Name: Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda microscopia intravital de dois fótons para estudar a entrega de nanopartículas de óxido de ferro em glioblastoma murino. Esta técnica permite visualizar em tempo real a distribuição terapêutica no cérebro.

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Gostaríamos de agradecer ao Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, ao Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - centro de imagens de pequenos animais, ao NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) e ao Stanford Preclinical Imaging Facility at Porter Drive por fornecer o equipamento e a infraestrutura para este projeto. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Saúde da Criança e Desenvolvimento Humano, bolsa número R01HD103638. Agradecemos ao Grupo Schnitzer, Universidade de Stanford; o laboratório Zuo, da Universidade de Santa Cruz; e o Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, para discussões educacionais sobre imagens de dois fótons e modelos de janela craniana.

Rastreamento em tempo real de nanopartículas em tumores cerebrais usando 2P-IVM em camundongos

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Apresentamos um método para rastreamento in vivo de NP em tempo real usando 2P-IVM através de uma janela craniana para avaliar a liberação tumoral de NPs de óxido de ferro marcadas com fluorescência. A técnica cirúrgica para este procedimento requer mão firme e habilidades cirúrgicas experimentais avançadas. É aconselhável praticar o uso de carcaças ou objetos simuladores antes de avançar para a experiência com animais vivos. Como alternativa, Hoeferlin e col. implementaram uma broca robótica para reduzir o dano térmico, minimizar a variabilidade da técnica cirúrgica e padronizar a cirurgia22.
O tamanho da janela representa outro parâmetro crítico. Uma janela maior permitiria a obtenção de imagens de uma porção maior do tumor com 2P-IVM. Na literatura, tamanhos entre 3-7 mm têm sido descritos23. No entanto, janelas maiores não podem acomodar a curvatura cerebral, o que pode levar ao aumento da pressão regional24. Para superar essa restrição, pode-se usar o chamado "crânio de vidro"25. Em comparação com as janelas de vidro tradicionais, este método usa vidro curvo, acomodando a curvatura do cérebro e, assim, permitindo a criação de janelas maiores, reduzindo a pressão focal no córtex. Este tipo de vidro curvo não está disponível comercialmente, e tem aplicações limitadas em 2P-IVM, uma vez que a superfície curva causa artefatos de reflexão, limitando a área da janela que poderia ser fotografada. Outra alternativa é uma janela à base de silício24. Por um lado, esse método oferece mais flexibilidade em relação ao tamanho e à forma da janela a ser criada. Além disso, resultados comparáveis em termos de falhas de janelas e taxas de inflamação às janelas de vidro clássicas foram relatados. Por outro lado, a qualidade da imagem de 2 fótons em janelas baseadas em polímeros diminuiu mais rapidamente do que em janelas de vidro, tornando-a inviável para aplicações de longo prazo26. Uma janela craniana de crânio afinada representa outra alternativa. Embora seja menos invasiva do que a janela de vidro clássica, não permite a implantação de células GBM usando a mesma técnica descrita aqui. Além disso, é difícil obter uma espessura craniana consistente e, como resultado, isso pode causar artefatos significativos na 2P-IVM27.
A linhagem celular e a quantidade de células GBM que estão sendo implantadas são outras considerações importantes no planejamento do cronograma do estudo. A linhagem celular de glioma de rato C6 é uma das linhagens celulares mais utilizadas na pesquisa do GBM. Em ratos e camundongos, números celulares entre 5 x 10,4 e 5 x 10,6 têm sido relatados para implantes intracranianos27,28,29,30,31. Como regra geral, ao implantar um número maior de células, o crescimento mais rápido do tumor é esperado. Neste protocolo, 1 x 105 células foram implantadas e imagens foram realizadas nos dias 11 e 12 após o implante. implantaram 1 x 105 células C6 em camundongos BALB/c nude e relataram a detecção de GBM avançado na RM no 7º dia pós-implantação e aumento da mortalidade após 15 dias30. Em comparação, Jia e col. utilizaram um número maior de células (1 x 106) e a mesma cepa de camundongo e detectaram uma pequena massa tumoral no 7º dia na RM com uma barreira hematoencefálica (BHE) levemente rompida, como demonstrado por uma coloração pálida de azul de Evans no tecido GBM32. No dia 14, a mancha azul de Evans foi mais forte do que no dia 7, indicando que o BBB foi altamente interrompido. Por sua vez, o crescimento do tumor também afeta por quanto tempo os animais podem ser mantidos no experimento. Esta é uma importante consideração do bem-estar animal para estudos longitudinais de imagem. As janelas cranianas crônicas têm sido relatadas como adequadas para exames de imagem por até 6 meses após o implante26.
As nanopartículas utilizadas neste protocolo consistem de componentes de óxido de ferro e fluoróforo. Possíveis aplicações incluem a investigação da liberação tumoral de novas drogas terapêuticas, terapêutica celular e intervenções na vasculatura tumoral e no microambiente tumoral. Diferentes candidatos a drogas e terapias combinadas podem ser avaliadas em nível celular e molecular. O componente óxido de ferro dos NPs permite imagens multimodais com ressonância magnética ou ressonância magnética, além de 2P-IVM. Embora a RM represente uma modalidade de imagem clinicamente relevante, sua resolução anatômica é inferior à da microscopia intravital33.
Este método também tem certas limitações. As coordenadas cerebrais de acordo com um atlas cerebral de camundongos são padronizadas para camundongos C57BL/6J e devem ser ajustadas dependendo da cepa, sexo e idade do camundongo. Além disso, com imagens de dois fótons, apenas uma profundidade limitada de aproximadamente 450 μm pode ser acessada9. Portanto, apenas a caracterização parcial do tumor é possível com o 2P-IVM, e diferenças regionais nas características do tumor poderiam ser perdidas. Além disso, apenas dois momentos após a administração do PE foram incluídos. Estudos futuros, incluindo maior tempo após a administração intravenosa, permitirão uma análise mais detalhada do comportamento espaço-temporal dos PNs no microambiente tumoral.
Para concluir, avaliamos a liberação tumoral de nanopartículas fluorescentes de óxido de ferro usando 2P-IVM em um modelo de GBM em camundongos. Este método pode ser facilmente modificado para se adequar a várias áreas de pesquisa e representa uma importante ferramenta para imagens cerebrais in vivo no campo da neurociência.

A microscopia intravital de dois fótons (2P-IVM) é uma técnica de imagem por fluorescência que permite a visualização de tecidos vivos1.
Desenvolvida pela primeira vez na década de 1990, a 2P-IVM tem sido utilizada para análise in vivo da retina2, rim3, intestino delgado4, cóclea5, coração6, traqueia7 e cérebro em vários modelos pré-clínicos 8,9. No campo da neurociência, a 2P-IVM tem ganhado importância como técnica de obtenção de imagens em tempo real do cérebro saudável em animaisacordados10, além de estudar doenças do sistema nervoso comoAlzheimer11,Parkinson12 e glioblastoma (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM oferece uma solução elegante para estudar o microambiente tumoral durante o desenvolvimento do GBM. Enquanto alguns estudos anteriores se concentraram em modelos in vitro17 e ex vivo 18, outros implementaram modelos ortotópicos19 e xenotrópicos20 in vivo para examinar GBM. Madden e col. realizaram imagens nativas da linhagem celular de glioma de rato CNS-1 em um modelo de camundongo13. Ricard e col. realizaram a administração intravenosa de um fluoróforo para realçar os vasos sanguíneos na região tumoral em 2P-IVM, utilizando um modelo murino ortotópico GL261-DsRed14.
Aqui, aplicamos 2P-IVM para rastrear a liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro (NP) marcadas fluorescentes em um modelo ortotópico de GBM em camundongos. Usando uma janela craniana, este método nos permite estudar a distribuição espaço-temporal em tempo real de NPs no cérebro em detalhes.

<table><tbody><tr><td>Solução de infusão de cloreto de sódio a 0,9%</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>seringa BD</td><td>Luer-Lok, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp; FBS</td><td>Thermo fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de 2 fótons</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de álcool, 70%</td> <td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Álcool, frasco de spray</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Máquina</td><td>de anestesia antiaderente de folha de alumínio Reynold Brands Reynold Wrap</td><td></td> Patterson Scientific SAS3 Monitoramento de anestesia&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. Pulsoxímetro</td><td></td>de Roedores</tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores Betadine</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Tamanho 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina de liberação sustentada</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1,0 mg/mL</td><td>Um medicamento genérico pode ser usado em seu lugar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Linha celular de glioma de rato C6</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Cânulas</td><td>BD</td><td>16 G, 1,1/2", 30 G, 1"</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer&nbsp;</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>Um medicamento genérico pode ser usado em seu lugar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/frasco</td><td>Um medicamento genérico pode ser usado em seu lugar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de ponta de algodão, 6" &nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dental</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Kit de cimento dental, transparente, 2 componentes</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>Um medicamento genérico pode ser usado em seu lugar.&nbsp;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recovery, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Drape&nbsp;</td><td>Broca de</td><td>Envoltório</td><td></td>Bio Shield da Cardinal Health</tr><tr><td></td><td>Saeyang Microtech</td><td>Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de broca&nbsp;</td><td>Hager & Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Tamanho 005, US 1/4</td></tr><tr><td>FIJI software de análise de imagem</td> Instituto <td>Nacional de Saúde</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Almofada de Gaze de Algodão Estéril, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp;</td><td>Ethicon Inc.&nbsp;</td><td>Esponja de gelatina absorvível Surgifoam, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinador&nbsp;</td><td>Cellpoint Scientific&nbsp;</td><td>Germinator 500, No. 11688</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro, diâmetro de 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Tampa de vidro&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luvas, não estéreis</td><td>Fisher Scientific</td> Luvas <td></td><td>de exame médico sem pó de nitrilo</td></tr><tr><td>Luvas estéreis</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação</td><td>Church & </td><td>Loção removedora de pelos Dwight Nair&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &micro; L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sem Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>Barra de cabeça</td><td>Hongway</td><td>Anéis O-rings</td><td></td>de 5 mm de diâmetro interno</tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Seringas de Insulina X2</td><td></td>para aquecedor de roedores</tr><tr><td></td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2&Prime;</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de óxido de ferro</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Injeção de ferumoxitol Feraheme, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, Microscópio 005557</td><td></td></tr><tr><td>de Cepa (cirurgia)</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas</td><td>Personalizadas</td><td></td><td>Nanopartículas de óxido de ferro (Ferumoxytol) marcadas com isotiocianato de fluoresceína</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Principais produtos farmacêuticos</td><td>Lubrifresh P.M. pomada noturna, 203964</td><td></td></tr><tr><td>Oxigênio</td><td>Linde Gas & Equipamento Inc.&nbsp;</td><td>Cilindro de Aço de Alta Pressão Estilo K, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Copos de Plástico</td><td>Georgia-Pacirif Consumer Products</td><td>Dixie Portion Cup, 2 oz., Plástico, Transparente, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Polietileno</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Escala</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex Tesoura de bisturi</td><td></td>descartável de aço inoxidável</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>Selante</td><td>Henkel Corp</td><td>Loctite 4014</td><td></td></tr><tr><td>Vestido de laboratório de uso único</td><td>High Tech Conversions</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de isopor</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Cola cirúrgica, adesivo de tecidos 3M Vetbond</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Tail Cátedra de veias</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Consiste em duas cânulas de 30 G conectadas com tubo de silicone&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), sem fenol vermelho</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Tocha ultravioleta</td><td>Tecnologia de sol de primavera</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital de dois fótons de glioblastoma em modelo murino

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

A administração intravenosa de terapêutica do câncer para tumores cerebrais é limitada pela barreira hematoencefálica. Um método para obter imagens diretas do acúmulo e distribuição de macromoléculas em tumores cerebrais in vivo aumentaria muito nossa capacidade de entender e otimizar a liberação de fármacos em modelos pré-clínicos. Este protocolo descreve um método para rastreamento in vivo em tempo real de nanopartículas fluorescentes marcadas por via intravenosa com microscopia intravital de dois fótons (2P-IVM) em um modelo de glioblastoma (GBM) em camundongos.
O protocolo contém uma descrição do procedimento em várias etapas, incluindo anestesia e analgesia de animais experimentais, criação de uma janela craniana, implante de células GBM, colocação de uma barra de cabeça, realização de estudos de 2P-IVM e cuidados pós-cirúrgicos para estudos de seguimento de longo prazo. Mostramos sessões representativas de imagens 2P-IVM e análise de imagens, examinamos as vantagens e desvantagens dessa tecnologia e discutimos possíveis aplicações.
Este método pode ser facilmente modificado e adaptado para diferentes questões de pesquisa no campo da imagem cerebral pré-clínica in vivo .

Aqui, realizamos cirurgia de janela craniana e enxertamos células C6 em um modelo de GBM em camundongos NSG (n = 5). Uma vedação adequada entre todos os componentes envolvidos na criação da janela (Figura 1A) garantirá a durabilidade das janelas para obtenção de imagens a longo prazo e, adicionalmente, reduzirá a morbidade. Usando o estágio adaptado para 2P-IVM in vivo (Figura 2), pudemos obter imagens de animais sob anestesia por até 2 h sem grandes artefatos de movimento. Aproximadamente 10 min após a aplicação intravenosa das nanopartículas em camundongos portadores de GBM, o 2P-IVM mostra o sinal verde e fluorescente dos vasos na região do tumor, consistente com a localização intravascular das nanopartículas marcadas com FITC. Apenas uma pequena quantidade de sinal verde-fluorescente é notada fora dos vasos sanguíneos, indicando o extravasamento inicial de DNs (Figura 3A). Observa-se aumento do sinal da FITC proveniente do espaço extravascular, o que está de acordo com o extravasamento avançado (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> Gráfico 1. Colocação de janela craniana, craniotomia, implante e exames de imagem. (A) Secção transversal do posicionamento anatômico de uma janela craniana. Como a barra principal é livre de metal, é possível realizar imagens por ressonância magnética ou imagens por partículas magnéticas, além da microscopia intravital de dois fótons. (B) Visão geral (fileira superior) e visão detalhada (fileira inferior) da craniotomia (esquerda), implantação celular (média) e microscopia intravital de 2 fótons (direita). Ao abrir o crânio, ocorre sangramento superficial (esquerdo) e é rapidamente reabsorvido (médio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> Gráfico 2. Projeto assistido por computador (CAD) do estágio. CAD do estágio usado para microscopia intravital in vivo de 2 fótons, incluindo barra de mordida, estabilização da barra cefálica e parafusos para ajustes de altura e ângulo. O arquivo CAD 3D pode ser encontrado em Supplemental Coding File 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> Gráfico 3. Imagens in vivo de microscopia intravital de 2 fótons. Imagens adquiridas (A) 10 min e (B) 24 h após a administração intravenosa de nanopartículas. Enquanto as células GBM emitem sinais fluorescentes no espectro vermelho (esquerda), as nanopartículas no tecido cerebral são visualizadas em verde (direita). # indica NPs extravasadas, * indica um vaso sanguíneo. Apenas um número limitado de partículas sofreu extravasamento e são visíveis nas proximidades das células tumorais 10 minutos após a administração de NP. Uma abundância de partículas é visível na região das células GBM, sugerindo extravasamento 24 h após a administração de NP. As nanopartículas consistem em isotiocianato de fluoresceína (FITC) e nanopartículas de óxido de ferro (Ferumoxytol). As barras de escala representam 100 μm. Abreviações: 2P-IVM: microscopia intravital de 2 fótons, RFP: proteína fluorescente vermelha, GBM: glioblastoma, FITC: isotiocianato de fluoresceína, NP: nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: arquivo CAD 3D do estágio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

O glioblastoma é um dos cânceres cerebrais primários mais comuns e está associado ao crescimento rápido e à baixa expectativa de vida. O desenvolvimento de terapias eficazes para glioblastoma continua sendo um grande desafio, uma vez que a administração de terapêuticas é limitada pela barreira hematoencefálica. Um método para obter imagens diretas do acúmulo e distribuição de macromoléculas no cérebro aumentaria muito nossa capacidade de entender e otimizar a entrega de drogas.A microscopia de dois fótons oferece uma solução elegante para estudar a distribuição em tempo real de nanopartículas no modelo pré-clínico de glioblastoma. Ao modificar a nanopartícula usada neste estudo, é possível investigar a entrega de diferentes candidatos a fármacos e terapias combinadas em nível celular e molecular. Além da microscopia intravital de dois fótons, o componente óxido de ferro dessas nanopartículas permite imagens multimodais com RM ou IPM.Para o futuro, os serviços de imagem poderão servir na realização da detecção precoce do câncer, levando a terapias mais eficazes contra neoplasias malignas. Um caminho para conseguir isso é mesclar a microscopia intravital de dois fótons com outras modalidades de imagem, como tomografia por emissão de pósitrons e ultrassom fotoacústico.

two-photon-intravital-microscopy-of-glioblastoma-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Implantação intracraniana de GL261 células em camundongos C57BL / 6 produz gliomas malignos que recapitulam muitas das características de glioblastoma multiforme humano. Usamos GL261 células expressando estavelmente luciferase para nos permitir...

Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série...

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Neste vídeo, realizamos imagens intravitais de células cancerígenas pré-injetadas em um modelo de camundongo por meio de uma janela craniana implantada. Esta técnica de imagem de lapso de tempo de alta resolução permite o estudo do comportamento dinâmico das células cancerígenas no camundongo vivo.

Imagem intravital baseada em janela craniana em um modelo de camundongo: uma técnica de imagem para estudar o comportamento de células cancerígenas pré-injetadas no cérebro de um modelo murino

Neste vídeo, descrevemos a tomografia molecular de fluorescência ou FMT para imagens in vivo de xenoenxertos de glioblastoma marcados com proteína fluorescente em modelos de camundongos. A técnica é útil para elucidar os efeitos da terapêutica antitumoral em nível molecular.

Tomografia Molecular de Fluorescência: Uma Técnica de Imagem para Imagem In Vivo de Xenoenxertos de Glioblastoma Marcados com Proteína Fluorescente em Modelo de Camundongo

Fonte: Clark, A.J., et al. Imagem de bioluminescência de um modelo animal imunocompetente para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens de bioluminescência para rastrear a progressão do glioblastoma em um modelo de camundongo imunocompetente, usando células tumorais que expressam luciferase e luciferina para quantificar o crescimento do tumor de forma não invasiva.

Imagem de bioluminescência de um modelo de camundongo imunocompetente para glioblastoma

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

As células de glioma GL261 fornecem um modelo animal imunocompetente útil de glioblastoma. Os objetivos deste protocolo são demonstrar técnicas adequadas para monitorar o crescimento do tumor intracraniano usando imagens de bioluminescência in vivo e verificar a utilidade das células GL261 modificadas com luciferase para estudar a imunologia tumoral e abordagens imunoterapêuticas para o tratamento do glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

Fluorescência Molecular Tomography para a imagem latente na Vivo de Glioblastoma Xenografts

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Aprenda microscopia intravital de dois fótons para estudar a entrega de nanopartículas de óxido de ferro em glioblastoma murino. Esta técnica permite visualizar em tempo real a distribuição terapêutica no cérebro.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

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