Name: Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio em organoides intestinais humanos infectados por vírus usando indicadores codificados geneticamente. Este método permite estudar sinalização celular em tecido epitelial vivo.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) do National Institutes of Health (NIH). O apoio aos estagiários foi fornecido pelos F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Gostaríamos de agradecer ao Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core por fornecer o meio de manutenção de organoides.

Imagem de cálcio de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
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<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
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<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Alterações nos níveis citosólicos de Ca2+ podem ser causa e efeito de patologias do epitélio 10,16,17. O aumento do cálcio citosólico pode direcionar diretamente a secreção via ativação do canal de cloreto cálcio-dependente TMEM16A18,19. A ativação do TMEM16A em resposta ao Ca2+ permite o efluxo apical de cloreto, estabelecendo um gradiente osmótico que promove a secreção de fluidos20,21. Além disso, aumentos de Ca2+ dentro das células enteroendócrinas desencadeiam a liberação de serotonina, que estimula neurônios sensoriais aferentes que podem modular a atividade dentro do sistema nervoso entérico22. Os sinais de Ca2+ também podem modular as tight junctions para influenciar a função de barreira23,24 e regular a proliferação em células-tronco intestinais25. Assim, a desregulação do Ca2+ pode ter efeitos amplos e de longo alcance.
Muitos vírus manipulam Ca2+ citosólico para criar um ambiente celular propício à replicação26. O rotavírus é um excelente exemplo disso dentro do epitélio intestinal27. A proteína não-estrutural 4 do rotavírus (NSP4) é um canal condutor de Ca2+ que permite o efluxo de Ca2+ do retículo endoplasmático para o citosol28,29. Isso estimula a autofagia e auxilia a montagem do capsídeo externo 30,31,32. A infecção por rotavírus também induz a liberação de ADP, desencadeando ondas intercelulares de Ca2+ que contribuem para a patogênese17. Outros vírus entéricos, incluindo calicivírus e enterovírus, codificam viroporinas condutoras de Ca2+ que desencadeiam desregulação semelhante de Ca2+ dentro das células infectadas33,34.
A imagem de células vivas Ca2+ de organoides intestinais humanos oferece uma plataforma versátil para estudar a sinalização induzida por vírus dentro do epitélio. No entanto, a força das conclusões tiradas dos dados de imagem depende, inextricavelmente, da saúde e da qualidade das HIOs, dos parâmetros de imagem apropriados e de uma abordagem analítica sólida.
A transdução lentiviral eficiente é muitas vezes o passo limitante ao estabelecer novas linhagens HIO, mas lentivírus de alto título e transduções múltiplas ajudam a garantir expressão suficiente de transgenes. É importante ressaltar que isso terá que ser equilibrado com o potencial de estresse celular significativo na transdução. Isso na maioria das vezes é temporário e diminui após a seleção e várias passagens. No entanto, é fundamental que os HIOs projetados para expressar GECIs apresentem crescimento e proliferação normais antes de iniciar os experimentos. Da mesma forma, dispersar HIOs tridimensionais e reformá-los como monocamadas induz estresse celular. É uma boa prática permitir três ou mais dias para que as monocamadas se adaptem após o revestimento. O revestimento das placas com colágeno IV é fundamental para a integridade da monocamada 35,36. Aliquotar colágeno IV e armazenar a -80 °C entre os usos ajuda a garantir a aderência da monocamada. Determinar a densidade de semeadura ideal para cada linha HIO também pode ajudar a melhorar a consistência. Finalmente, incluir os controles adequados, e compará-los entre experimentos, é indispensável para garantir que qualquer observação represente uma resposta à variável em questão, em vez de um confundidor técnico.
Embora a pontuação de uma monocamada possa causar danos celulares indesejados, aumenta muito a infecção por RV de HIOs 2D. A Figura 2 ilustra isso, pois quase todas as células infectadas estão diretamente adjacentes ao risco. Evidências experimentais sugerem que o VR infecta mais eficientemente a superfície basolateral das células epiteliais intestinais37. Assim, prevê-se que a pontuação de uma monocamada aumenta a infectividade pela exposição da superfície basolateral. A infecção eficiente da monocamada também pode ser obtida pelo plaqueamento de HIOs em membranas de policarbonato suspensas em poços contendo meio de cultura, que permitem o acesso à superfície basolateral. No entanto, a distância relativamente longa entre a placa e a membrana de policarbonato, a própria membrana de policarbonato e a superfície plástica na base do poço as tornam inadequadas para imagens de epifluorescência. Assim, o método de pontuação descrito neste protocolo continua sendo a abordagem favorecida. Dado que a pontuação em si pode levar a perturbações de sinalização, a inclusão do controle pontuado não infectado é fundamental para a interpretação. Para vírus, como o norovírus humano, que infectam eficientemente através da membrana apical, não é necessário pontuar a monocamada38.
Como acontece com qualquer sistema de imagem ao vivo, a fototoxicidade pode facilmente confundir experimentos utilizando monocamadas HIO. Ao longo de um experimento de imagem, é importante monitorar vacuolização inesperada, blebbing da membrana ou outros indicadores morfológicos de estresse39. Se algum desses sinais for detectado, a duração, frequência ou poder de excitação devem ser reduzidos. Aumentar a relação sinal-ruído geralmente vem às custas da saúde celular a longo prazo, portanto, otimizar empiricamente os parâmetros é crucial. O fotoclareamento, como indicado por uma diminuição na intensidade basal da fluorescência ao longo do tempo, é um prenúncio de estresse celular e deve ser evitado.
A visualidade dos dados de imagem pode levar os investigadores a privilegiar análises qualitativas em detrimento das quantitativas. No entanto, como em qualquer modalidade, conclusões reprodutíveis requerem quantificação. A análise quantitativa de imagens contém muito mais complexidade do que pode ser abordada em um único manuscrito, mas vale a pena destacar alguns pontos-chave. Primeiro, a quantificação consistente requer aquisição consistente. Um pipeline de análise desenvolvido para um determinado conjunto de parâmetros de aquisição pode não ser eficaz para imagens adquiridas em diferentes frequências, tempos de exposição, potências do laser ou comprimentos de onda. Em segundo lugar, a multiplicidade de infecções tem uma influência descomunal na frequência de sinais de cálcio induzidos por vírus. Como tal, é importante avaliar o número de células infectadas por campo de visão e garantir a consistência entre as condições de tratamento. Como alternativa, normalizar a frequência do sinal para o número de células infectadas por campo de visão pode ajudar a reduzir o erro. Finalmente, enquanto o indicador de cálcio baseado em mNG (NEMO) recentemente desenvolvido oferece uma abordagem promissora para determinar as concentrações absolutas de Ca2+ em células40, a maioria dos biossensores transmite apenas informações relativas sobre sistemas biológicos. Assim, a subtração em segundo plano, a normalização e a comparação com um controle são críticas.
Embora este protocolo se concentre na imagem de cálcio durante a infecção viral, a abordagem geral é prontamente adaptável. A infecção viral pode ser facilmente substituída por uma condição de tratamento alternativa, e há uma ladainha cada vez maior de biossensores para monitorar muitas vias e processos celulares diferentes. Com qualquer adaptação de protocolo, os pesquisadores devem manter a análise em primeiro lugar, projetando experimentos com resultados claros e quantificáveis.
Em geral, a imagem ao vivo fornece resolução temporal incomparável, melhorando a caracterização de processos altamente dinâmicos. A incorporação de organoides em experimentos de imagem ao vivo permite a observação desses processos em um modelo fiel ao tecido, fisiologicamente relevante. Esperamos que o protocolo aqui descrito facilite o planejamento e a otimização experimental, capacitando os pesquisadores a descobrir novos aspectos da sinalização celular e tecidual.

O cálcio é um segundo mensageiro amplamente conservado que desempenha um papel crítico na regulação da fisiologia celular1. Dada a sua forte carga, tamanho pequeno e alta solubilidade em condições fisiológicas, o cálcio é um manipulador ideal da conformação proteica. Isso torna o cálcio um meio poderoso para transduzir sinais eletroquímicos em alterações enzimáticas, transcricionais ou pós-transcricionais. Os rígidos gradientes de concentração de cálcio através do retículo endoplasmático (RE) e membranas plasmáticas criam uma alta força motriz que permite mudanças rápidas na concentração citosólica de cálcio. Vários mecanismos, incluindo buffering e transporte ativo, mantêm firmemente esse gradiente. Embora necessária para as funções celulares normais, essa manutenção é energeticamente cara, tornando-a particularmente suscetível em estados de estresse 2.
Como tal, a desregulação do cálcio dentro do citosol é um sinal quase universal de muitos tipos de estresse celular. Distúrbios metabólicos, toxinas, patógenos, danos mecânicos e perturbações genéticas podem interromper a sinalização do cálcio. Independentemente do estímulo, em nível de células inteiras, elevações sustentadas e descontroladas do cálcio citosólico podem promover apoptose e, eventualmente, necrose 3,4. Alterações nos níveis citosólicos de cálcio de menor amplitude ou maior frequência, entretanto, têm efeitos variáveis2. Da mesma forma, os resultados das flutuações do cálcio podem diferir com base no microdomínio espacial em que ocorrem5. O monitoramento dos níveis de cálcio pode, portanto, oferecer informações sobre processos dinâmicos de sinalização, mas isso requer amostragem com resolução temporal e espacial relativamente alta.
Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) são ferramentas poderosas para amostragem contínua em sistemas de células vivas6. Algumas das GECIs mais utilizadas são as proteínas fluorescentes responsivas ao cálcio baseadas em GFP, conhecidas como GCaMPs7. A GCaMP canônica é uma fusão de três domínios proteicos distintos: uma GFP circularmente permutada (cpGFP), calmodulina e M136. O domínio da calmodulina sofre uma mudança de conformação ao se ligar ao cálcio, permitindo sua interação com M13. A interação calmodulina-M13 induz uma mudança conformacional na cpGFP que aumenta sua emissão fluorescente após excitação. Como tal, um aumento na concentração de cálcio correlaciona-se com um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP. Esses sensores podem ser citosólicos ou direcionados para organelasespecíficas8.
Semelhante à maioria dos tecidos, o cálcio regula uma variedade de funções dentro do epitélio gastrointestinal. O epitélio intestinal é essencial para a absorção de nutrientes e fluidos, mas também deve formar uma barreira apertada e interface imunológica para evitar a invasão de patógenos ou insultos tóxicos. As vias dependentes de cálcio influenciam quase todas essas funções vitais 9,10,11. No entanto, a sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal permanece uma fronteira pouco explorada com potencial promissor como alvo terapêutico. Enquanto o monitoramento da dinâmica do cálcio no epitélio intestinal in vivo continua a apresentar desafios, os organoides intestinais humanos (HIOs) oferecem um sistema ex vivo adaptável para experimentação12. As HIOs são esferoides tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco intestinais humanas e, ao serem diferenciadas, recapitulam grande parte da diversidade celular do epitélio intestinal nativo12.
Este protocolo descreve métodos abrangentes para projetar HIOs que expressam GECIs e, em seguida, preparar HIOs projetados como monocamadas para imagens de cálcio de células vivas. Ele oferece a infecção viral como um exemplo de manipulação patológica que interrompe a sinalização de cálcio e fornece uma abordagem analítica para quantificar essas alterações.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0,05% de tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldeído</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td>Agulha de 25 calibres <td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicocítico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico&nbsp;</td><td>Suplemento</td><td>Gibco 15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Gibco</td><td></td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>Lâmina de Cultura de Células CellView, PS, 75/25 MM, Fundo de Vidro, 10 compartimentos</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico humano</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td> <td>(variável)</td><td></td></tr> <tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231 / CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Placas de 24 poços tratadas com cultura de células</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express, sem vermelho de fenol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>Biochemical NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

A sinalização de cálcio é um regulador integral de quase todos os tecidos. Dentro do epitélio intestinal, o cálcio está envolvido na regulação da atividade secretora, dinâmica da actina, respostas inflamatórias, proliferação de células-tronco e muitas outras funções celulares não caracterizadas. Como tal, o mapeamento da dinâmica de sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal pode fornecer informações sobre os processos celulares homeostáticos e revelar respostas únicas a vários estímulos. Os organoides intestinais humanos (HIOs) são um modelo de alto rendimento, derivado do ser humano, para estudar o epitélio intestinal e, portanto, representam um sistema útil para investigar a dinâmica do cálcio. Este artigo descreve um protocolo para transduzir HIOs de forma estável com indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), realizar microscopia de fluorescência ao vivo e analisar dados de imagem para caracterizar significativamente os sinais de cálcio. Como um exemplo representativo, HIOs 3-dimensionais foram transduzidos com lentivírus para expressar de forma estável GCaMP6s, um GECI citosólico baseado em proteína fluorescente verde. Os HIOs projetados foram então dispersos em uma suspensão de célula única e semeados como monocamadas. Após a diferenciação, as monocamadas de HIO foram infectadas com rotavírus e/ou tratadas com drogas conhecidas por estimular uma resposta de cálcio. Um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmara de imagem viva umidificada e com temperatura controlada permitiu a obtenção de imagens de longo prazo de monocamadas infectadas ou tratadas com drogas. Após a aquisição de imagem, as imagens adquiridas foram analisadas usando o software de análise disponível gratuitamente, ImageJ. De modo geral, este trabalho estabelece um pipeline adaptável para caracterizar a sinalização celular em HIOs.

A Figura 1A mostra uma cúpula de BMM contendo organoides intestinais humanos tridimensionais que foram transduzidos para expressar GCaMP6s de forma estável. A Figura 1B mostra a mesma linha de organoide replaqueada como monocamada 24, 48 e 72 h pós-semeadura. Para validar a função das GCaMP6s, a monocamada foi imageada por microscopia de fluorescência a cada 2 s por 4 min, e 100 nM de ADP foram adicionados ao meio após ~20 s. O ADP provoca a liberação de cálcio do retículo endoplasmático, aumentando o cálcio citosólico. A intensidade de fluorescência detectada no canal de 488 nm a cada exposição é plotada na Figura 1C. O traçado mostra uma intensidade de fluorescência basal constante seguida por um rápido aumento após a adição de ADP e um retorno gradual em direção à linha de base. Um controle de veículo é incluído para verificar se a resposta é um verdadeiro evento de sinalização, e não meramente uma mudança na intensidade da fluorescência que pode surgir da adição de meios.
A pontuação de uma monocamada HIO aumenta a eficiência da infecção por rotavírus. Embora as técnicas de pontuação variem, é mais fácil obter infecção consistente usando um único escore ao longo do comprimento da monocamada, como mostrado na Figura 2A. Quando se utilizam cepas recombinantes de rotavírus que expressam proteínas fluorescentes, a infecção pode ser verificada durante imagens ao vivo (Figura 2B). Ao usar uma cepa que não expressa um marcador, a infecção pode ser detectada por imunofluorescência após exames de imagem. Dada a motilidade das células em monocamadas HIO, muitas vezes é difícil rastrear uma única célula infectada ao longo do tempo. Em vez disso, use a coloração de ponto de extremidade como um método para verificar a infecção e confirmar se a multiplicidade de infecção é combinada entre os campos de visão (Figura 2C).
As ondas de cálcio intercelulares nas HIOs podem ser observadas qualitativamente, como ilustrado na Figura 3A. No entanto, a determinação da frequência das ondas de cálcio em um determinado campo de visão requer análise quantitativa. As etapas de sucesso da segmentação, descritas na etapa 6 do protocolo acima, estão ilustradas na Figura 3A. A figura mostra a imagem bruta (Figura 3Ai), a imagem após as intensidades de pixel do quadro anterior terem sido subtraídas (Figura 3Aii), depois a onda de cálcio segmentada (Figura 3Aiii).
Uma vez que as ondas de cálcio tenham sido segmentadas e quantificadas para cada campo de visão ao longo da execução da imagem, é frequentemente informativo comparar a frequência das ondas em monocamadas expostas a várias condições. O gráfico de tiras da Figura 3B mostra o número total de ondas de cálcio por campo de visão em monocamadas simuladas e inoculadas com rotavírus. Este exemplo inclui duas cepas de RV: uma cepa de rotavírus humano (Ito HRV) e uma cepa recombinante de rotavírus símio SA11 que expressa mRuby (SA11-mRuby). O controle simulado é tomado como a frequência basal da onda de cálcio, as monocamadas infectadas por rotavírus não tratadas servem como controles positivos, e as monocamadas infectadas por rotavírus e tratadas são as condições experimentais. Monocamadas simuladas e infectadas por RV tratadas com drogas, incluindo o inibidor do receptor de ADP, BPTU, podem então ser comparadas a ambas as condições de controle por ANOVA de uma via. Os dados sugerem que a BTB efetivamente diminui a frequência das ondas de cálcio intercelulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Figura 1: Validação da expressão de GCaMP6s em organoides intestinais jejunais humanos. (A) Após a transdução do lentivírus, as HIOs que expressam GCaMP foram submetidas à seleção e múltiplas passagens, mostradas aqui aos 7 dias desde a passagem mais recente. Após estimulação com o laser de 488 nm, a expressão de GCaMP6s é evidente nos HIOs transduzidos plaqueados em matriz de membrana basal de 15 μL como esferoides (Ai) tridimensionais. Exposições de 50 ms foram adquiridas a 50% de potência do laser usando uma objetiva de 20x e, em seguida, costuradas para visualizar toda a cúpula da matriz da membrana basal. Processo semelhante foi realizado utilizando exposições de campo claro (Aii) de 4 ms. Na imagem de campo claro, os HIOs escuros no centro da cúpula são uma indicação de que as culturas estão prontas para a passagem. (B) Os HIOs foram digeridos enzimaticamente em uma suspensão unicelular e, em seguida, replaqueados a uma densidade de 150.000 células por poço (5mm de diâmetro) de uma placa de fundo de imagem pré-revestida com colágeno IV. Em 72 h pós-semeadura, a monocamada estava confluente e pronta para aplicações downstream. Para validar a função do GCaMP, as imagens foram adquiridas usando o conjunto de filtros de 488 nm com exposições de 50 ms a 50% de potência do laser a cada 2 s por 4 min. (C) Os traços mostrados aqui representam a intensidade de fluorescência de campo inteiro normalizada para a primeira aquisição ao longo da imagem. Por volta dos 20 s (seta), após a décima exposição, 100 nM de adenosina difosfato (ADP) foi adicionado para provocar uma espícula de cálcio citosólico (vermelho). A adição de um volume igual de 1x PBS não provocou uma resposta significativa (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Figura 2: Pontuação de uma monocamada HIO para facilitar a infecção do VD. (A) A figura ilustra uma técnica adequada para marcar uma monocamada usando uma agulha 25G. (B) Uma monocamada HIO foi infectada com uma cepa recombinante de RV que expressa a proteína fluorescente mRuby (magenta, seta), permitindo a identificação de células infectadas. Alternativamente, ao usar uma cepa natural de RV, as células infectadas podem ser identificadas por imunofluorescência. (C) As imagens mostradas são de 4 diferentes monocamadas de HIO após fixação, coloração DAPI (azul) e marcação de anticorpos do antígeno de rotavírus (magenta). Ambas as técnicas ilustram a infecção preferencial do VD próxima à porção pontuada da monocamada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Figura 3: Segmentação e quantificação das ondas de cálcio intercelulares induzidas por VR. As exposições de 488 nm de HIOs infectadas por RV expressando GCaMP6s foram adquiridas a cada 1 min por 16 h usando o protocolo. (A) A figura ilustra o processo de segmentação da onda de cálcio intercelular. Primeiro, os valores de pixel da aquisição anterior (t-1) são subtraídos de cada imagem bruta (Ai) para quantificar a mudança na intensidade da fluorescência (Aii). Um limite baseado em um aumento mínimo de intensidade otimizado experimentalmente em relação ao quadro anterior é então aplicado. As imagens são então filtradas para uma área mínima de sinal contíguo para selecionar ondas de cálcio intercelulares (Aiii) e excluir sinais de cálcio de célula única. Este processamento permite a quantificação das ondas de cálcio em cada campo de visão. Neste experimento, monocamadas foram infectadas simuladamente, infectadas com a cepa ITO de rotavírus humano (HRV), ou infectadas com uma cepa recombinante de rotavírus símio que codifica mRuby no segmento gênico 7, a jusante da proteína não-estrutural 3 (SA11-mRuby). As monocamadas infectadas foram tratadas com o inibidor do receptor de ADP BPTU ou não tratadas. As monocamadas foram então imageadas em 8 posições diferentes, e as ondas de cálcio em cada campo de visão foram quantificadas usando o pipeline descrito neste protocolo. Os pontos no gráfico de tiras indicam o número de ondas de cálcio detectadas em cada posição sobrepostas a um gráfico de barras marcando a média e o DS. A ANOVA de uma via seguida pelos testes de Dunnett mostra que, enquanto qualquer cepa de VR aumenta a frequência de ondas de cálcio intercelulares acima daquela do grupo não infectado, o tratamento com BTB impede o aumento mediado por RV na frequência da onda de cálcio. **p<0,01, ***p<0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Transdução</td>
			<td>Controle</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (estoque de 1 mM)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Polibreno (estoque de 1 mg/μL)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Lentivirus</td>
			<td>variável*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *ver notas</td>
			<td>até 400 μL</td>
			<td>até 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Meio de transdução de lentivírus. Preparar o meio de transdução e o meio de controle combinando os reagentes nos volumes indicados na segunda e terceira colunas, respectivamente. Visar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 unidades de transdução de lentivírus por célula. Para LV embalado internamente, isso geralmente requer ~25-50 μL de LV concentrado. O título da maioria dos LV embalados comercialmente será fornecido com o Certificado de Análise.
Arquivo de codificação suplementar 1: Script de macro ImageJ para permitir a quantificação de ondas de cálcio por processamento em lote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve uma abordagem para a realização de imagens de cálcio em organoides intestinais humanos infectados por vírus e oferece uma abordagem para análise.

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Através do nosso trabalho, pretendemos entender como os vírus interrompem a sinalização dentro do epitélio intestinal. Estamos particularmente interessados em entender as maneiras pelas quais as células infectadas por vírus desregulam as células vizinhas não infectadas para contribuir para a patogênese. Descobrimos recentemente que as células infectadas por rotavírus liberam pulsos de ADP, que desregula as células vizinhas não infectadas e facilita a disseminação viral e agrava a doença.Embora a imagem do cálcio seja muito popular em campos como a neurociência, ela não tem sido amplamente usada para estudar a biologia epitelial ou virologia. Este protocolo oferece uma abordagem para adaptar tecnologias existentes e sistemas modelo para estudar a sinalização de cálcio e tecido epitelial vivo infectado por vírus. Através da engenharia de organoides para expressar indicadores de cálcio codificados geneticamente, nossa abordagem permite uma imagem consistente e reprodutível a longo prazo em um sistema modelo que recapitula a diversidade celular do epitélio intestinal humano.Nosso objetivo é entender os efeitos da sinalização purinérgica parácrina induzida por vírus tanto para o hospedeiro quanto para o vírus. Nosso trabalho futuro também determinará se esse tipo de sinalização é amplamente conservado em outros vírus e se os efeitos são semelhantes.

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