Name: Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 36 s
Description: Aprenda a reutilizar tubos de ultracentrífuga de policarbonato para isolamento de vesículas extracelulares em análises proteômicas de baixo volume. Este método validado reduz custos e resíduos laboratoriais em pesquisas cardiovasculares.

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do National Institutes of Health grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 e R01HL136431, Kowa Company, Ltd. e do Programa de Pesquisa e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o Acordo de Concessão Marie Skłodowska-Curie nº 101023041 (R. Cahalane). A Figura 1 foi criada com Biorender.com. O protocolo de limpeza atual foi desenvolvido modificando um protocolo de limpeza de tubo recomendado apresentado no Dia da Educação da Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). Muito obrigado à Dra. Kathryn Howe e à Dra. Sneha Raju da University Health Network (Universidade de Toronto, Canadá) pelas amostras originais de EV do tecido carotídeo.

1. Limpeza do tubo
NOTA: O procedimento de isolamento EV usa tubos UC de policarbonato com e sem tampa (detalhados abaixo). O mesmo procedimento foi seguido para tubos tampados e não tampados. No caso de tubos tampados, as partes da tampa foram limpas individualmente e remontadas após a secagem e pré-armazenamento.
<ol><li>Após o uso inicial dos tubos de policarbonato e a remoção da amostra, mergulhe imediatamente os tubos UC em água da torneira para evitar o ressecamento da amostra na lateral do tubo.</li>
	<li>Transfira e submerja os tubos em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% em água da torneira por 10 min.</li>
	<li>Um tubo de cada vez, transvase a maior parte, mas não toda, da solução SDS do tubo e use um cotonete para limpar completamente a área do tubo onde o pellet EV estava localizado. NOTA: Não use nada com cerdas. Este protocolo usou cotonetes normais; no entanto, cotonetes especializados e de baixa emissão de fiapos podem ser usados para limpar os tubos.</li>
	<li>Enxágue pelo menos 3x com água quente da torneira (~ 50 °C). Certifique-se de encher e decantar completamente o tubo.</li>
	<li>Enxágüe 1x com água desmineralizada usando um borrifador ou um frasco de lavagem de boca estreita.</li>
	<li>Enxágue 1x com etanol a 70% usando um borrifador.</li>
	<li>Deixe o tubo de cabeça para baixo para secar. NOTA: Os racks de tubos para classificação de células ativadas por fluorescência funcionam bem para secar os tubos UC.</li>
	<li>Coloque os tubos completamente secos em uma jarra limpa; eles estão prontos para reutilização. NOTA: Atualmente, o protocolo é validado para reutilização em até 2x.</li>
</ol>2. Enriquecimento de EV
NOTA: O seguinte protocolo de isolamento EV e proteômica foi usado tanto para o isolamento EV do tecido original, quanto para as "amostras simuladas" usadas para obter as amostras de tubo em branco (nunca usadas) e limpas. As amostras originais foram EVs ressuspensas aprisionadas em tecido de placas carotídeas de pacientes submetidos a endarterectomias carotídeas. As peças cirúrgicas foram coletadas na University Health Network (Toronto, Canadá) e aprovadas pelo comitê de ética institucional. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a coleta de amostras e análise dos dados, de acordo com a Declaração de Helsinque. As amostras simuladas foram pseudo-pellets obtidos do tratamento de tubos em branco e limpos com as mesmas soluções e etapas de processamento das amostras de isolamento EV.
<ol><li>Descongele amostras EV ou amostras simuladas em PBS no gelo.</li>
	<li>Faça tampão NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) e filtro estéril.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Mova o sobrenadante para um tubo de policarbonato aberto de 1 mL.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 100.000× g durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 150 μL de tampão NTE filtrado estéril com inibidor de protease.</li>
	<li>Transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione tampão NTE para atingir um volume total de amostra de 1,5 mL.</li>
	<li>Mantenha as amostras no gelo.</li>
</ol>3. Preparação de gradientes de densidade e separação de gradientes de densidade
NOTA: Este protocolo de isolamento EV foi descrito anteriormente por Blaser et al.9 Em resumo:
<ol><li>Prepare cinco soluções de meio de gradiente de densidade de iodixanol (10%, 15%, 20%, 25% e 30%) com tampão NTE como diluente.</li>
	<li>Colocar as soluções de cinco densidades sequencialmente no(s) tubo(s) de ultracentrífuga tampado(s) com 30% na parte inferior e 10% na parte superior.</li>
	<li>Fixe as tampas no(s) tubo(s) e mova-as suavemente para uma posição horizontal estável durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após 1 h, mova o(s) tubo(s) suavemente para a posição vertical no gelo por 30 min para esfriar o gradiente.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL da amostra ou amostra simulada (tampão NTE) ao topo do(s) tubo(s) de gradiente de densidade preparado(s).</li>
	<li>Tubo(s) de ultracentrífuga a 250.000 × g durante 40 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova as frações superiores do gradiente de densidade (2.4 mL) para o(s) tubo(s) de ultracentrífuga destampado(s). Encha até 9 mL com tampão NTE filtrado estéril.</li>
	<li>Pulverizar os EVs por ultracentrifugação a 100.000 × g por 1 h a 4 °C. NOTA: Circule a localização do pellet EV visível ou a localização esperada com um marcador. Isso permitirá que você limpe a área do pellet diretamente com o cotonete.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante enquanto move o tubo para uma posição de cabeça para baixo por 3 min. Remova as gotículas restantes com um cotonete antes de virar o tubo para cima.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet EV em 12 μL de tampão de lise no kit referenciado.</li>
</ol>4. Preparação de peptídeos para proteômica
NOTA: A preparação da amostra proteômica foi realizada de acordo com o protocolo do kit com modificações internas para amostras de proteína de baixa abundância. O protocolo modificado é o seguinte:
<ol><li>Lise, desnature, reduza e alquile as amostras aquecendo em tampão de lise a 95 °C por 10 min.</li>
	<li>Digerir as amostras utilizando a solução de digestão de Lis-C/tripsina durante 2 h a 37 °C, utilizando 10 μl de solução de lise da amostra e 10 μl da solução de digestão.</li>
	<li>Purifique os peptídeos através de um cartucho, lavando os contaminantes hidrofílicos e hidrofóbicos e eluindo os peptídeos purificados usando soluções de kit.</li>
	<li>Seque os peptídeos purificados em vácuo rápido a 45 °C por 45 min ou até secar. NOTA: Evite o ressecamento dos peptídeos.</li>
	<li>Armazenar amostras a -80 °C até ao momento da sequenciação por espectrometria de massa.</li>
	<li>Adicione 17 μL de solução de carga LC aos peptídeos secos.</li>
	<li>Deixe as amostras no gelo por 1 h.</li>
	<li>Vortex as amostras brevemente e depois sonicar em banho-maria ultrassônico por 5 min.</li>
	<li>Centrifugue as amostras de carga LC a 16.000 × g por 1 min, aspire 15 μL do topo e separe em um novo tubo.</li>
</ol>5. Cromatografia líquida e sequenciamento por espectrometria de massa em tandem
<ol><li>Injectar 2 μL de solução de peptídeo de carga LC num espectrómetro de massas.</li>
	<li>Fracione os peptídeos usando uma configuração de coluna dupla.</li>
	<li>Aquecer a coluna a uma temperatura constante de 45 °C.</li>
	<li>Execute o gradiente analítico a 300 nL/min de 5% a 21% de Solvente B (acetonitrila/0,1% de ácido fórmico) por 60 min, seguido por 10 min de 21% a 30% de Solvente B e outros 10 min de uma lavagem de quebra-cabeça de 95% a 5%.</li>
	<li>Defina o MS1 para resolução de 120 K (tempo máximo de injeção, 25 ms), sujeite os principais íons precursores (dentro de um tempo de ciclo de 3.0 s) para largura de isolamento HCD de 1.2 m/z, exclusão dinâmica habilitada (60 s) e defina a resolução MS2 para 60 K (tempo máximo de injeção, automático; energia de colisão normalizada, 24%, 26% e 28%).</li>
	<li>Defina a faixa de aquisição MS1 e MS2 para 400 m/z-1.200 m/z e 120 m/z-1.200 m/z, respectivamente.</li>
</ol>6. Identificação de peptídeos/proteínas
<ol><li>Pesquise os espectros de peptídeos adquiridos com um software de pesquisa proteômica usando um algoritmo de pesquisa comercial em um banco de dados uniProt humano.</li>
	<li>Defina a enzima de digestão para tripsina e permita até duas clivagens perdidas.</li>
	<li>Defina a tolerância do precursor como 10 ppm e a janela de tolerância do fragmento como 0,02 Da.</li>
	<li>Defina a oxidação da metionina e a acetilação N-terminal como modificações variáveis e a cisteína carbamidometilação como modificação fixa.</li>
	<li>Filtre os peptídeos com base em um limite de taxa de descoberta falsa (FDR) de 1,0%, conforme calculado pelo algoritmo Percolator.</li>
	<li>Considere apenas os peptídeos atribuídos a um determinado grupo de proteínas e não detectados em nenhum outro grupo de proteínas como únicos e use-os para análises adicionais.</li>
	<li>Incluir apenas um mínimo de dois peptídeos únicos para cada proteína nas análises.</li>
	<li>Maximize os IDs com a detecção de íons precursores.</li>
	<li>Realize o alinhamento cromatográfico com uma mudança máxima de tempo de retenção de 10 min, tolerância de massa de 10 ppm e mínimo de 5 relação sinal-ruído.</li>
	<li>Normalize a abundância de peptídeos pela quantidade total de peptídeos.</li>
</ol>

Reciclagem eficiente de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para proteômica

<ol><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273(2022).</li>
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<li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419(2015).</li>
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<li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li>
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<li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CSTA%2C+encoding+Cystatin+A%2C+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li>
<li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li>
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<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li>
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<li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+dust+in+seven+Danish+offices%5BTitle%5D)+AND+%22Atmospheric+Environment%22%5BJournal%5D)">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li>
<li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Aqui descrevemos e validamos um protocolo para limpeza de tubos de policarbonato UC para enriquecimento EV e aplicações proteômicas. Demonstramos a remoção bem-sucedida da proteína residual da amostra anterior do tubo UC em comparação com uma análise de pseudo-pellet limpo abaixo do limite de detecção deste protocolo de aquisição de espectrometria de massa e mostramos a semelhança proteômica do tubo UC nunca usado em branco em comparação com os pseudo pellets de tubo UC limpos.
Primeiro, para evitar a adsorção inadvertida de proteína na parede interna de policarbonato, os tubos de UC foram imediatamente submersos em H2O10. A lavagem manual dos tubos UC de policarbonato é recomendada pelos fabricantes11. Outros detergentes, como o Lipsol, devem ser usados com cautela. É um detergente de laboratório patenteado composto por uma mistura de detergente, surfactante e agentes quelantes com pH não neutro. Portanto, para esta etapa, foi utilizado um detergente compatível com espectrometria de massas, SDS 0,1%, e a lavagem não foi realizada por mais de 10 min11. Em nossa experiência, o uso de ferramentas de limpeza de cerdas pode causar arranhões no tubo se não houver cuidado. Para mitigar possíveis arranhões, que poderiam fornecer um reservatório para proteína residual, um cotonete foi usado para limpar o interior do tubo de policarbonato, com foco na área de formação de pellets EV. A autoclavagem repetida pode reduzir a vida útil do tubo de policarbonato11; em vez disso, foram realizados três breves enxágues com água quente. Deve-se notar também que, embora os fabricantes sugiram métodos de esterilização não térmicos, uma temperatura específica a ser evitada não é descrita. Os tubos devem sempre ser inspecionados quanto a sinais de deformação ou rachaduras antes de serem reutilizados, de acordo com as recomendações dos fabricantes. Não se recomenda a utilização de substâncias inflamáveis perto de centrifugadoras em funcionamento; Assim, secamos os tubos durante a noite após a etapa final de enxágue com etanol a 70%.
Nenhuma contaminação significativa por polímero foi observada pela avaliação manual dos cromatogramas. Não se espera que a SDS degrade o policarbonato, e exposições breves à água quente (<60 °C) não têm efeito, enquanto exposições mais longas têm12. Além disso, estudos anteriores indicaram que as espécies de policarbonato eluem em um tempo de retenção antes da coleta com base em nosso gradiente de acetonitrila13. Embora não possamos ter certeza de que os polímeros não estão presentes, com nossos métodos de aquisição, estamos confiantes de que o proteoma não é substancialmente afetado.
Ao reutilizar material de laboratório para experimentos proteômicos sem rótulos, os contaminantes proteicos residuais do uso anterior devem ser especificamente considerados. Além disso, a proteômica EV é frequentemente conduzida com amostras de rendimento muito baixo, às vezes produzindo quantidades de proteína na faixa de <100 ng. Essas quantidades de proteína inicial são adequadas para espectrometria de massa, mas aumentam substancialmente o impacto que mesmo pequenas quantidades de proteína residual terão no proteoma geral. Dada a sensibilidade do avanço do sequenciamento por espectrometria de massa, os contaminantes do manuseio e fabricação humana serão identificados. Neste protocolo, mostramos uma redução substancial no número de proteínas identificadas em 98% após a limpeza. As proteínas restantes foram quase exclusivamente compartilhadas entre os tubos vazios nunca usados e os tubos limpos. Esses resultados sugerem que as proteínas identificadas eram contaminantes da própria preparação proteômica ou elementos residuais da fabricação de tubos, não remanescentes do uso anterior. De longe, as três proteínas mais abundantes identificadas em ordens de magnitude nos tubos em branco e limpos foram a queratina humana tipo I (KRT1, KRT10, KRT9), encontrada no cabelo e na pele, geralmente reconhecida nesses tipos de preparações como contaminantes do manuseio humano (https://www.thegpm.org/crap/). Nove das 18 proteínas compartilhadas eram outras queratinas. Também incluída como um contaminante humano reconhecido está a dermcidina (DCD), uma proteína encontrada no suor humano14. Outras proteínas identificadas também são encontradas na epiderme (CSTA15, HRNR16, FLG217) ou previamente identificadas em ácaros (S100A7, S100A8, S100A9)18,19. Deve-se notar que um componente substancial da "poeira" é a pele humana20. As duas proteínas únicas identificadas nos tubos limpos foram implicadas em EVs, no entanto, são muito pequenas em comparação com outras proteínas EV identificadas 1,21. As proteínas identificadas nas amostras são consistentes com a preparação e indicam uma sobreposição muito clara entre tubos em branco e limpos, apoiando a reutilização.
Os EVs têm um papel importante nos processos biológicos, incluindo, mas não se limitando à comunicação célula-célula e à formação de mineralização biológica. Os EVs são onipresentes no corpo humano e são uma área de rápido crescimento da ciência básica devido ao seu potencial como biomarcadores, terapêuticas e fontes de informação sobre (pato)fisiologia. O enriquecimento dessas partículas para experimentação usando UC diferencial envolve tubos de policarbonato especializados. O uso único e o descarte desses termoplásticos contribuem para custos mais altos de consumíveis experimentais e para a carga global de poluição plástica. Aqui, apresentamos e validamos um protocolo para limpeza e reutilização de tubos de policarbonato UC para realizar isolamento EV adequado para experimentos proteômicos. Em última análise, isso reduzirá o desperdício produzido pelos laboratórios de EV e diminuirá o custo associado a esses experimentos.

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas delimitadas por bicamadas lipídicas liberadas de células que carregam cargas biologicamente ativas, como proteínas, e participam de vários processos biológicos, incluindo a comunicação célula-célula e a formação de mineralização biológica1. Essas partículas são encontradas em todos os fluidos e tecidos corporais, e suas atividades e usos biológicos são um campo de pesquisa científica em rápida evolução. O isolamento e a validação dessas nanopartículas apresentam vários desafios devido ao seu pequeno tamanho e biossimilaridade com outras partículas, como lipossomas e agregados proteicos. As diretrizes mais recentes da Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares, Informações mínimas para estudos de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018), são o padrão reconhecido para pesquisa científica EV2.
Vários métodos, geralmente em conjunto, devem ser usados para isolamento de EV, dependendo da fonte upstream e das aplicações downstream. A partir de 2015, o método de isolamento primário mais comum para EVs foi a ultracentrifugação diferencial (UC)2. Em princípio, a centrifugação inicial de baixa velocidade separa componentes indesejados maiores ou mais densos, como células e detritos celulares, deixando EVs no sobrenadante. Posteriormente, a UC usa uma força centrífuga muito alta para expulsar e, assim, separar e purificar EVs de outras partículas menores ou menos densas, mas que também podem conter partículas densas não EV. A maioria dos protocolos costuma usar, em uma etapa ou outra, UC para isolar EVs de um fluido3. Além disso, o UC é usado em outros métodos de isolamento de EV, como a ultracentrifugação de gradiente de densidade (DGUC), que usa meios como OptiprepTM iodixanol e força centrífuga para separar EVs de acordo com sua densidade flutuante4. Existem outros métodos de isolamento EV3.
Considerando a compreensão em rápida evolução dos processos biológicos ditados pelas EVs e seu potencial como biomarcadores e informações sobre fisiopatologia, análises baseadas em descobertas, como proteômica, ganharam força 5,6,7,8. Os EVs são pequenos e, dependendo da fonte, têm baixo rendimento de proteína (<1 μg) quando comparados ao tecido total ou lisado celular. O isolamento de EVs para análise proteômica requer considerações especiais, como a remoção de contaminantes de proteínas não EV de líquidos ou tecidos a montante, a consideração da degradação da proteína EV durante o processo de isolamento e a utilização de métodos que criam soluções proteicas quimicamente compatíveis com a preparação de peptídeos e análises de espectrometria de massa.
Os consumíveis de laboratório de pesquisa geralmente são de plástico e descartáveis por natureza. Esses materiais de uso único contribuem para a crise global de poluição plástica e custos de consumíveis. Os tubos UC especializados de policarbonato e poliestireno são projetados para suportar as altas forças centrífugas necessárias para pellets EVs em aplicações de laboratório. Embora seja possível esterilizar e desinfetar tubos de UC para reutilização, a análise proteômica, especialmente aquelas de baixo rendimento de proteína, como EVs, requer atenção especial. Não apenas a remoção suficiente de proteína residual do uso anterior é fundamental, mas também deve ser considerada a compatibilidade química com espectroscopia de massa e contaminação por polímeros derivados de plástico.
Aqui apresentamos um protocolo de limpeza de tubos de policarbonato usando detergentes adequados para espectrometria de massas e realizamos experimentos para validar sua remoção bem-sucedida de proteína residual abaixo dos limites de detecção e falta de contaminantes poliméricos detectáveis. Para validar o protocolo de limpeza para aplicações proteômicas de EV usando os propósitos de UC e DGUC, obtivemos tubos de isolamentos de EVs de tecido de vasculatura humana com um protocolo combinado de UC e DGUC. Os tubos foram limpos usando o protocolo descrito, e o processo experimental foi repetido sem amostras comparando um tubo UC nunca usado em branco e um tubo UC limpo. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá o custo associado a tais experimentos.

<table><tbody><tr><td>Tubo de Policarbonato de Parede Espessa Aberto de 10 mL</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355630</td><td>tubo(s) de ultracentrífuga sem tampa&nbsp;</td></tr><tr><td>Garrafa de Policarbonato de 10,4 mL com Conjunto de Tampa</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355603</td><td>tubo(s) de ultracentrífuga com tampa&nbsp;</td></tr><tr><td>um Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 &micro; m x 70 mm; e uma coluna de HPLC EASY-Spray, 75 e micro; m x 250 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164946 e ES902</td><td>Configuração de coluna dupla</td></tr><tr><td>Cotonete crítico, cabeça de algodão</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td>cotonete</td></tr><tr><td>Exploris 480 frontal com fonte EASY-Spray, acoplado a uma bomba HPLC Easy-nLC1200.</td><td>Espectrômetro de massa</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>BRE725533</td></tr><tr><td>Banco de dados Human UniProt (101043 entradas, atualizado em janeiro de 2022)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Banco de dados humano</td></tr><tr><td>MilliQ água</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>água PreOmics iST kit &nbsp;</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>kit de preparação de amostra de proteína comercial&nbsp;</td></tr><tr><td>Descobridor de Proteoma &nbsp; pacote (PD, Versão 2.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>Software de busca proteômica</td></tr><tr><td>SEQUEST-HT algoritmo de busca&nbsp;</td><td>Algoritmo de</td><td>pesquisa</td><td>NA Sódio</td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfate (20%)</td> <td>Boston BioProducts</td><td>BM-230</td><td>detergente</td></tr></tbody></table>

reutilização de tubo de ultracentrífuga de policarbonato em análises proteômicas de vesículas extracelulares

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

Os plásticos de laboratório de uso único exacerbam a crise de poluição e contribuem para os custos de consumíveis. No isolamento de vesículas extracelulares (EV), tubos de ultracentrífuga (UC) de policarbonato são usados para suportar as altas forças centrífugas associadas. A proteômica EV é um campo avançado e faltam protocolos de reutilização validados para esses tubos. A reutilização de consumíveis para protocolos de isolamento de proteínas de baixo rendimento e proteômica downstream requer compatibilidade de reagentes com aquisições de espectroscopia de massa, como a ausência de contaminação de polímeros sintéticos derivados de tubos de centrífuga e remoção suficiente de proteínas residuais.
Este protocolo descreve e valida um método para limpeza de tubos de policarbonato UC para reutilização em experimentos de proteômica EV. O processo de limpeza envolve a submersão imediata dos tubos UC em H2O para evitar a secagem da proteína, lavagem em detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1%, enxágue em água quente da torneira, água desmineralizada e etanol 70%. Para validar o protocolo de reutilização do tubo UC para proteômica EV a jusante, os tubos usados foram obtidos após um experimento isolando EVs do tecido cardiovascular usando UC diferencial e separação de gradiente de densidade. Os tubos foram limpos e o processo experimental foi repetido sem amostras de EV, comparando tubos UC nunca usados em branco com tubos UC limpos. Os pellets pseudo-EV obtidos dos procedimentos de isolamento foram lisados e preparados para cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem usando um kit comercial de preparação de amostras de proteínas com modificações para amostras de proteínas de baixa abundância.
Após a limpeza, o número de proteínas identificadas foi reduzido em 98% no pseudo-pellet em comparação com a amostra de isolamento EV anterior do mesmo tubo. Comparando um tubo limpo com um tubo em branco, ambas as amostras continham um número muito pequeno de proteínas (≤20) com 86% de similaridade. A ausência de picos de polímero nos cromatogramas dos tubos limpos foi confirmada. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá os custos experimentais.

Para validar o protocolo de limpeza (Figura 1), foram realizados dois experimentos. Primeiro, o proteoma da "amostra simulada" do tubo limpo foi comparado com o proteoma da amostra EV do tecido do uso inicial do tubo para determinar o transporte de proteínas identificadas. Os cromatogramas representativos mostram uma redução no pico de heterogeneidade após a limpeza dos tubos (Figura 2). No isolamento EV original, 806 proteínas foram identificadas com dois ou mais peptídeos únicos. Após a limpeza, o número de proteínas identificadas foi reduzido em 98% para 19 proteínas. Doze proteínas foram compartilhadas em ambos, e sete proteínas eram exclusivas do tubo limpo (Figura 3A). Usando uma revisão da literatura, uma lista de proteínas EV características foi compilada conforme publicado anteriormente9. Das 24 proteínas EV características listadas identificadas na amostra original, apenas uma foi identificada após a limpeza (Tabela 1). Das proteínas compartilhadas, MFGE8, uma proteína EV característica foi a proteína mais enriquecida diferencialmente na amostra EV. Em comparação, duas proteínas contaminantes, KRT14 e KRT5, foram as mais enriquecidas diferencialmente na amostra pós-limpa ( Figura 3B ).
Para confirmar a remoção de proteína dos tubos após a lavagem, um gel SDS-PAGE foi realizado com uma curva padrão BSA de 1 μg (extremidade inferior típica do rendimento de isolamento EV) a 16,5 ng e, em seguida, pellets EV "simulados" de tubo em branco e limpo em triplicata. Todas as bandas curvas padrão eram visíveis, no entanto, as amostras não eram, indicando remoção de limpeza de pelo menos 98% da proteína e nenhuma diferença observável entre o tubo em branco e o limpo (Figura 4A). Para avaliar melhor as proteínas específicas identificadas nos tubos limpos em comparação com um tubo em branco nunca usado, foi realizada uma comparação direta (N = 4, grupo). Os cromatogramas dos tubos em branco e limpos foram muito semelhantes (Figura 4B). Nos tubos em branco nunca utilizados, foram identificadas 19 proteínas. Da mesma forma, no tubo limpo, 20 proteínas foram identificadas, com 18 compartilhadas dentro dos dois grupos (Figura 4C). Classificando todas as proteínas por sua abundância, as proteínas contaminantes da queratina KRT1, KRT9 e KRT10 são as mais abundantes em ambos os grupos (Figura 4D). No tubo limpo, uma proteína EV característica foi identificada: lactaderina (MFGE8). Houve alta semelhança entre os tubos limpos e os tubos em branco no número de eventos de sequenciamento MS2 acionados a cada 5 minutos de tempo de retenção (Figura 4E), o número de peptídeos sequenciados e a confiança em que foram sequenciados (Figura 4F), bem como grande sobreposição entre os peptídeos (Figura 4G). Tomados em conjunto, esses resultados não indicam nenhum impacto discernível da reutilização do tubo com este protocolo de limpeza no proteoma.
O monômero do policarbonato é 254,3 MH1+, que está abaixo da faixa de aquisição do MS1. Os cromatogramas foram avaliados quanto à presença de dímeros e trímeros carregados isoladamente, que não foram detectados (dados não mostrados, N = 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do protocolo de limpeza do tubo de ultracentrífuga de policarbonato. Abreviaturas: UC = ultracentrífuga; SDS = dodecil sulfato de sódio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig02.jpg"> Figura 2: Comparação representativa do proteoma da amostra EV anterior com a "amostra simulada" do tubo limpo (N = 2). Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TIC-MS = cromatografia de iões totais-espectrometria de massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig03v2.jpg"> Figura 3: Comparação das proteínas identificadas na amostra EV com a amostra "simulada" obtida dos tubos limpos. (A) Identificações de proteínas do diagrama de Venn no proteoma da amostra EV anterior com a "amostra simulada" do tubo limpo (N = 2). (B) Enriquecimento diferencial de proteínas compartilhadas classificadas por log 2 vezes a mudança. Abreviatura: EV = vesícula extracelular, FC = mudança <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig03largev2.jpg" target="_blank">de dobra Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig04.jpg"> Figura 4: Comparação de tubos nunca usados em branco com tubos limpos. (A) Um gel SDS-PAGE foi realizado com uma curva padrão BSA de 1 μg a 16,5 ng e, em seguida, pellets EV "simulados" de tubo em branco e limpo em triplicata. (B) cromatogramas representativos para tubos em branco e limpos. (C) Diagrama de Venn das proteínas compartilhadas ou únicas de tubos vazios e limpos (N = 4). (D) Todas as proteínas identificadas em cada grupo classificadas de acordo com a abundância para (i) tubos em branco e (ii) limpos. Os valores medianos são plotados. (E) Histograma de todos os eventos desencadeados por MS2 por tempo de retenção somado por grupo (N = 4). (F) Número de IDs de peptídeos em cada grupo por confiança, onde os peptídeos de alta confiança são distintos dos peptídeos combinados intragrupo, onde a confiança de identificação é menor, mas reforçada pela correspondência com outros espectros, média / SD. (G) Número de peptídeos únicos e compartilhados entre os grupos. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TIC-MS = cromatografia de iões totais-espectrometria de massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Proteínas EV características encontradas na análise pré versus pós-limpeza do tubo UC. Abreviaturas: UC = ultracentrífuga; EV = vesícula extracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Um protocolo detalhado é fornecido para limpeza e reutilização de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar o isolamento de vesículas extracelulares adequado para experimentos proteômicos.

Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

Estudamos doenças cardiovasculares, especificamente o papel das vesículas extracelulares na calcificação patológica dos tecidos cardiovasculares, como válvulas e vasos sanguíneos. Pesquisadores do nosso grupo definiram recentemente métodos para extrair tecido e vesículas extracelulares aprisionadas do tecido cardiovascular fibrocalcificado para determinar seu perfil proteômico. Nosso grupo demonstrou que essas vesículas extracelulares contêm importante carga proteica para iniciar a calcificação em tecidos patológicos.Os tubos especializados usados na etapa de ultracentrifugação do isolamento de vesículas extracelulares podem ser limpos e esterilizados para reutilização. No entanto, a análise proteômica requer consideração especial, pois qualquer contaminação pode afetar muito os resultados a jusante. Aqui, validamos um protocolo para reutilização de consumíveis, especificamente tubos de ultracentrífuga de policarbonato para isolamento de vesículas extracelulares que são adequados para aplicações proteômicas de baixa entrada a jusante.Nosso protocolo é simples e eficaz e permitirá que os pesquisadores reduzam os custos de consumíveis e o desperdício normalmente associado a esses protocolos de isolamento.

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Research

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Biology

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Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares

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