CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

Daniel J. Davis; James F. McNew; Jennifer N. Walls; Christine E. Bethune; Payton S. Oswalt; Elizabeth C. Bryda

doi:10.3791/66069

CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação...

JoVE Journal
Genetics
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Genetics

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação de Embriões de 2 Células

Full Text

2,976 Views

08:24 min

March 15, 2024

DOI: 10.3791/66069-v

Daniel J. Davis^1,2,4, James F. McNew², Jennifer N. Walls³, Christine E. Bethune³, Payton S. Oswalt³, Elizabeth C. Bryda^1,2,3,4

¹Animal Modeling Core,University of Missouri, ²Comparative Medicine Program,University of Missouri, ³Rat Resource and Research Center,University of Missouri, ⁴Department of Veterinary Pathobiology,University of Missouri

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This protocol presents an optimized approach for producing genetically modified rat models using CRISPR technology. Adeno-associated virus (AAV) is utilized to deliver a DNA repair template, while electroporation is employed to introduce CRISPR-Cas9 reagents into 2-cell embryos for genome editing.

Key Study Components

Area of Science

Genetic Engineering
Neuroscience
Model Organisms

Background

CRISPR-based genome editing tools enable precise modifications in the genome.
The system uses a guide RNA and Cas9 nuclease to create targeted DNA breaks.
Homology Directed Repair allows for the integration of engineered DNA sequences.
Adeno-associated virus serves as a delivery mechanism for DNA repair templates.

Purpose of Study

To present a modified approach for generating knock-in rat models.
To utilize AAV for efficient delivery of DNA repair templates.
To demonstrate the effectiveness of electroporation for CRISPR-Cas9 delivery.

Methods Used

Delivery of AAV serotypes 1 or 6 containing engineered DNA repair templates.
Electroporation of CRISPR-Cas9 complexes into rat 2-cell embryos.
Application of Homology Directed Repair for precise genome editing.
Evaluation of the efficiency of the modified protocol in generating genetically modified rats.

Main Results

Successful integration of DNA repair templates into the rat genome.
Generation of targeted knock-in rat models with desired genetic modifications.
Demonstration of the effectiveness of AAV and electroporation in embryo editing.
Validation of the protocol's efficiency compared to traditional methods.

Conclusions

The modified protocol enhances the production of genetically modified rat models.
AAV and electroporation are effective tools for genome editing in embryos.
This approach can facilitate future research in genetic engineering and neuroscience.

Frequently Asked Questions

What is the role of AAV in this protocol?

AAV is used to deliver the DNA repair template to the rat embryos.

How does electroporation contribute to the process?

Electroporation is used to introduce CRISPR-Cas9 reagents into the embryos for genome editing.

What are the advantages of using CRISPR for genome editing?

CRISPR allows for precise targeting and modification of specific DNA sequences.

Can this method be applied to other animal models?

While this protocol is designed for rats, similar techniques can be adapted for other species.

What are knock-in models used for?

Knock-in models are used to study gene function and disease mechanisms by introducing specific genetic changes.

Is this protocol suitable for beginners in genetic engineering?

The protocol may require some prior knowledge of molecular biology techniques, but it is designed to be straightforward.

Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.

As ferramentas de edição do genoma baseadas em CRISPR facilitaram muito a produção de modelos de representação geneticamente modificados. O sistema CRISPR é composto por um único complexo de RNA guia para uma nuclease Cas9 e pode ser programado para atingir uma sequência de interesse dentro do genoma para criar uma quebra de DNA de fita dupla. Através da coentrega de um modelo de reparo de DNA, essa quebra de DNA pode ser restaurada com precisão, juntamente com a adição de qualquer sequência de DNA projetada desejada através de um processo chamado Reparo Dirigido por Homologia.

É por esse processo que somos capazes de gerar modelos de ratos knock-in com inserções ou substituições de DNA direcionadas. Usando este protocolo, apresentamos uma abordagem modificada usando vírus adenoassociado para entregar um molde de reparo de DNA a embriões de rato, juntamente com uma entrega subsequente de complexos CRISPR Cas9 através da eletroporação de embriões de duas células. Os sorotipos 1 ou 6 do AAV são empacotados com um modelo de reparo de DNA projetado para ser integrado ao genoma do rato por meio do processo de Reparo Dirigido por Homologia mediado por CRISPR.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos