Name: Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprenda a otimizar a microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas endógenas em Caenorhabditis elegans vivos. Este protocolo melhora a observação de dinâmicas neuronais em tempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Aprimorando a análise de transporte axonal em C. elegans vivos usando RAB-3 marcado com GFP

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
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<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas (22 mm x 22 mm, No1); Vidro de cobertura de vedação dourada</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio: microscópio invertido Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, câmera Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, objetiva de imersão em óleo Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, scanner de fotoestimulação Nikon a 488 nm com filtro de emissão ET525/36</td><td>Microscópio</td><td></td> confocal de disco giratório Nikon <td></td></tr><tr><td>&nbsp; NIS-elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software para Nikon Ti2&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas de microscopia simples pré-limpas</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de nematóides</td><td>Fonte do identificador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>Será depositado no CGC (https://cgc.umn.edu/)</td></tr></tbody></table>

otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em caenorhabditis elegans vivos

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Visão geral do sistema de modelo e procedimento de medição Para visualizar o transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas, rastreamos endogenamente GFP marcado com RAB-3. Aqui fazemos uso de uma cepa6 GFP::Flip-on::RAB-3 recentemente gerada, na qual a expressão da Flippase recombinase sob um promotor específico de célula (glr-4p) rotula RAB-3 endógena no neurônio motor DA9. DA9 é um neurônio motor bipolar, com seu corpo celular localizado na parte posterior do animal no lado ventral, próximo ao ânus (Figura 1A). Ele contém um dendrito curto que corre anteriormente ao longo do cordão nervoso ventral e um axônio longo que corre posterior, forma uma comissura e depois corre anterior ao longo do cordão nervoso dorsal, onde forma sinapses en passant que inervam o músculo dorsal e o neurônio VD22 , 23 , 24 . Visualizamos o transporte axonal na região assináptica; a maioria dos eventos de transporte pode ser capturada com um único plano focal (Figura 1A). Uma etapa inicial de fotobranqueamento é implementada para reduzir o fundo de vesículas estacionárias nessa área, que muitas vezes tendem a fazer uma pausa nessa região (Figura 1B). Vídeos de lapso de tempo são gravados em 3 minutos e o sinal RAB-3 ao longo da região assináptica é plotado em um quimógrafo para extrair eventos de transporte individuais (Figura 1C).
Ajustando o parâmetro de aquisição para otimizar a visualização do transporte axonal Para superar a baixa intensidade de sinal de muitas proteínas marcadas com fluorescência endogena, os parâmetros de aquisição do microscópio precisam ser otimizados. Para uma quantificação robusta dos eventos de transporte, a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais precisa ser o mais brilhante possível sobre o fundo citoplasmático ou a carga estacionária em pausa. Os precursores de vesículas sinápticas freqüentemente param na região assináptica em pools de vesículas distintos, o que interfere na detecção de novas vesículas recebidas e dificulta o acompanhamento de seus traços de transporte7.
Uma única etapa inicial de branqueamento de fluorescência pode reduzir fortemente o sinal de fluorescência derivado dos pools de vesículas para melhorar a detecção de movimento de novas vesículas recebidas (Figura 2A). A etapa de clareamento aumentou apenas levemente o sinal de movimento das vesículas RAB-3 sobre a intensidade de fundo citoplasmático, provavelmente porque a fração citoplasmática do RAB-3 é muito baixa (Figura 2D).
O uso de binning fornece uma camada adicional para melhorar o sinal em segundo plano de eventos de transporte individuais, combinando uma matriz de pixels em um único pixel. Um binning 2 x 2 reduzirá pela metade a resolução espacial (aqui de 108,33 nm / pixel para 216,7 nm / pixel), o que ainda é suficiente para rastrear partículas de transporte RAB-3 individuais (Figura 2B), mas melhora fortemente a intensidade do sinal de vesículas individuais (Figura 2D). A menos que seja necessária uma resolução espacial muito alta, o binning também pode ser aplicado para visualizar muitas outras cargas axonais.
Em seguida, perguntamos como as mudanças no tempo de exposição podem melhorar a intensidade do sinal de eventos de transporte único. Incluímos especialmente o tempo de exposição na análise para demonstrar também que o tempo de exposição de até 500 ms com 700 ms entre os pontos de tempo de imagem subsequentes ainda fornece uma resolução temporal na qual os precursores de vesículas sinápticas podem ser rastreados (Figura 2C, D).
Gerando e analisando quimógrafos com Fiji Para gerar um quimógrafo e analisar eventos de transporte individuais, siga as etapas da Figura 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do sistema modelo para visualizar o transporte axonal do RAB-3 fluorescente endógeno. (A) Painel superior: Visão geral do nematóide com o eixo póstero-anterior e ventral-dorsal indicado. O neurônio motor DA9 é rotulado em azul. Painel médio: Aumente o zoom da região encaixotada mostrada no painel superior com a compartimentalização DA9 indicada. As sinapses en passant são ilustradas em verde, * indica o ânus. Observe que o axônio continua no cordão nervoso dorsal até passar pela vulva. A caixa vermelha indica a região da zona assináptica. Painel inferior: Imagem de microscopia confocal de GFP endógena marcada com RAB-3 no axônio proximal em um único plano focal. Observe que existem sumidouros de vesículas de pausa mais longa do RAB-3 na região assináptica, embora a maioria dos sinais do RAB-3 se agrupe na região sináptica. A região assináptica está encaixotada em vermelho. Escala: 20 μm. (B) Imagens representativas de uma gravação de lapso de tempo para visualizar o transporte axonal. Para melhorar a rastreabilidade de partículas de transporte individuais sobre partículas estacionárias, a região assináptica é inicialmente fotobranqueada. Os painéis inferiores na região da caixa roxa mostram um exemplo de um evento de movimento anterógrado (ponta de seta laranja) e retrógrado (ponta de seta azul). Os painéis de cima para baixo representam pontos de tempo consecutivos. (C) A gravação de lapso de tempo em (B) foi plotada como um quimógrafo (representação 2D do tempo sobre a posição). As linhas diagonais representam eventos de movimento nos quais a inclinação indica a velocidade. As linhas verticais mostram eventos estacionários. A caixa roxa é um zoom do quimógrafo para destacar os eventos de transporte que também são mostrados em (B) e os eventos de transporte anterógrados (laranja) e retrógrados (azul) são rastreados. Linhas verticais tracejadas indicam os eventos de pausa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> Figura 2: Otimizando etapas e parâmetros de aquisição para melhorar a visualização da carga axonal endógena. GFP::RAB-3 endógeno foi visualizado na zona assináptica do axônio DA9 tirando imagens de um único plano focal em um microscópio confocal de disco giratório. Os quimógrafos foram adquiridos para visualizar eventos de transporte individuais na direção anterógrada (direita para esquerda) e retrógrada (esquerda para direita) (AC). (A) Os quimógrafos mostram eventos de transporte RAB3 sem (quimógrafos esquerdos) ou com uma etapa de branqueamento integrada. Observe que a etapa de branqueamento melhora a visualização de eventos de pausa (indicados por pontas de seta amarelas) entre eventos de transporte consecutivos (pontas de seta laranja). (B) A implementação do binning 2 x 2 ajuda a melhorar a intensidade do sinal de eventos de transporte RAB3 fracos. As imagens foram adquiridas no tempo de exposição de 300 ms e com (C) aumento incremental do tempo de exposição (de 100 ms na extrema esquerda para 500 ms na extrema direita) ajuda a melhorar a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais. As imagens foram adquiridas em binning 2 x 2 e usando uma etapa inicial de fotobranqueamento. Todos os quimógrafos exibem uma duração total de 3 min e são desenhados na mesma escala para que os quimógrafos com menos pontos de tempo de aquisição devido a um lapso de tempo mais longo entre pontos de imagem consecutivos tenham um comprimento total menor do quimógrafo. (D) Quantificação da intensidade do sinal por evento de transporte após subtração da fluorescência de fundo dos quimógrafos em (A-C). Observe que o binning e a etapa de branqueamento fotográfico foram adquiridos no tempo de exposição de 300 ms. Comparação estatística utilizando n eventos para 100 ms (neventos= 27 em nanimais= 2), 200 ms (neventos= 30 em nanimais= 2), 300 ms (neventos= 88 em nanimais= 6), 500 ms (neventos= 12 em nanimais= 1), 300 ms sem binning (n)eventos= 31 em nanimais= 3), 300 ms com binning (w) binning (neventos= 88 em nanimais= 6) e 300 ms, binning 2 x 2 com branqueamento (neventos= 88 em nanimais= 6) e sem branqueamento. Cada ponto de dados representa a intensidade do sinal de um evento de transporte RAB-3 individual após a subtração do fundo (citoplasma do axônio) em um único ponto de tempo ao longo de seu traço que foi escolhido aleatoriamente. O tempo de exposição foi comparado usando um teste de Kruskal-Wallis seguido de comparação múltipla de Dunn, binning e fotobranqueamento foram comparados usando um teste de Mann-Whitney pareado. As barras de erro indicam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> Figura 3: Procedimento passo a passo para gerar um quimógrafo e medir eventos de transporte individuais. (A) Depois de carregar a gravação de vídeo em Fiji, a ferramenta de linha segmentada é usada para traçar uma linha ao longo do comprimento do segmento axonal que será analisado. (B) Um quimógrafo (painel direito) é gerado usando o plug-in Kymoreslicewide com os parâmetros representados no painel esquerdo. (C) Os eventos de transporte individuais são rastreados com a ferramenta de linha linear e armazenados no gerenciador de ROI. O painel direito mostra as configurações de medição usadas para gerar a tabela de resultados. (D) Os resultados da tabela são usados para calcular o parâmetro de transporte. As caixas indicam parâmetros importantes que são descritos na seção de métodos do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

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O transporte intracelular de cargas, como vesículas ou organelas, é realizado por proteínas motoras moleculares que rastreiam microtúbulos polarizados. Este protocolo descreve a correlação da direcionalidade do transporte de partículas de carga individuais que se movem dentro dos neurônios, com a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras associadas.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para imagens da morfologia mitocondrial em múltiplos tecidos de C. elegans durante o envelhecimento.

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

Aqui, fornecemos instruções sobre como utilizar efetivamente o SegElegans, um sistema de aprendizado profundo que desenvolvemos para a segmentação automatizada de worms individuais em imagens de microscopia de campo amplo, para uso subsequente em software de análise de imagens, como o ImageJ. Fornecemos maneiras de usar o sistema online e offline.

Análise automatizada de imagens de fluorescência de C. elegans usando SegElegans

Aprenda a otimizar a microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas endógenas em Caenorhabditis elegans vivos. Este protocolo melhora a observação de dinâmicas neuronais em tempo real.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos (Vídeo) | JoVE Journal

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

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