Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais
29 de março de 2024
Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.
Estamos desenvolvendo e otimizando modelos organoides para aplicá-los na modelagem de doenças. Nosso objetivo é entender o mecanismo molecular subjacente ao desenvolvimento e progressão da doença, e estamos trabalhando em estreita colaboração com o Laboratório Nikolaus Rajewsky, que está desenvolvendo e aplicando as tecnologias espaciais e de célula única para entender como o RNA regula a expressão gênica na saúde e na doença. Nos últimos anos, os organoides cerebrais surgiram como plataformas experimentais e translacionais para estudar doenças específicas do paciente.
Portanto, não é surpreendente que os desenvolvimentos mais recentes tenham visado melhorar a complexidade dos modelos organoides cerebrais. Por exemplo, agora somos capazes de gerar organoides específicos da região do cérebro e também usar organoides cerebrais para montagens de vários organoides. Além disso, vários métodos foram implementados para introduzir vascularização e células imunes em organoides cerebrais.
Atualmente, uma das tecnologias mais avançadas em pesquisa que estamos usando neste laboratório é a transcriptômica espacial, que permite a avaliação da expressão gênica dentro do tecido intacto. Isso é crucial para entender como os perfis de expressão gênica de diferentes tipos de células variam em diferentes regiões dentro de um tecido. Outro avanço recente que foi feito é a multiômica de célula única, que permite a análise de vários módulos de uma única célula, o que dá uma abordagem mais holística na análise dessas células.
Empregamos organoides cerebrais e métodos transcriptômicos espaciais e de célula única para entender os mecanismos subjacentes de doenças humanas, como a síndrome de Leigh e a encefalite por herpes simplex. Além disso, desenvolvemos métodos de transcriptômica espacial de alta resolução e custo-benefício chamados Open-ST. Comparamos e otimizamos o método de sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único para entender o desempenho deles em relação à recuperação do tipo de célula no tecido organoide cerebral.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo abrangente para a geração de organoides cerebrais humanos e sua análise por meio de sequenciamento de RNA de única célula. A pesquisa tem como objetivo aprimorar a modelagem de doenças por meio de técnicas avançadas de organoides.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Tecnologia de Organoides
- Sequenciamento de RNA
Antecedentes
- Os organoides cerebrais servem como plataformas para o estudo de doenças específicas de pacientes.
- Avanços recentes concentram-se no aumento da complexidade dos modelos de organoides.
- A colaboração com o laboratório de Nikolaus Rajewsky aprimora a compreensão da regulação do RNA.
- Os organoides podem ser gerados para representar regiões cerebrais específicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver modelos de organoides para a modelagem de doenças.
- Investigar os mecanismos moleculares do desenvolvimento e progressão de doenças.
- Aprimorar a complexidade dos modelos de organoides cerebrais para obter melhores resultados em pesquisas.
Métodos Utilizados
- Geração de organoides cerebrais humanos.
- Sequenciamento de RNA de célula única para análise.
- Colaboração com laboratórios especializados para técnicas avançadas.
- Montagens de múltiplos organoides para estudos abrangentes.
Principais Resultados
- Geração bem-sucedida de organoides específicos de regiões cerebrais.
- Compreensão aprimorada do papel do RNA na expressão gênica.
- Desenvolvimento de sistemas multiorganoides para modelagem de doenças complexas.
- Conhecimentos sobre os mecanismos moleculares das doenças.
Conclusões
- Os organoides cerebrais são valiosos para o estudo dos mecanismos das doenças.
- Modelos avançados de organoides podem levar a uma melhor compreensão das doenças.
- Colaboração e integração tecnológica são fundamentais para o progresso.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A transcriptômica de célula única e de núcleos únicos em organoides cerebrais permite o mapeamento de alta resolução da diversidade celular e da expressão gênica, apoiando diretamente a modelagem de doenças e a redução de riscos mecanicistas em neurobiologia. Essas abordagens fornecem confiança preditiva para a validação de alvos e a investigação de vias em fases iniciais de descoberta, especialmente para tecidos complexos e heterogêneos. A integração desses métodos nos fluxos de P&D acelera insights translacionais e decisões de portfólio ajustadas a riscos na descoberta de fármacos para o SNC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias relevantes para doenças e da heterogeneidade celular em modelos cerebrais derivados de humanos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao resolver tipos celulares neuronais e não neuronais em resolução unicelular.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao associar perfis de expressão gênica a fenótipos de doenças.
- Melhora a confiança preditiva para avançar alvos ao longo do processo de descoberta.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara sistemas de organoides validados para triagem de compostos e genômica funcional posteriores.
- Padroniza protocolos de dissociação e isolamento de núcleos para garantir reprodutibilidade e saídas quantitativas.
- Permite a preparação escalonável de bibliotecas e fluxos de trabalho de sequenciamento para análise de alto rendimento.
- Fornece conjuntos de dados robustos para avaliação confiável de intervenções candidatas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha perfis transcriptômicos de organoides com biomarcadores relevantes para doenças, garantindo continuidade translacional.
- Permite a modelagem de distúrbios do SNC específicos ao paciente e à região em ambientes pré-clínicos.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular mecanismos moleculares a desfechos fenotípicos.
- Facilita a integração de multi-ômicas e transcriptômica espacial para modelagem abrangente de doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A transcriptômica de célula única e de núcleo único posiciona os organoides cerebrais como uma ponte, desde a descoberta inicial até a identificação de candidatos e a validação pré-clínica na pesquisa do sistema nervoso central.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao resolver a expressão gênica específica de tipos celulares.
- Triagem: Fornece saídas transcritômicas quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e priorização de compostos.
- Análises: Oferece conjuntos de dados de alta dimensão para análise comparativa de condições experimentais e modelos de doenças.
- Pesquisa Translacional: Alinha assinaturas moleculares em organoides com biomarcadores clínicos para aumentar a relevância translacional.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para modelagem diversificada de doenças do SNC e estudos mecanicistas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos para reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de pesquisa.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas no sistema nervoso central.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cultivo de organoides, dissociação e protocolos de sequenciamento de células únicas/núcleos únicos.
- Requer acesso a plataformas de sequenciamento baseadas em microfluídica e infraestrutura analítica avançada.
- Necessita padronização entre equipes para garantir comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes modelos de organoides ou contextos de doenças.
- Depende da preparação de amostras de alta qualidade para assegurar análises robustas em etapas subsequentes.
