Name: Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a usar tomografia serial de dois fótons para detectar Salmonella em órgãos inteiros de camundongos durante a terapia antibiótica. Este método avançado permite visualizar a persistência bacteriana e interações com células imunes em 3D.

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O trabalho foi apoiado pela Swiss National Science Foundation 310030_156818, 310030_182315 e NCCR_ 180541 AntiResist (para DB).

Rastreamento de patógenos de órgãos inteiros por meio de quantificação fluorescente de repórter

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O contexto tecidual local dos patógenos bacterianos é crucial para determinar os ataques locais do hospedeiro, as adaptações bacterianas, o resultado local das interações do patógeno hospedeiro e a quimioterapia antimicrobiana e as contribuições individuais para o resultado geral da doença. A imagem de bactérias do tamanho de micrômetros em órgãos de tamanho de centímetros tem sido um desafio. A tomografia seriada de dois fótons (STP) fornece resolução espacial suficiente para detectar células bacterianas individuais em órgãos inteiros, seccionamento e imagem automatizados e rendimento suficiente (~ 1 órgão por dia)11. Embora os antígenos do hospedeiro possam ser corados in vivo, as células do patógeno devem expressar proteínas fluorescentes adequadas para garantir a detecção abrangente de células patogênicas intracelulares. Os conjuntos de dados resultantes (0,5-1,5 TeraByte por órgão) representam desafios substanciais para as infraestruturas de TI para análise e armazenamento de dados.
Existem várias etapas críticas neste método. Primeiro, é necessária uma cepa de patógeno com expressão detectável e homogênea da proteína fluorescente GFP ou YFP. Idealmente, um de expressão cromossômica25 é usado para minimizar a heterogeneidade da fluorescência devido à variação do número de cópias do plasmídeo. É necessária intensidade de fluorescência suficiente, mas níveis excessivos de proteína fluorescente devem ser evitados para evitar prejuízos de aptidão do patógeno23. Níveis de expressão apropriados podem ser obtidos pela seleção de um promotor apropriado e ajuste fino do sítio de ligação ribossômica25 ou de toda a região 5 'não traduzida (UTR) 26 . Em segundo lugar, a fixação da perfusão deve envolver uma lavagem inicial com tampão para remover o maior número possível de eritrócitos da circulação sanguínea. Isso é particularmente crítico para o baço e o fígado (embora a remoção completa de eritrócitos desses órgãos seja difícil). Os eritrócitos remanescentes absorvem luz na parte visível do espectro, comprometendo a qualidade da imagem27. Em terceiro lugar, o armazenamento dos tecidos fixados no crioprotetor é fundamental para reduzir a autofluorescência do tecido, que é particularmente alta em tecidos inflamados e pode ofuscar a fluorescência comparativamente fraca das células do patógeno11. Quarto, a reticulação efetiva do tecido com o bloco de agarose circundante é crítica para o corte suave do vibratoma sem que o tecido salte do bloco de agarose. Em quinto lugar, os sinais fluorescentes e sua identificação como células patogênicas devem ser verificados de forma independente por meio de abordagens ortogonais, como coloração com anticorpos para componentes patogênicos (como lipopolissacarídeo para bactérias Gram-negativas) e microscopia confocal dos cortes recuperados do tomógrafo11. Alguns tecidos infectados contêm partículas autofluorescentes com formato semelhante e espectros de fluorescência sobrepostos que podem ser facilmente interpretados erroneamente como células patogênicas. Sexto, a quantidade de células patogênicas dentro das microcolônias deve ser comparada a abordagens ortogonais, como microscopia confocal, para avaliar a precisão. As cargas bacterianas globais baseadas nesses cálculos devem ser verificadas por comparação com abordagens ortogonais, como citometria de fluxo e plaqueamento.
Modificações importantes do protocolo STP amplamente utilizado incluem a colocação de um filtro passa-banda estreito de 510/20 nm na frente do fotomultiplicador 211, para reduzir a interferência da autofluorescência verde-amarela que é particularmente forte no fígado infectado e inflamado, baço e placas de Peyer. A forte autofluorescência e o aumento da dispersão de luz de tais órgãos em comparação com o cérebro (que domina outras aplicações do STP) também geram a necessidade de uma correção mais eficaz para iluminação irregular. Como outra modificação, este protocolo emprega a abordagem CIDRE22 para esse fim (Figura 3) e segmentação de bactérias baseada em IA. Finalmente, o pré-processamento do tecido foi alterado com a inclusão de uma etapa de incubação em crioprotetor a -20 ° C, o que reduz a autofluorescência do tecido e, portanto, facilita a detecção de pequenas células patogênicas com fluorescência relativamente fraca11.
A solução de problemas pode ser necessária se nenhum sinal de patógeno puder ser detectado ou a segmentação produzir sensibilidade insuficiente (muitas células do patógeno são perdidas) ou precisão insuficiente (muitas partículas de fundo são segmentadas como células do patógeno). Se a autofluorescência do tecido de fundo for detectável, mas houver poucos sinais de patógenos, os patógenos podem conter quantidades insuficientes de proteínas fluorescentes. Isso pode ser testado usando microscopia confocal de cortes de tecido do mesmo tecido infectado ou citometria de fluxo de homogeneizados de tecido19,28. As razões subjacentes podem ser níveis de expressão insuficientes ou instabilidade do de expressão. As estratégias de mitigação podem incluir promotores alternativos para impulsionar a expressão, adaptação de códons dos genes que codificam a proteína fluorescente para as espécies de patógenos, emprego de construções epissómicas com maior número de cópias ou estabilização de de expressão por integração cromossómica ou complementação letal equilibrada29. A escolha da proteína fluorescente também é importante, mas a detecção é possível com GFP.mut2, mWasabi, YPet e TIMERbac. Se a segmentação for imprecisa, isso pode ser causado por fluorescência de patógeno muito fraca, que pode ser tratada conforme descrito acima, ou fundo de autofluorescência de tecido muito alto. A perfusão extensa da solução de lavagem ou a incubação prolongada em tampão de armazenamento imediatamente antes da incorporação no bloco de agarose e na tomografia podem resolver esses problemas. Finalmente, é necessário treinamento suficiente da rede neural para uma classificação precisa, mas o treinamento excessivo pode levar ao sobreajuste que prejudica o desempenho de novas amostras.
Atualmente, nenhum outro método pode obter imagens de órgãos inteiros com resolução espacial suficiente em 3D para detectar bactérias individuais. Melhorias futuras na limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz podem alcançar resolução semelhante. Isso pode permitir imagens em maior velocidade e com mais canais fluorescentes.
Uma limitação importante do STP é a resolução de pixels no plano de ~ 0,5 μm e a resolução vertical de 5 a 10 μm, o que é insuficiente para resolver bactérias localizadas próximas, por exemplo, dentro de uma microcolônia densamente compactada. No entanto, é possível recuperar cortes de tecido após a tomografia para microscopia confocal secundária de alta resolução de partes de tecido selecionadas. Outra limitação do STP é a disponibilidade de apenas três canais de fluorescência, o que restringe o número de fluoróforos que podem ser visualizados simultaneamente. Novamente, a análise secundária de seções de tecido recuperadas com métodos de multiplexação pode revelar a localização e a intensidade de muitos outros marcadores para partes de tecido selecionadas. Essas informações podem ser integradas à estrutura 3D geral do tecido circundante, conforme determinado com STP.
Em conclusão, este protocolo permite investigações detalhadas das interações patógeno-hospedeiro no nível local e de órgão inteiro. O protocolo deve ser facilmente adaptável a outros patógenos (desde que possam ser obtidos como cepas fluorescentes), outros órgãos e diferentes espécies hospedeiras.

As infecções ocorrem em tecidos com anatomia complexa e fisiologia compartimentada. Os diversos microambientes que coexistem no tecido infectado podem determinar o destino dos subconjuntos locais de patógenos e suas contribuições para o resultado geral da doença 1,2,3. No entanto, o mapeamento 3D abrangente de patógenos microbianos em tecidos de tamanho cm continua sendo um desafio4. A imagem do cérebro e de outros órgãos é um campo de pesquisa altamente ativo com estratégias experimentais em constante aprimoramento5, mas muitos métodos ainda carecem da resolução sub-μm que seria necessária para identificar patógenos bacterianos de tamanho μm com confiança. Em contraste, a tomografia serial de dois fótons (STP)6 permite imagens automatizadas multicoloridas e livres de deformação de tecidos inteiros com resolução no plano sub-μm, produzindo conjuntos de dados volumétricos completos. Este método combina seccionamento físico repetido do tecido usando um vibratomo com imagens intermitentes de dois fótons das faces do bloco emergente com luz infravermelha. A tomografia STP tem sido amplamente utilizada para mapear axônios finos no cérebro para estabelecer mapas de conectividade 7,8,9,10.
A tomografia STP também permite o mapeamento 3D de células microbianas individuais do patógeno (Salmonella, Toxoplasma) em todos os tecidos infectados11,12 usando um tomógrafo. A geração de segundo harmônico revela bainhas de colágeno ao redor das artérias e em bandas fibrosas, como as trabéculas do baço, fornecendo contexto anatômico. Anticorpos fluorescentes injetados in vivo podem ser usados para corar células hospedeiras para revelar interações entre células patogênicas individuais e células imunes infiltradas, como neutrófilos. Aqui, é descrito o pipeline envolvendo processamento do tecido, imagem, costura de ladrilhos de imagem com correção de iluminação, empilhamento de imagens em três dimensões e segmentação usando ferramentas de aprendizado de máquina. Este pipeline produz posições 3D de patógenos individuais, células e microcolônias dentro de seu contexto hospedeiro. Contar o número de células individuais dentro das microcolônias permanece difícil devido aos limites de resolução, mas esses números podem ser estimados com base no brilho integrado da microcolônia. O pipeline pode ser prontamente adaptado a outros modelos de infecção se patógenos recombinantes que expressam GFP ou YFP estiverem disponíveis.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo instantâneo Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Periodato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-tamponado salino (TBS)</td> <td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vácuo filtration 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molde de plástico removível</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 tomógrafo</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo/corantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, coelho</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, clone 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, clone 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos secundários</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho para galinhas Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Versão da empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g ou posterior</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b ou posterior</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (tomógrafo)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de visualização Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 ou posterior</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

A maioria das infecções ocorre dentro de tecidos tridimensionais do hospedeiro com anatomia intrincada e fisiologia do hospedeiro localmente variável. O posicionamento das células do patógeno dentro desse ambiente diversificado afeta significativamente seus níveis de estresse, respostas, destino e contribuição para a progressão geral da doença e falha do tratamento. No entanto, devido às dificuldades técnicas em localizar células patogênicas de tamanho μm dentro de órgãos hospedeiros de tamanho cm, essa área de pesquisa tem sido relativamente inexplorada. Aqui, apresentamos um método para enfrentar esse desafio. Empregamos tomografia serial de dois fótons e análise de imagem aprimorada por IA para localizar células individuais de Salmonella em todo o baço, lobos hepáticos e linfonodos inteiros de camundongos infectados. Usando repórteres fluorescentes e administração de anticorpos in vivo , a taxa de replicação de células únicas de Salmonella , sua interação local com células imunes específicas e as respostas bacterianas aos antibióticos podem ser determinadas. Essas metodologias abrem caminhos para um exame abrangente de infecções, sua prevenção e tratamento dentro do contexto do tecido tridimensional.

O procedimento descrito permite a detecção de células individuais de Salmonella em órgãos inteiros de camundongos, como baço, fígado, linfonodos mesentéricos e placas de Peyer11 (Figura 5 e Figura 6). Ele também detecta parasitas Toxoplasma gondii no cérebro de camundongos12. Alguns tecidos infectados, incluindo fígado, placas de Peyer e baço, emitem autofluorescência substancial na faixa verde-amarela. A autofluorescência é ainda mais reforçada pela fixação com paraformaldeído, que é necessária para preservar a estrutura do tecido. A detecção de fluorescência verde de GFP, mWasabi e o componente verde do TIMERbac contra esse fundo de autofluorescência é melhorada colocando um filtro passa-banda estreito de 510/20 nm (transmitindo a maioria das emissões de GFP, mas bloqueando uma grande parte do espectro de autofluorescência) na frente do fotomultiplicador 2 (que coleta emissões verdes) e reduzindo a autofluorescência do tecido armazenando tecidos fixos por 3 ou mais dias em crioprotetor11. No entanto, as bactérias ainda devem expressar pelo menos alguns milhares de cópias por célula de GFP ou outras proteínas fluorescentes. Por outro lado, níveis excessivos de proteína fluorescente devem ser evitados para minimizar os custos de aptidão que podem levar a uma virulência atenuada23.
A segmentação correta de bactérias fluorescentes nos tecidos pode ser confirmada por imuno-histoquímica de seções de tecido recuperadas após a imagem. Especificamente, objetos corados com um anticorpo para componentes da superfície bacteriana, como lipopolissacarídeo, podem ser alinhados com a imagem de fluorescência obtida por tomografia STP (Figura 5). É importante notar que algumas células de Salmonella coradas não possuem proteínas fluorescentes e, portanto, fluorescência detectável tanto na microscopia confocal quanto na tomografia STP. Essas células são Salmonella que foram mortas pelo sistema imunológico do hospedeiro, conforme demonstrado pela classificação por citometria de fluxo e culturas de crescimento de células classificadas simples, bem como a estreita correlação entre o número de unidades formadoras de colônias em placas de ágar e o número de células fluorescentes de Salmonella , conforme determinado por citometria de fluxo24. Além disso, a perda de plasmídeo pode resultar em células viáveis não fluorescentes e isso precisa ser testado por plaqueamento em meio com e sem antibióticos apropriados correspondentes ao marcador de seleção no plasmídeo. Para plasmídeos derivados de pSC101, a perda de plasmídeo in vivo é rara19. Para a maioria dos de expressão cromossomicamente integrados, como sifB :: gfp usado em11, a perda de expressão é indetectável in vivo. Se a segmentação for inconsistente com os dados de imuno-histoquímica, o pipeline de segmentação precisará ser modificado.
A resolução da tomografia STP é insuficiente para resolver células bacterianas individuais dentro de microcolônias densamente compactadas. No entanto, a intensidade total de fluorescência da microcolônia permite estimar o número de células de Salmonella . Isso requer uma cepa fluorescente com níveis de fluorescência altamente homogêneos, como Salmonella sifB::gfp11. A combinação do número estimado de células de Salmonella para todas as microcolônias e células únicas produz cargas totais de tecido bacteriano que são consistentes com métodos alternativos, como plaqueamento ou citometria de fluxo de homogeneizados de tecido11. O plaqueamento e a citometria de fluxo não podem ser feitos diretamente dos mesmos tecidos porque precisam ser fixados por perfusão para tomografia STP. Em vez disso, eles têm que ser feitos com animais adicionais que não são fixos. Se as cargas bacterianas medianas, conforme determinado pelas várias abordagens, diferirem em mais de 3 vezes, a viabilidade das bactérias fluorescentes pode ser comprometida (no caso de unidades formadoras de colônias inferiores) ou algumas bactérias podem ter perdido a construção repórter fluorescente (no caso de unidades formadoras de colônias mais altas). O experimento de controle será necessário para identificar a fonte de tais discrepâncias.
A tomografia STP fornece a localização de células bacterianas dentro da estrutura 3D dos tecidos infectados. Os sinais do segundo harmônico do colágeno fornecem marcos anatômicos, como artérias e trabéculas. Além disso, as células hospedeiras podem ser coradas in vivo injetando um anticorpo em marcadores de superfície antes da perfusão (Figura 5 e Figura 6). Essa coloração fornece pontos de referência adicionais para compartimentos de tecido e microambientes específicos, incluindo focos de inflamação (marcadores intracelulares e alguns compartimentos com barreiras difusionais, como a polpa branca esplênica ou o cérebro, não são facilmente acessíveis, adequados para essa coloração in vivo ). Essa abordagem revelou a polpa branca esplênica como um compartimento tecidual que permite a sobrevida a longo prazo de Salmonella durante a quimioterapia antimicrobiana11.
Finalmente, a Salmonella que se replica em taxas moderadas ou lentas pode ser identificada e localizada dentro da estrutura 3D dos tecidos usando cepas que expressam o temporizadorbac, um repórter de célula única para a taxa de replicação11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Figura 1: Procedimento para imagem de órgão inteiro usando tomografia seriada de dois fótons (STP). (A-B) O órgão é colhido após perfusão transcárdica e armazenado durante a noite em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 ° C. (C-E) O órgão é embebido em agarose oxidada e reticulado, então o tecido é escaneado e fatiado usando tomografia STP. As fatias são coletadas para imuno-histoquímica subsequente. (F-J) Pipelines de análise computacional para quantificar o número de bactérias, confirmação de bactérias fluorescentes e reconstrução 3D de posições bacterianas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Figura 2: Configuração de tomografia serial de dois fótons (STP). (A) Tomógrafo que incorpora (B) imagem de 2 fótons com (C) seccionamento automatizado de tecido serial. (D) Fatias de tecido coletadas para investigações de acompanhamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Figura 3: Costura de ladrilhos e correção de iluminação. Os ladrilhos são costurados e a iluminação irregular é corrigida para usar distribuições de intensidade corrigidas usando minimização de energia regularizada (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Figura 4: Segmentação de Salmonella expressando a proteína fluorescente verde (GFP) usando uma Máquina de Vetores de Suporte (SVM) e uma Rede Neural Convolucional (CNN). (A) Imagens representativas de objetos GFP segmentados por SVM (esquerda) e imagens correspondentes (direita) com regiões segmentadas por SVM (barra de escala: 10 μm). (B) Distribuição de valores clusterizados vermelho-verde-azul (RGB) para as regiões segmentadas. (C) Imagens representativas de objetos não GFP falsamente identificados pelo SVM como bactérias (à esquerda). A CNN os descarta corretamente como plano de fundo (à direita, barra de escala: 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Figura 5: Detecção de Salmonella expressando a proteína fluorescente verde (GFP) por tomografia e confirmação por imuno-histoquímica. Imagens do mesmo corte adquiridas por tomografia (esquerda) ou microscopia confocal após coloração com um anticorpo para lipopolissacarídeo de Salmonella (direita). Os neutrófilos (vermelho) foram corados por injeção in vivo de um anticorpo anti-Ly-6G marcado com PE antes da perfusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Figura 6: Reconstrução 3D e localização de Salmonella no baço de camundongo infectado. (A) Reconstrução tridimensional (3D) de um corte de baço de 5 mm de espessura e corado in vivo antes da perfusão com anticorpo anti-CD169 (vermelho). O sinal azul representa o colágeno detectado pelos segundos harmônicos. (B) Um plano óptico da pilha 3D mostrada em (A). As posições das células ou microcolônias de Salmonella são indicadas por estrelas. (C) Reconstrução 3D das posições de Salmonella (estrelas) no fígado infectado. As artérias são visíveis com base em suas bainhas de colágeno (azul). Barra de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

As infecções bacterianas são uma grande ameaça à saúde humana. A resistência antimicrobiana está aumentando e ainda faltam vacinas para vários patógenos importantes. Para identificar novos caminhos para estratégias de controle, precisamos saber mais sobre como os patógenos respondem ao sistema imunológico do hospedeiro e aos antibióticos in vivo nos tecidos infectados.As bactérias sobreviventes podem causar recaídas se os antimicrobianos não erradicarem uma infecção. Usando tomografia seriada, mostramos que a febre tifoide causando salmonela pode persistir durante a terapia em uma parte específica do baço. A inflamação é fraca nessa região, o que interrompe a sinergia crítica entre antibióticos e inflamação para uma depuração eficaz.As bactérias são objetos do tamanho de micrômetros. É difícil localizar objetos tão pequenos em seu contexto de tecido. A tomografia serial de dois fótons pode detectar uma única bactéria em órgãos do tamanho de um centímetro e determinar sua taxa de replicação.Também podemos detectar células imunes, como neutrófilos, e determinar sua relação espacial com as bactérias. Estudamos as atividades dos antibióticos bacteriostáticos. Esses antibióticos podem curar infecções, embora só possam inibir o crescimento bacteriano sem realmente matar o patógeno.Também determinamos a disseminação de mutantes bacterianos que não possuem certos fatores de virulência e o impacto dos defeitos imunológicos na infecção e no tratamento.

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Research

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Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

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