Análise quantitativa da estabilização da membrana do retículo endoplasmático (MAM) associada às mitocôndrias em um modelo neural da doença de Alzheimer (DA)

Estamos tentando medir quantitativamente a estabilidade das membranas ER associadas às mitocôndrias de várias espessuras ou larguras de lacunas, o que é importante na regulação da fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a DA. Estudos recentes sobre membranas de ER associadas às mitocôndrias, muitas vezes chamadas de MAMs, descreveram-nas como um dos principais fatores no início da patologia amilóide no estágio inicial da DA. As descobertas levaram ao desenvolvimento de uma nova hipótese chamada hipótese MAM, que sugere que a DA é exclusivamente uma doença relacionada à MAM.

Nosso protocolo é o primeiro a fornecer uma ferramenta quantitativa para medir a estabilização do MAM em células vivas, que tem permanecido um desafio até agora. A maior vantagem do nosso protocolo é que ele usa a propriedade dinâmica intrínseca das mitocôndrias para medir quantitativamente as mudanças na estabilização do MAM ao apertar ou afrouxar as larguras das lacunas do MAM em células vivas.

Nosso foco no futuro imediato é melhorar e empregar nossa técnica de imagem de células vivas e quimográfica de última geração para rastrear uma série de moduladores de pequenas moléculas sintéticas ou naturais aprovados pela FDA de MAMs ou receptor sigma one ligado a MAM, usando uma plataforma de triagem de drogas para DA recentemente desenvolvida e entender seu mecanismo de ação.

[Narrador] Para transfectar as células com estabilizadores MAM, substitua a mistura mononuclear da medula óssea por dois mililitros de meio DMEM-F12 à temperatura ambiente em cada poço. Combine o reagente nucleofector com o suplemento um em uma proporção de 4,5 para um. Adicione 100 microlitros do reagente nucleofector à mistura. Em seguida, vórtice a solução de DNA. Adicione de um a cinco microgramas de DNA por tratamento em tubos de microcentrífuga separados de um mililitro para cada transfecção. Depois de aspirar o meio existente das células, lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS. Aspire o PBS e adicione um mililitro de accutase diretamente nas células. Incube as células por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, bata suavemente na lateral do prato para desalojar as células. Sob um microscópio, verifique se as células estão soltas e fluindo livremente. Neutralize os agudas com 10 mililitros de meio DMEM-F12 e transfira a suspensão celular para um tubo limpo de 15 mililitros. Em seguida, pegue 10 microlitros das células suspensas e adicione-as ao lado A de uma câmara de contagem de células. Em seguida, insira o lado A da câmara cheia no slot principal na frente do contador de células. Pressione medir e registrar o número de células por mililitro. Centrifugar o número necessário de células a 300 G durante cinco minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100 microlitros de mistura de nucleofector para cada electroporação. Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão celular ressuspensa a um dos tubos contendo DNA. Misture pipetando a solução várias vezes. Em seguida, transfira a mistura de células de DNA para uma cubeta de eletroporação e sele-a com a tampa fornecida. Selecione o programa nucleofector apropriado no dispositivo. Adicione imediatamente aproximadamente 500 microlitros de DMEM de uma placa pré-cheia de seis poços na cubeta usando pipetas estéreis. Misture delicadamente uma vez e transfira as células eletroporadas e o meio para o poço correspondente. Para começar, coloque a placa de seis poços contendo células na câmara do microscópio e ajuste o foco do microscópio até que as células se tornem visíveis. Para capturar o sinal da proteína fluorescente vermelha, excite o fluoróforo usando um laser de 594 nanômetros e defina a emissão para 570 a 640 nanômetros. Para proteína fluorescente verde, use um laser de 488 nanômetros para excitação com emissão de 510 a 540 nanômetros. Corte a área de varredura para caber ao redor do axônio. Uma área de digitalização menor reduzirá o tempo de processamento e simplificará a geração de quimografia. Defina o intervalo para um quadro por segundo e a duração total para 181 segundos. Clique em executar para iniciar o processo. A velocidade axonal das mitocôndrias ligadas ao ER marcadas com MAM 1X foi reduzida em 50% em comparação com as mitocôndrias livres e ligadas ao MAM 9X. 26,6% das mitocôndrias MAM 1X eram móveis versus 53,82% das mitocôndrias livres e 44,79% das mitocôndrias MAM 9X. O movimento retrógrado foi menor para as mitocôndrias MAM 1X do que para as mitocôndrias Mito-RFP e as mitocôndrias MAM 9X. O movimento anterógrado das mitocôndrias MAM 1X também foi reduzido em relação ao Mito-RFP. A porcentagem estacionária de mitocôndrias MAM 1X foi significativamente maior do que as mitocôndrias MAM 9X, refletindo uma redução na motilidade, enquanto a velocidade geral das mitocôndrias MAM 1X foi significativamente menor do que as mitocôndrias MAM 9X.