveis semelhantes de morte celular em comparação com o Matrigel (Figura 5). No entanto, foram observadas flutuações nos perfis de proliferação de células no peptídeo original com concentrações variadas. Notavelmente, a taxa de proliferação do dia 4 ao dia 7 permaneceu constante em vez de aumentar, sugerindo que as células podem estar entrando em um estágio menos ativo. Além disso, as mudanças na viabilidade celular observadas entre o dia 4 e o dia 7 também permaneceram relativamente consistentes, sugerindo um potencial platô no crescimento e na reprodução.
Para prosseguir com a avaliação e caracterização, empregamos um ensaio de adesão adaptado para cultura 3D, que depende de estresse mecânico para avaliar os efeitos do descolamento celular32. O método para induzir o estresse mecânico deve ser escolhido com base nas propriedades mecânicas do hidrogel. A eficácia do método está inerentemente ligada ao sistema modelo escolhido, e os insights obtidos dependem de quão bem ele representa o contexto biológico. A variabilidade na adesão e nas características organoides pode resultar de inúmeras interações físicas e químicas, que podem ser influenciadas por fatores como a composição do hidrogel e as propriedades adesivas das nanofibras. Esses fatores têm o potencial de afetar a generalização de nossos achados33. No entanto, se o leitor adaptar este protocolo para hidrogéis mais rígidos ou altamente dúcteis, considere o uso de um método de estresse mais robusto.
Utilizamos essa técnica para avaliar a adesividade geral fornecida ao SAP pelo motivo biofuncional (Figura 6). Observamos dois fenômenos. Primeiro, os peptídeos exibiram propriedades adesivas iniciais variadas. Especificamente, o motivo IKVAV e os hidrogéis contendo uma alta concentração do peptídeo biofuncionalizado aderiram às células em mais de 40% de sua área de superfície. Em segundo lugar, após a aplicação do estresse induzido, alguns peptídeos sofreram uma perda significativa de células aderidas. Notavelmente, a capacidade de retenção foi relativamente alta em peptídeos que continham altas concentrações do peptídeo não biofuncionalizado. Assim, o ligante IKVAV e o SAP oferecem diferentes tipos de aderência das células à matriz. Este método permite a descoberta de padrões e a elucidação do mecanismo de aderência do material. Outras técnicas podem ser usadas, como medição de adesividade usando microscopia de força atômica, que pode ser usada para sondar as forças adesivas entre uma ponta de sonda e uma superfície de amostra em nanoescala, fornecendo informações valiosas sobre as propriedades de adesão de materiais e amostras biológicas.
A capacidade de vários materiais peptídicos em induzir a formação de organoides foi avaliada por meio da circularidade da colônia e da área relativa do lúmen dos organoides cultivados em tais hidrogéis peptídicos. Circularidade refere-se à redondeza ou forma de um objeto. No contexto dos organoides, a circularidade pode ser usada para avaliar a morfologia e a simetria da estrutura. Vários estudos mencionaram as morfologias circulares dos organoides. Por exemplo, organoides de câncer de mama tendem a ter morfologias circulares estritas com periferias basolaterais em forma de cordão34. Isso sugere que a circularidade pode ser usada como parâmetro para avaliar a forma dos organoides. O tamanho do lúmen refere-se à cavidade central ou espaço dentro de um organoide. É uma característica essencial, pois reflete a diferenciação e maturação do organoide. Durante o processo de diferenciação, os organoides sofrem uma diminuição no tamanho do lúmen e um aumento na espessura da camada epitelial35. Isso indica que o tamanho do lúmen pode ser usado como um indicador do estágio de desenvolvimento do organoide. A avaliação da circularidade e do tamanho do lúmen pode fornecer informações valiosas sobre as características estruturais e funcionais dos organoides. Organoides circulares com lúmens bem definidos são mais representativos da arquitetura do tecido nativo e podem mimetizar melhor a função do órgão36.
Essas propriedades podem ser avaliadas pela obtenção de imagens de fluorescência do citoesqueleto e dos núcleos das amostras previamente coradas. As imagens foram segmentadas usando Cellpose, e as medidas de forma das máscaras resultantes foram obtidas usando ImageJ. A análise da forma das amostras coradas com citoesqueleto após 4 dias de cultura revelou ainda mais características organoides. Métodos semelhantes, focados principalmente em imagens de campo claro, foram empregados para determinar as respostas dos organoides ao seu ambiente com base na análise da forma e determinação das características do organoide por análise de imagem36 , 37 , 38 . Finalmente, usamos imunocitoquímica para avaliar a polaridade celular com vários marcadores de polaridade. Notavelmente, o uso de um hidrogel peptídico reduzirá o manuseio da amostra, pois isso não requer a remoção da matriz e a recuperação dos organoides39.
A importância deste método reside na versatilidade dos hidrogéis SAP biofuncionais em comparação com outras matrizes derivadas de animais para desenvolver métodos que permitam a tradução de hidrogéis peptídicos em matrizes para cultura organoide. Comparar a matriz peptídica auto-montável ultracurta com matrizes tradicionais, como Matrigel ou colágeno, revela inúmeras vantagens. Primeiro, a matriz peptídica oferece reprodutibilidade superior, pois a sequência peptídica pode ser controlada e sintetizada com precisão, garantindo propriedades e desempenho consistentes em diferentes lotes40. Além disso, apresenta alta estabilidade em termos de propriedades mecânicas e resistência à degradação, mantendo a integridade estrutural por longos períodos e proporcionando um microambiente estável para o crescimento de organoides41. Além disso, a matriz peptídica ultracurta permite o controle preciso e o ajuste fino do microambiente. A sequência peptídica pode ser modificada para incorporar motivos bioativos específicos ou grupos funcionais, apresentando pistas desejadas para a diferenciação celular42.
Em resumo, a importância do método reside em seu potencial para informar o design racional de hidrogéis à base de peptídeos para promover a cultura organoide. Por meio da avaliação sistemática do comportamento celular, esse protocolo facilita a identificação de composições peptídicas promissoras para otimizar o crescimento de organoides. Tais insights estão prestes a se estender a áreas de pesquisa mais amplas, contribuindo para o avanço de estudos baseados em organoides e abordagens de medicina regenerativa.

Nos últimos anos, os peptídeos automontáveis (SAPs) surgiram como biomateriais promissores para aplicações de engenharia de tecidos. Os SAPs possuem propriedades únicas, incluindo formação espontânea de nanofibras, biocompatibilidade, biodegradabilidade e não imunogenicidade, tornando-os candidatos atraentes para o desenvolvimento de andaimes1. Os SAPs foram usados anteriormente em conjunto com vários tipos de células e, notavelmente, os SAPs ultracurtos relatados facilitaram o encapsulamento de células-tronco, mantendo sua pluripotência por períodos prolongados, abrangendo mais de 30 passagens e com incidência mínima de aberrações cromossômicas 2,3,4. Portanto, a adaptação dos SAPs para seu uso em cultura de organoides constituiu um passo subseqüente racional.
Organoides são estruturas tridimensionais complexas que surgem de células pluripotentes únicas. Essas estruturas dão origem a vários tipos de células, que então se auto-organizam para replicar os processos de desenvolvimento do crescimento embrionário e tecidual in vitro5. Essa estrutura inovadora evoluiu para uma ferramenta formidável para investigações in vitro, conservando com eficiência os atributos genéticos, fenotípicos e comportamentais característicos dos órgãos in vivo 6. No entanto, um dos principais impedimentos na transição da bancada para a beira do leito dos achados baseados em organoides é a necessidade de reprodutibilidade7. Essa variação nos resultados é atribuída principalmente à dificuldade em diferenciar totalmente as células-tronco pluripotentes humanas em linhagens celulares especializadas, agravada pela ausência de arquitetura de tecido autêntica e pela complexidade inerente encontrada em modelos organoides. Dado o aumento da popularidade dos estudos baseados em células-tronco e organoides8, tem havido uma demanda crescente por biomateriais com propriedades mecânicas dinâmicas e locais de adesão semelhantes a integrinas ou andaimes com degradabilidade controlada 7,9. Esses atributos podem ser efetivamente ajustados por meio da utilização estratégica de SAPs biofuncionalizados.
Os SAPs são sequências curtas de aminoácidos com a capacidade inerente de se organizar espontaneamente em estruturas bem definidas10. Esses peptídeos geralmente contêm resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos alternados, que impulsionam sua automontagem por meio de interações não covalentes, incluindo ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e efeitos hidrofóbicos11,12. O processo de automontagem desses peptídeos é impulsionado principalmente pela necessidade de minimizar a energia livre do sistema. Quando em um ambiente aquoso, os resíduos hidrofóbicos tendem a se agrupar para minimizar sua exposição à água, enquanto os resíduos hidrofílicos interagem com as moléculas de água circundantes. Esse fenômeno leva à formação de várias nanoestruturas. Nesse caso, peptídeos automontáveis ultracurtos formam nanofibras com características que dependem da sequência peptídica e das condições ambientais 2,12,13,14,15,16. Esses peptídeos adotam uma conformação de β voltas, onde as fitas peptídicas individuais se alinham paralelas ou antiparalelas entre si, estabilizadas por ligações de hidrogênio (Figura 1). A presença de íons positivos acelera os processos de automontagem que levam à formação de nanofibras.
As nanofibras peptídicas foram identificadas como possuidoras de uma capacidade inata de aprisionar volumes significativos de água. Essa característica facilita a geração de um hidrogel, que posteriormente se manifesta como um espaço tridimensional biocompatível e biodegradável propício à proliferação e crescimento celular. Essas nanofibras peptídicas automontáveis emulam intrincadamente as características topográficas inerentes ao ambiente natural da matriz extracelular (MEC)1. Essa semelhança confere às células um ambiente que imita seu habitat fisiológico, promovendo ainda mais atividades celulares ideais17. Além disso, a versatilidade inerente a esses peptídeos permite um grau considerável de sintonia4. Essa adaptabilidade permite alterações nas propriedades da matriz, como rigidez, cinética de gelificação e porosidade. Essas adaptações são alcançadas por meio de modificações na sequência de peptídeos. Consequentemente, os peptídeos de automontagem (SAPs) surgiram como componentes essenciais na ciência contemporânea de biomateriais, amplamente utilizados como andaimes para regeneração de tecidos e cultura celular13,17.
Uma das vantagens críticas dos peptídeos de automontagem é sua capacidade de serem facilmente sintetizados e modificados em nível molecular. Essa vantagem permite a incorporação de grupos funcionais específicos ou motivos bioativos na sequência peptídica, permitindo o design de peptídeos com propriedades e funcionalidades adaptadas 18,19,20 (Figura 1B). Por exemplo, SAPs biofuncionalizados podem ser projetados para mimetizar o ECM e promover a diferenciação usando o peptídeo RGD19,21. O peptídeo Ben-IKVAV também foi relatado para aumentar significativamente a expressão de marcadores específicos neuronais devido à sua mociedade específica do ligante22. Esses peptídeos também podem ser projetados para exibir moléculas bioativas, como peptídeos de ligação à integrina, para aumentar a sobrevivência celular23. Finalmente, outros SAPs biofuncionalizados foram desenvolvidos para promover a angiogênese, incluindo os motivos IKVAV e YIGSR em suas estruturas24.
Os SAPs biofuncionalizados relatados em uma publicação anterior mostram que a automontagem pode ser modificada ainda mais incluindo o peptídeo ingênuo do qual o SAP biofuncionalizado foi derivado25. Essas misturas SAP também podem fornecer uma ampla gama de formulações SAP que variam em sua atividade bioquímica e propriedades físico-químicas. Por exemplo, o peptídeo anfifílico IIFK é um SAP ultracurto que pode suportar a biofuncionalização com vários motivos, exemplificado pela incorporação do motivo IKVAV (Figura 1B). Ambos os peptídeos podem formar nanofibras, tanto sozinhas quanto combinadas. Cada formulação resulta em hidrogéis com propriedades físicas variadas (Figura 2)
No entanto, devido à extensa gama de permutações e alternativas potenciais obtidas a partir da biofuncionalização de SAPs, é necessário fornecer uma opção rápida e econômica para testes de organoides. Um candidato para essa avaliação organoide intensiva e econômica é a linhagem celular SW1222, derivada do adenocarcinoma colorretal humano26,27. As células SW1222 possuem características que permitem sua agregação em estruturas 3D semelhantes a organoides, tornando-as um modelo ideal para estudar o desenvolvimento de tecidos e aplicações de medicina regenerativa. As células SW1222 foram identificadas como capazes de gerar organoides devido à sua superexpressão intrínseca do gene LGR5 27. A criação de organoides a partir de células-tronco LGR5+ individuais já foi exibida de forma convincente antes, bem como a propensão das células SW1222 para atingir características morfológicas de um organoide de câncer colorretal28.
Neste artigo de métodos, apresentamos protocolos detalhados para avaliar e caracterizar os efeitos de vários peptídeos biofuncionais na adesão celular e na formação do lúmen usando células SW1222 (Figura 3). Ao fornecer procedimentos passo a passo e métodos de análise de imagem, esperamos oferecer informações valiosas sobre a biofabricação de organoides e a avaliação de matrizes SAP simplistas para cultura de organoides.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços, tratada com cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldeído (p/v), sem metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços, tratada com cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>Placa preta de 96 poços, tratamento com cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ezrin, monoclonal de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>Secundário usado: anti-coelho Dylight 633</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-pan Caderina, coelho policlonal</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>Secundário usado: anti-coelho Alexa 488</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ZO1 da junção apertada, cabra policlonal</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>Secundário usado: anti-cabra Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2,0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Obtido do microscópio confocal da exploração do</td></tr> laser do https://github.com/MouseLand/cellpose <tr><td>com Airyscan</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-cabra IgG (H + L) de burro, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H + L) de cabra, DyLight 633</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado por Calor (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade VIVO/MORTO, para células de mamíferos</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio, hexahidratado (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel para Cultura Organoide, 356255 Corning livre de vermelho de fenol</td><td></td><td></td><td>Referido no manuscrito como Matrigel ou matriz de membrana basal.</td></tr><tr><td>Microscópio,</td> microscópio de campo <td></td><td></td><td></td>claro</tr><tr><td>, EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64 bits) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td><td>NA feito em laboratório</td><td></td><td>Pode ser feito sob medida por peptídeo fabricantes como Bachem.</td></tr><tr><td>Peptídeo P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td> <td>NA</td> <td>feito em laboratório</td><td>Pode ser feito sob medida por fabricantes de peptídeos como a Bachem.</td></tr><tr><td>Peptídeo P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)</td> <td>NA</td> <td>feito em laboratório</td><td>Pode ser feito sob medida por fabricantes de peptídeos, como a Bachem.</td></tr><tr><td>Rodamina Faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de Cobertura Redonda, 10 mm de diâmetro</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 30 &mu; m filtro</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 linha celular</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure água</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular sw1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Peptídeos de automontagem ultracurtos (SAPs) podem formar espontaneamente nanofibras que se assemelham à matriz extracelular. Essas fibras permitem a formação de hidrogéis biocompatíveis, biodegradáveis e não imunogênicos. Provamos anteriormente que os SAPs, quando biofuncionalizados com motivos derivados de proteínas, podem imitar as características da matriz extracelular que suportam a formação de organoides colorretais. Esses hidrogéis de peptídeos biofuncionais retêm as propriedades mecânicas, a capacidade de ajuste e a capacidade de impressão do peptídeo original original, ao mesmo tempo em que incorporam pistas que permitem que as interações célula-matriz aumentem a adesão celular. Este artigo apresenta os protocolos necessários para avaliar e caracterizar os efeitos de vários hidrogéis peptídicos biofuncionais na adesão celular e na formação do lúmen usando uma linhagem de células cancerígenas de adenocarcinoma capaz de formar organoides de câncer colorretal de forma econômica. Esses protocolos ajudarão a avaliar os efeitos do hidrogel de peptídeo biofuncional na adesão celular e na formação luminal usando imunocoloração e análise de imagem de fluorescência. A linhagem celular utilizada neste estudo foi previamente utilizada para geração de organoides em matrizes derivadas de animais.

Primeiro, avaliamos as células cultivadas em uma placa de 24 poços por 7 dias usando imagens de campo claro. Identificamos pequenos aglomerados de células se reunindo em organoides durante a semana, como visto na Figura 4. Um método de varredura controlada pode acompanhar a mobilidade das células e dos organoides entre diferentes dias. Em geral, observamos a evolução da morfologia das células durante toda a semana. Os organoides derivados de SW1222 devem ter uma morfologia redonda e uma aparência clara. Uma aparência mais escura indica uma densidade celular mais alta indesejada, como visto em algumas das colônias cultivadas no Peptídeo P, dia 7 (Figura 4).
A Figura 5 mostra os resultados dos ensaios de viabilidade celular (Figura 5A) e proliferação (Figura 5B), que apontam para a quantidade de células mortas e vivas e a atividade metabólica, respectivamente. Aqui, usamos um ensaio de viabilidade baseado em homodímero de calceína e etídio e notamos que essas células mostraram uma pequena população de células mortas no dia 7 quando cultivadas em Matrigel. Esse fenômeno também estava presente em todos os hidrogéis à base de peptídeos, mas não na cultura 2D. Os resultados da proliferação mostraram um aumento total na atividade metabólica entre o dia 1 e o dia 7. Além disso, encontramos ligeiras diminuições na atividade entre o dia 4 e o dia 7 para várias condições. Essa observação se correlaciona com o aumento da população de células mortas observado no ensaio de viabilidade (Figura 5A).
Para uma avaliação preliminar da interação entre as células e a biofuncionalização dos hidrogéis peptídicos, realizamos um ensaio de adesão baseado em estresse mecânico para induzir o descolamento celular. Como pode ser observado na Figura 6, o uso de diferentes concentrações do peptídeo biofuncional P2 afetou significativamente o número de células retidas antes e após o processo de descolamento. Aqui, usamos um peptídeo que contém apenas o motivo biofuncional do peptídeo P2 como controle positivo. Também usamos o peptídeo não biofuncional P como controle negativo. Como pode ser observado no gráfico, as células semeadas no peptídeo P tiveram uma adesão inicial relativamente baixa, bem como um baixo valor de retenção. Além disso, a mudança na proporção do peptídeo biofuncional P2 foi correlacionada com a quantidade de células retidas após o estresse. Portanto, usando este ensaio, podemos concluir que o peptídeo P2 afetou a adesão celular que pode ou não ser impulsionada pelo motivo biofuncional, mas foi correlacionada com a quantidade de peptídeo biofuncional presente na mistura.
Em seguida, investigamos o efeito das matrizes nos organoides fabricados. Avaliamos a circularidade da colônia e o tamanho relativo do lúmen em relação ao tamanho da colônia, realizando análise de forma de amostras coradas com citoesqueleto cultivadas por 4 dias. Os pontos de dados tinham uma distribuição particular ao longo dos eixos x e y, e cada condição tinha um centróide com um valor particular para circularidade e área relativa do lúmen. A Figura 7 mostra que as células cultivadas em 2D tiveram uma variação muito alta na circularidade da colônia. Em contraste, as células cultivadas em Matrigel tiveram uma distribuição mais extensa para o tamanho relativo do lúmen.
Curiosamente, os valores de centróide para todos os hidrogéis contendo peptídeos tiveram uma posição muito semelhante. No entanto, a distância entre os pontos de dados mostrou diferentes perfis de distribuição. Por exemplo, o peptídeo P3 teve uma distribuição menor entre os três hidrogéis peptídicos, enquanto os pontos de dados do peptídeo não biofuncional P pareciam ter uma distribuição maior. Esses dados sugerem que ambos os hidrogéis com P1 e P3 têm potencial para serem otimizados para cultura de organoides.
Finalmente, avaliamos a expressão de marcadores específicos usando imunocitoquímica em uma amostra corada para os marcadores apicais ZO-1 e ezrin. Esses marcadores permitiram a avaliação da polarização das células dentro de cada organoide. Também avaliamos marcadores pan caderina para visualizar junções célula-célula e um marcador específico do citoesqueleto (faloidina) para visualizar o lúmen. A Figura 8A mostra os organoides encontrados no peptídeo P não biofuncional, peptídeo P1 biofuncionalizado e Matrigel no dia 4 e no dia 7. Os marcadores ZO-1 e ezrin devem estar localizados nas membranas apicais e basolaterais do organoide; A polarização celular adequada nos permitirá observar a expressão de ambas as moléculas no dia 4 perto da área do lúmen, de outra forma invisível. De fato, como visto na Figura 8, os marcadores ZO-1 e ezrin estavam localizados nas membranas apicais dos organoides cultivados em Matrigel. Curiosamente, os marcadores de ezrina eram pouco visíveis no peptídeo P não biofuncional. A partir disso, inferimos que a polarização ineficiente das células resultou em uma baixa expressão dessas moléculas no peptídeo P.
Além disso, a dispersão dos núcleos tendia a ser irregular nos hidrogéis peptídicos, enquanto os organoides embutidos no Matrigel formavam uma única camada assimétrica de núcleos. Esta descrição corresponde à morfologia ideal para um organoide colorretal; no entanto, embora a orientação dos núcleos não tenha sido completamente assimétrica nos hidrogéis peptídicos, colônias mais densas com multicamadas de núcleos foram encontradas principalmente no peptídeo não biofuncional P. Em contraste, as junções célula-célula devem estar localizadas perpendicularmente às membranas apical e basolateral (Figura 8B). Este marcador nos permitiu observar as bordas de todas as células localizadas dentro da colônia. Quando cultivadas em Matrigel, as células tinham uma distribuição quase perfeitamente radial de pan-caderina (junções célula-célula) no dia 7. Em contraste, colônias não polarizadas, como as do peptídeo P, apresentaram um arranjo desordenado de células e expressão de junções célula-célula próximas à membrana basal e apical.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg"> Figura 1: Peptídeos ultracurtos de automontagem formando nanofibras. (A) Representação do processo de automontagem de peptídeos alifáticos ultracurtos. (B) Estrutura química do SAP IIFK ultracurto biofuncionalizado com o ligante IKVAV. Essa figura foi modificada de Loo et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg"> Figura 2: Estrutura e propriedades dos peptídeos. (A) As estruturas químicas do peptídeo original IIFK e do peptídeo biofuncional P2 são ilustradas. (B) Os resultados do teste do frasco invertido revelam diferenças críticas de concentração e tempo de gelificação. P2 forma um gel translúcido com um CGC mais alto do que o peptídeo pai IIFK. Notavelmente, a mistura IIFK: P2 (1: 1) exibe um CGC ainda mais alto e um tempo de gelificação mais longo do que qualquer um dos peptídeos sozinho. (C) As micrografias eletrônicas de varredura fornecem informações visuais sobre as características estruturais de IIFK, P2 e a mistura IIFK: P2 (1: 1). (D) As imagens de topografia de altura de microscopia de força atômica retratam os peptídeos gelificados a uma concentração de 8 mM, oferecendo uma visão detalhada de suas características de superfície. (E) A espectroscopia de dicroísmo circular revela as mudanças conformacionais da mistura IIFK: P2 em várias concentrações, lançando luz sobre suas alterações de estrutura secundária. (F) As análises reológicas medem a rigidez dos peptídeos gelificados em diferentes concentrações, fornecendo informações valiosas sobre suas propriedades mecânicas. Essa figura é reproduzida de Perez-Pedroza et al.25. Barras de escala = 1 μm (C), 200 nm (D). Abreviatura: CGC = concentração crítica de gelificação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama que descreve a preparação de peptídeos e semeadura de células para fabricação e caracterização de organoides por viabilidade, adesão, capacidade de formação de organoides e imunocoloração em hidrogéis peptídicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg"> Figura 4: Imagens de microscopia de campo claro capturadas de células SW1222 cultivadas em hidrogéis peptídicos marcados como P e P1 em comparação com o controle Matrigel. Curiosamente, os organoides cultivados nos hidrogéis peptídicos manifestam uma morfologia predominantemente esférica no sétimo dia. Em contraste, aqueles situados dentro do Matrigel parecem estar exibindo uma densidade celular reduzida, o que pode ser dito por seu corpo brilhante, em comparação com o corpo escurecido da cultura de organoides em SAP (pontas de setas pretas). No entanto, eles exibem um aparente agrupamento entre colônias adjacentes. Além disso, torna-se evidente que a capacidade migratória das células dentro do ambiente Matrigel é comparativamente diminuída. Barras de escala = 650 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg"> Figura 5: Ensaios de viabilidade e proliferação de células SW1222 em SAP biofuncionalizado em várias concentrações. (A) Avaliação da viabilidade de células cultivadas nos peptídeos biofuncionais P1 e P2, em comparação com Matrigel e 2D. (B) Avaliação da proliferação de células em peptídeo não biofuncional P1 e peptídeo biofuncional P2, em comparação com Matrigel e controles 2D. Aqui, vemos um comportamento semelhante ao das células que crescem em Matrigel para o ensaio vivo/morto. Um ligeiro aumento de células mortas (pontas de setas amarelas) é encontrado em várias condições, principalmente Matrigel. Para proliferação, as tendências variam dependendo do tipo e concentração do peptídeo, mas geralmente há uma tendência positiva. Barras de escala = 250 μm. Essa figura foi adaptada de Perez-Pedroza et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg"> Figura 6: Efeitos do peptídeo no número de células destacadas. (A) Imagens de fluorescência de células coradas com DAPI antes e depois do estresse mecânico. Aqui, usamos o peptídeo P, o peptídeo modificado P2 e o motivo IKVAV. (B) A mudança na adesão celular foi determinada medindo a área coberta em ImageJ. A análise comparativa revelou que o peptídeo biofuncionalizado P2 apresentou uma capacidade de retenção aumentada em comparação com o peptídeo não biofuncional P. Barras de escala = 100 μm. Essa figura foi adaptada de Perez-Pedroza, et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg"> Figura 7: Avaliação da capacidade de formação de organoides pelo cálculo do centróide da área relativa do lúmen versus circularidade. O centróide e a dispersão dos dados variaram entre os tratamentos. Como esperado, a condição de pior desempenho foi a das medições 2D, que se expandiram em uma extensa faixa de valores de circularidade e tiveram a menor área relativa do lúmen. Matrigel não tinha apenas a maior circularidade, mas também o maior lúmen. As condições peptídicas variaram ligeiramente em ambos os valores, mas a condição P3 manteve a variação mais insignificante dos dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg"> Figura 8: Imagens de microscopia confocal de organoides no dia 4 e no dia 7 para vários marcadores. (A) Os marcadores ZO-1 (verde), ezrin (vermelho) e DAPI (azul) são usados para encontrar a distribuição apical das células dentro dos organoides. Como visto no controle Matrigel, essas moléculas estão tipicamente localizadas nas membranas apicais e basolaterais. O peptídeo P não biofuncional mostra expressão dessas moléculas apenas no dia 7. (B) Os marcadores de junção célula-célula corados com anticorpos pan-caderina (verde) devem ser perpendiculares às membranas basolateral e apical dos organoides. Núcleos celulares (azul) e citoesqueleto (vermelho) são usados como contracoloração. O peptídeo não biofuncional P induziu a expressão da junção célula-célula na membrana basolateral, ao contrário dos outros dois tratamentos (P3 e Matrigel). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

Nossa pesquisa tem como objetivo avaliar peptídeos automontáveis ultracurtos como matrizes para culturas organoides de câncer colorretal. Abordamos questões sobre morfologia organoide, para viabilidade, proliferação e a adesão e o impacto da biofuncionalização. O objetivo é otimizar as composições da matriz peptídica para o crescimento efetivo do organoide e contribuir para a medicina regenerativa.As tecnologias de ponta em nosso campo envolvem bioimpressão 3D para fabricação orgânica precisa, plataformas microfluídicas para ambientes de cultura dinâmica e ferramentas avançadas de imagem, como microscopia de força atômica e microscopia multifotônica. A edição de genes CRISPR-Cas9 refina a modificação genética, enquanto o sequenciamento de RNA de célula única fornece insights moleculares aprofundados. Os desafios experimentais atuais incluem melhorar a reprodutibilidade do organoide, refinar a vascularização para construções maiores e imitar a arquitetura complexa do tecido.Superar essas limitações na cultura de longo prazo e incorporar componentes imunológicos em modelos são áreas ativas. Alcançar protocolos padronizados e abordar preocupações éticas que se opõem aos desafios contínuos neste campo. Descobertas significativas em nosso campo incluem a demonstração da adequação de peptídeos ultracurtos de automontagem para culturas organoides.Mostramos a versatilidade, reprodutibilidade e estabilidade desses peptídeos, fornecendo uma plataforma para o ajuste fino de microambientes. Isso contribui para o avanço de estudos baseados em organoides, medicina regenerativa e pesquisa de hidrogel biofuncionalizado. Nosso protocolo preenche uma lacuna de pesquisa, fornecendo uma abordagem sistemática para avaliar organoides em matrizes peptídicas de automontagem ultracurtas.Ele aborda a necessidade de métodos padronizados na avaliação do comportamento celular dentro dessas matrizes, auxiliando no projeto duracional de hidrogéis baseados em peptídeos para o crescimento ideal de organoides e no avanço dos estudos de medicina regenerativa.

fabrication-characterization-colorectal-cancer-organoids-from-sw1222

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para gerar organoides 3D a partir de células de câncer colorretal derivadas de modelo murino, propagando-as em placas revestidas de matriz extracelular artificial. Esses organoides CRC podem ser usados como modelo para estudar o crescimento primário de células tumorais humanas e metástases.

Cultura de organoides CRC: um método para obter organoides 3D de células de câncer colorretal

Este vídeo descreve a técnica de geração de organoides CRC transduzidos por partículas lentivirais GFP para permitir imagens fluorescentes. Esses organoides marcados com GFP, quando colocados em modelos animais, ajudam a estudar a invasão tumoral e a metástase.

Marcação de células organoides CRC: um método para gerar células organoides de câncer colorretal transduzidas por lentivírus GFP

Este vídeo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer colorretal ou PDXs. Esses modelos de xenoenxerto imitam parcialmente as características dos carcinomas humanos e entendem os aspectos críticos das malignidades humanas, incluindo invasão e metástase.

Modelos de camundongos com metástase espontânea: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de câncer colorretal injetadas ortotopicamente

O vídeo descreve a dissecção a laser do modelo de cocultura organotípica 3D com precisão em nível de mícron. Em modelos organotípicos 3D, constituintes estromais, como fibroblastos, são co-cultivados tridimensionalmente com células epiteliais cancerígenas. O modelo 3D serve como uma ferramenta experimental que permite que as interações entre invasão e estroma de câncer sejam estudadas em condições quase fisiológicas.

Microdissecção a laser: uma técnica para isolar células invasoras de câncer colorretal a partir de um modelo de cultura organotípica 3D

Um método simples para determinar murino organóide tumor de cólon primário é descrito. Este método utiliza o recurso de que as células tumorais de cólon sobreviver e crescer em Organóides em meios contendo fatores de crescimento limitadas, enquanto cólon normais do epitélio não.

Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

Perfil molecular de células de laser e microdissecados do estroma, modelos de cancro colorectal sintéticos engenharia de tecidos representa uma abordagem nova e manipulável para caracterizar e dissecar a biologia distinta na interface entre as células tumorais na frente invasiva e células estromais de cancro associado.

Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. O modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal e permite a avaliação de novas drogas terapêuticas em um cenário clinicamente relevante de metástases pulmonares e hepáticas.

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

O protocolo descreve um método para criar um modelo organoide de câncer colorretal derivado do paciente (CCR) co-cultivado com linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) para estudar suas interações e potencial terapêutico. Este modelo fornece uma plataforma pré-clínica para explorar as respostas imunes no microambiente tumoral e prever a eficácia da terapia baseada em TIL para o tratamento personalizado do CCR.

Estabelecimento de um sistema de co-cultura de organoides tumorais colorretais derivados de pacientes e linfócitos infiltrantes de tumor (TILs)

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Aprenda a fabricar organoides de câncer colorretal da linha SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta. Este método avalia morfologia, viabilidade e proliferação celular para avanços em medicina regenerativa.

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta (Vídeo) | JoVE Journal

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Explorar mais vídeos