CRISPR-Cas9 Edição Genômica de Embriões de Rato usando Vírus Adenoassociado (AAV) e Eletroporação de Embriões de 2 Células
15 de março de 2024
Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados. O vírus adenoassociado (AAV) é usado para entregar um modelo de reparo de DNA, e a eletroporação é usada para entregar reagentes CRISPR-Cas9 para completar o processo de edição do genoma em embrião de 2 células.
As ferramentas de edição do genoma baseadas em CRISPR facilitaram muito a produção de modelos de representação geneticamente modificados. O sistema CRISPR é composto por um único complexo de RNA guia para uma nuclease Cas9 e pode ser programado para atingir uma sequência de interesse dentro do genoma para criar uma quebra de DNA de fita dupla. Através da coentrega de um modelo de reparo de DNA, essa quebra de DNA pode ser restaurada com precisão, juntamente com a adição de qualquer sequência de DNA projetada desejada através de um processo chamado Reparo Dirigido por Homologia.
É por esse processo que somos capazes de gerar modelos de ratos knock-in com inserções ou substituições de DNA direcionadas. Usando este protocolo, apresentamos uma abordagem modificada usando vírus adenoassociado para entregar um molde de reparo de DNA a embriões de rato, juntamente com uma entrega subsequente de complexos CRISPR Cas9 através da eletroporação de embriões de duas células. Os sorotipos 1 ou 6 do AAV são empacotados com um modelo de reparo de DNA projetado para ser integrado ao genoma do rato por meio do processo de Reparo Dirigido por Homologia mediado por CRISPR.
O AAV é adicionado a uma gota de 30 microlitros de meio KSOM de rato em uma concentração final de 3 X 10 para a 7ª cópia do genoma por microlitro. Em seguida, embriões recém-coletados em estágio celular com pronúcleos visíveis são então transferidos para o meio contendo AAV, permitindo que ocorra a transdução viral. Usando nosso protocolo, não há necessidade de afinar a zona pelúcida, pois os sorotipos 1 e 6 do AAV são capazes de passar prontamente para a entrega eficiente do molde de reparo de DNA.
Os embriões são cultivados com o AAV durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade máxima. No dia seguinte, é feita uma mistura de eletroporação contendo cem nanogramas por microlitro de RNA guia único e cem nanogramas por microlitro de proteína Cas9 diluída em meio OptiMIM. A mistura é incubada em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a formação de complexos CRISPR RNP.
Durante o tempo de incubação, o eletroporator é ligado e os eletrodos são fixados aos eletrodos de lâmina de vidro. Após a formação da RNP, cinco microlitros da mistura de eletroporação são pipetados entre os eletrodos, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. Os embriões, agora no estágio de duas células, são removidos do meio contendo AAV e cuidadosamente movidos para a mistura de eletroporação entre os eletrodos.
Os embriões são alinhados, garantindo que nenhum deles esteja tocando nenhum dos eletrodos, pois isso causará lise durante a eletroporação. Aqui está uma visão deste procedimento através do microscópio. Também é importante notar que a impedância diminuirá à medida que o volume entre os eletrodos aumentar.
Por esta razão, e para não diluir a mistura de eletroporação, meios mínimos devem ser transferidos juntamente com os embriões. Em seguida, a impedância é medida pressionando o botão com um símbolo de ohm. A impedância deve estar dentro da faixa de 0,18 a 0,3 ohms.
Se estiver no alcance, a eletroporação é iniciada pressionando o botão de partida. Este processo leva apenas alguns segundos, e é assim que se parece através do microscópio. Você notará bolhas se formando rapidamente em cada eletrodo.
Imediatamente após a eletroporação, os embriões são coletados da lâmina de vidro e lavados três vezes em meio KSOM fresco de rato. Os embriões podem então ser cultivados para estudos in vitro ou transferidos para fêmeas substitutas para produzir descendentes vivos. É importante ressaltar que o inchaço embrionário é comum após a eletroporação.
Esse inchaço deve diminuir após algumas horas de cultura. Também é comum observar eventos de fusão celular em até 20% dos embriões de duas células após a eletroporação. A fusão celular pode tipicamente ser evitada pelo cuidadoso alinhamento do eixo horizontal dos embriões entre os eletrodos.
Testando nosso protocolo em embriões de rato e triagem de blastos cultivados para uma inserção de uma sequência de íntrons artificiais curtos contendo dois sítios loxP. Observamos que mais de 60% dos blastocistos contêm o alelo knock-in corretamente direcionado com base na análise de sequência de próxima geração. Em seguida, testando ainda mais nosso protocolo para produzir ratos knock-in vivos, projetamos um projeto para projetar uma sequência de revestimento de recombinase Cre direcionada para o local de início ATG do gene DRD2 do rato.
Dos 11 filhotes nascidos, 10 foram positivos por análise de PCR nos cinco braços de homologia primo, três braços de homologia primo e um ensaio interno de PCR para detectar Cre recombinase. Como um resumo ao longo de sete projetos diferentes, alcançamos uma taxa média de sucesso de 76% em animais fundadores, conforme determinado pela análise de PCR através de junções de braço de homologia e verificação de sequência de DNA. Usando essa entrega de DNA mediada por AAV e o pipeline de eletroporação de embriões de duas células, experimentamos eficiências de knock-in significativamente mais altas do que as abordagens tradicionais para inserções de DNA de até três KB de comprimento.
Também é importante notar que, embora tenhamos demonstrado o uso desse procedimento em embriões de ratos, ele pode ser efetivamente aplicado a outras espécies para gerar inserções de DNA direcionadas também.
Visão Geral
Este protocolo apresenta uma abordagem otimizada para a produção de modelos de ratos geneticamente modificados utilizando a tecnologia CRISPR. O vírus adeno-associado (AAV) é utilizado para entregar um modelo de reparo de DNA, enquanto a eletroporação é empregada para introduzir reagentes CRISPR-Cas9 em embriões de 2 células para edição do genoma.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia Genética
- Neurociência
- Organismos Modelo
Contexto
- Ferramentas de edição genômica baseadas em CRISPR permitem modificações precisas no genoma.
- O sistema utiliza um RNA guia e a nucleasse Cas9 para criar quebras direcionadas no DNA.
- A Reparo Dirigido por Homologia permite a integração de sequências de DNA modificadas.
- O vírus adeno-associado atua como um mecanismo de entrega para modelos de reparo de DNA.
Objetivo do Estudo
- Apresentar uma abordagem modificada para gerar modelos de ratos knock-in.
- Utilizar AAV para entrega eficiente de modelos de reparo de DNA.
- Demonstrar a eficácia da eletroporação para entrega de CRISPR-Cas9.
Métodos Utilizados
- Entrega de sorotipos de AAV 1 ou 6 contendo modelos de reparo de DNA modificados.
- Eletroporação de complexos CRISPR-Cas9 em embriões de rato de 2 células.
- Aplicação do reparo direcionado por homologia para edição gênica precisa.
- Avaliação da eficiência do protocolo modificado na geração de ratos geneticamente modificados.
Resultados Principais
- Integração bem-sucedida de modelos de reparo de DNA no genoma de rato.
- Geração de modelos de ratos com inserção direcionada e modificações genéticas desejadas.
- Demonstração da eficácia da AAV e da eletroporação na edição de embriões.
- Validação da eficiência do protocolo em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- O protocolo modificado aprimora a produção de modelos de ratos geneticamente modificados.
- AAV e eletroporação são ferramentas eficazes para edição do genoma em embriões.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas futuras em engenharia genética e neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A geração eficiente de modelos de ratos geneticamente modificados é essencial para a pesquisa translacional e a validação pré-clínica em pipelines de biofármacos. Este protocolo utiliza a entrega de DNA mediada por AAV e a eletroporação de embriões de 2 células para simplificar a edição do genoma com CRISPR-Cas9, reduzindo barreiras técnicas e melhorando a eficiência de inserção gênica. A abordagem aumenta a confiança preditiva e acelera a criação de modelos relevantes para doenças, úteis para validação de alvos e estudos mecanicistas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a geração rápida de modelos de ratos knock-in para interrogatório funcional de alvos.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao facilitar modificações genéticas precisas.
- Aprimora a confiança preditiva na validação de alvos por meio de edição do genoma de alta eficiência.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece modelos animais validados para triagem fenotípica e desenvolvimento de ensaios posteriores.
- Aprimora a reprodutibilidade e padronização, minimizando a variabilidade na manipulação de embriões.
- Fornece resultados quantitativos de genotipagem para caracterização confiável do modelo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite a criação de modelos de rato relevantes para doenças, destinados a estudos translacionais de biomarcadores.
- Facilita a transição da descoberta genética para a validação pré-clínica in vivo.
- Apoia decisões de avanço com ajuste de risco, fornecendo dados robustos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra à continuidade entre descoberta e pré-clínica ao permitir a geração eficiente de modelos geneticamente modificados para testes de hipóteses e validação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Acelera a testagem de hipóteses e a elucidação de vias por meio de edição genômica direcionada.
- Triagem: Fornece modelos animais reprodutíveis prontos para ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Fornece resultados quantitativos de genotipagem e sequenciamento para verificação de modelos.
- Pesquisa Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica com sistemas in vivo relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho escalável e reutilizável para gerar diversos modelos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza o fluxo de trabalho, melhora a reprodutibilidade e minimiza os requisitos de habilidade técnica.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de prosseguir/interromper e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e a alocação eficiente de recursos entre programas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de embriões e na preparação de reagentes CRISPR-Cas9.
- Requer acesso a equipamentos de eletroporação e capacidade de produção de AAV.
- Exige padronização entre equipes para alinhamento de embriões e parâmetros de eletroporação reprodutíveis.
- Adaptável a outras espécies, considerando as características específicas dos embriões de cada espécie.
- O potencial de eventos de fusão celular e inchaço dos embriões exige controle procedural cuidadoso.
