Name: Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Aprenda a isolar núcleos de alta qualidade a partir de células sanguíneas derivadas de iPSCs criopreservadas para análises de sequenciamento de núcleo único. Este protocolo avança pesquisas em genômica e terapia celular.

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Os autores agradecem a Jason Hatakeyama (10x Genomics) e Diana Slater (Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) por orientação e sugestões. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health (HL156052 ao CST).

1. Criopreservação de células
<ol><li>Congele >1 x 106 células derivadas de iPSC isoladas por mL em 1 mL de 90% de FBS e 10% de DMSO. Coloque os criogenianos em um recipiente de congelamento a -80 ° C para reduzir a velocidade de congelamento e otimizar a recuperação de células viáveis (Tabela de Materiais). Antecipe uma perda celular considerável, que pode variar de acordo com as condições de cultura e a identidade celular.</li>
	<li>Passar de -80 °C para armazenamento de nitrogênio líquido em 24 h.</li>
</ol>2. Descongelamento de células
<ol><li>Recupere o criovial do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele em banho-maria a 37 °C por 2 min. Retire do banho-maria enquanto pequenos cristais de gelo ainda estão visíveis.</li>
	<li>Transfira as células do criogênico para um tubo vazio de 15 mL e adicione lentamente 10 mL de meio pré-aquecido (RPMI 1640 + 10% FBS) enquanto mistura cuidadosamente. Centrifugue a 400 x g por 3 min a 25 °C.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e reconstitua em 1 mL de DPBS suplementado com 2% de FBS e 1 mM de CaCl2 (Tabela de Materiais). Misture cuidadosamente pipetando 3x com uma micropipeta de 1000 μL. Transfira para um tubo inferior redondo de poliestireno de 5 mL.</li>
</ol>3. Remoção de células mortas
<ol><li>Adicione 50 μL de coquetel de remoção de células mortas (Tabela de Materiais) a 1 mL de suspensão celular. Adicione 50 μL de coquetel de seleção de biotina à mistura celular. Incube em temperatura ambiente por 3 min. Essas etapas rotulam as células mortas da Anexina V + contidas na suspensão celular com biotina.</li>
	<li>Vigorosamente vórtice por 30 s, os grânulos de dextrano projetados para o esgotamento de tipos de células indesejadas marcadas com biotina (Tabela de Materiais). Adicione 100 μL de grânulos de dextrano à suspensão celular e misture pipetando suavemente para cima e para baixo 2x com uma micropipeta de 1000 μL (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicione 1,3 mL de DPBS contendo 2% de FBS e 1 mM de CaCl2 à suspensão celular e misture pipetando suavemente para cima e para baixo 2x com uma micropipeta de 1000 μL. Coloque o tubo no ímã (Tabela de Materiais) e incube em temperatura ambiente por 3 min.</li>
	<li>Inverta o ímã e o tubo para despejar a suspensão de células vivas enriquecida em um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 400 x g por 3 min a 4 ° C. Remova a maior parte do sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de DPBS + 0,04% BSA. Misture delicadamente pipetando 3x com uma micropipeta de 1000 μL.</li>
</ol>4. Isolamento de núcleos
<ol><li>Centrifugar a suspensão de células vivas a 460 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante, garantindo que não se rompe o sedimento celular.</li>
	<li>Adicione 100 μL de tampão de lise 0,5x recém-preparado resfriado em gelo (Tabela 1) e misture delicadamente pipetando 10x com uma micropipeta de 100 μL. Incube 3 min no gelo.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de lavagem refrigerado (Tabela 2) ao tubo sem misturar. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
</ol>5. Lavagem e avaliação de núcleos
<ol><li>Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 μL de tampão de lavagem refrigerado para dissolver o sedimento intacto restante sem misturar. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Remova todo o sobrenadante sem interromper o pellet dos núcleos.</li>
	<li>Ressuspender em 120 μL de tampão de núcleos diluídos resfriados (Tabela 3). Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 40 μm (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Corar com 0,4% de azul de tripano e avaliar visualmente a qualidade dos núcleos isolados ao microscópio de 10x (Tabela de Materiais).</li>
</ol>6. Processamento de núcleos isolados
<ol><li>Mantenha os núcleos no gelo. Prossiga para o processamento adicional imediatamente, pois a aglomeração nuclear pode ocorrer ao longo do tempo e exigir etapas adicionais de filtragem.</li>
</ol>

Núcleos de alta qualidade de células hematopoiéticas derivadas de iPSC para estudos multiômicos

<ol><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li>
<li>An, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pluripotent+stem+cells+to+generate+diagnostic+tools+for+transfusion+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.</a> Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).</li>
<li>Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+%26%2334%3BOff-the-Shelf%26%2334%3B+Natural+Killer+Cells+from+Peripheral+Blood+Cell-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of &#34;Off-the-Shelf&#34; Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).</li>
<li>Pavani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primitive+and+definitive+erythropoiesis+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells.</a> Blood Adv. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+epigenomic+and+transcriptomic+analysis+reveals+the+requirement+of+JUNB+for+hematopoietic+fate+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction.</a> Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).</li>
<li>Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+bioinformatics+analysis+of+data+from+bulk+and+single-cell+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments.</a> Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+med%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Nadelmann, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+mammalian+cells+and+tissues+for+single-nucleus+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling.</a> Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).</li>
<li>Del-Aguila, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nuclei+RNA+sequencing+study+of+Mendelian+and+sporadic+AD+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain.</a> Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS one. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Maciejowski, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+rupture+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane rupture and its consequences.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+single+cell+ATAC-seq+data+with+SnapATAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC.</a> Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).</li>
<li>Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technological+landscape+and+applications+of+single-cell+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The technological landscape and applications of single-cell multi-omics.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Etapas críticas dentro do protocolo Isolar núcleos de alta qualidade é essencial para a implementação bem-sucedida das atuais modalidades de sequenciamento de próxima geração baseadas em núcleo único, que estão evoluindo rapidamente. Em reconhecimento às barreiras existentes para laboratórios interessados nessas abordagens, particularmente para espécimes criopreservados, nossa intenção era criar uma técnica de isolamento nuclear adaptada para células previamente congeladas. O isolamento de núcleos de espécimes criopreservados é frequentemente necessário para amostras clínicas e para populações raras de células derivadas de iPSC.
É importante adaptar a diluição do tampão de lise, o tempo de lise e a frequência de filtração para populações celulares específicas. Observamos tipos de células particularmente sensíveis, como células progenitoras hematopoiéticas derivadas de iPSC humanas criopreservadas, tornarem-se superdimensionadas em menos de um minuto com tampão de lise 1x. Essa lise excessiva não é apenas um mau funcionamento técnico ou operacional. Em vez disso, o excesso de lise e aglomeração podem indicar vazamento de materiais nucleares adesivos. Para células estromais e endoteliais aderentes com arquitetura robusta do citoesqueleto e membranas com propensão a formar fortes aderências célula-célula, a filtração dupla foi necessária para remover os núcleos agrupados. Os agregados nucleares podem obstruir os canais microfluídicos, apresentando riscos tangíveis à integridade experimental e potencialmente impedindo qualquer saída de dados.
Também descobrimos que a incorporação de uma etapa de remoção de células mortas aumentou drasticamente a recuperação de núcleos intactos, limitando a aglomeração e os detritos. Foi necessário processar amostras contendo >70% de células viáveis com base na coloração com azul de tripano no início do experimento. Manter todos os buffers no gelo também pode ajudar a manter a viabilidade.
Limitações da técnica O método descrito foi projetado para otimizar a recuperação nuclear de tipos de células derivadas de iPSC cultivadas4. É possível que procedimentos semelhantes de solução de problemas se estendam além das células induzidas por iPSC para incluir outros tipos de células criopreservadas, mas é um pouco difícil prever necessidades específicas para amostras individuais ou tipos de células sem testes. Independentemente da amostra ou tipo de célula, buscar preparações nucleares com <5% restantes de células inteiras viáveis, minimizando a agregação e reduzindo núcleos super-sobrecarregados deve se correlacionar diretamente com o sucesso experimental.



Importância em relação aos métodos existentes Sistemas de diferenciação baseados em iPSC translacionalmente relevantes podem produzir uma infinidade de tipos de células e progenitores. Este protocolo se concentra em células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes como tipos de células exemplares que tinham diferentes requisitos metodológicos para otimizar o isolamento nuclear. Prevemos que este protocolo pode ser adaptado e aplicado a outros tipos de células derivadas de iPSC para interrogar estágios essenciais de desenvolvimento, reconhecendo que é necessário ajustar os métodos de isolamento dependendo do conteúdo de proteína, estrutura da membrana e rigidez celular. No entanto, a metodologia descrita aqui pode permitir a recuperação de núcleos de alta qualidade de um amplo espectro de tipos de células criopreservadas.

A hematopoiese é um sistema de desenvolvimento relativamente bem caracterizado, mas a incapacidade de recapitular a formação de células sanguíneas in vitro demonstra uma compreensão incompleta dos fatores relacionados. Modelos de hematopoiese baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ajudar a elucidar os principais fatores de desenvolvimento e a biologia relacionada. O sistema iPSC também oferece um excelente modelo para estudar distúrbios sanguíneos, e células sanguíneas baseadas em iPSC foram desenvolvidas para produzir reagentes traducionais e terapeuticamente relevantes 1,2,3,4. Estudos de células únicas têm sido usados extensivamente para investigar a biologia do desenvolvimento baseada em iPSC, incluindo tipos de células que são produzidas durante a hematopoiese5. Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, que não pode inferir relações entre subpopulações celulares6, as modalidades unicelulares permitem avaliações da heterogeneidade celular e podem facilitar a identificação e caracterização do desenvolvimento celular 6,7.
A formação de células hematopoiéticas a partir de iPSCs requer diferenciação sequencial através de estados primitivos, mesoderma e endotelial para formar células endoteliais hemogênicas. As células endoteliais hemogênicas são precursoras diretas das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras8. Esses tipos de células têm propriedades morfológicas e celulares notavelmente diferentes. Há uma compreensão limitada da paisagem epigenética e da dinâmica de desenvolvimento de modelos de células hematopoiéticas derivadas in vitro, embora este seja um conhecimento essencial para desbloquear todo o potencial terapêutico do sistema iPSC. Em muitos casos, apenas as modalidades de análise de células únicas permitem a identificação de populações celulares, atividades transcricionais, paisagens de cromatina e mecanismos regulatórios que governam o desenvolvimento entre preparações celulares heterogêneas.
Duas metodologias, sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq), podem revelar insights transcricionais no nível de célula individual9. Um fator principal que determina a validade e a confiabilidade dos dados é a necessidade intransigente de amostras que atendam a rigorosos critérios de qualidade. Isso inclui requisitos precisos para densidade celular/nuclear, viabilidade ideal e aglomeração mínima. A preparação de núcleos únicos pode ser tecnicamente desafiadora. Pode haver desafios adicionais associados ao uso de células previamente criopreservadas.
Observamos quatro limitações potenciais importantes para as abordagens scRNAseq padrão. Primeiro, os protocolos padrão para gerar suspensões celulares geralmente fazem referência a preparações de células ou tecidos frescos, em vez daquelas recuperadas após a criopreservação10. Isso pode reduzir a utilidade de recursos potencialmente valiosos. Em segundo lugar, a eficiência de dissociação de diversos tipos de células é variável. Por exemplo, muitos tipos de células imunes sofrem dissociação com relativa facilidade. Em contraste, células estromais, fibroblastos e células endoteliais, que normalmente estão embutidas na matriz extracelular e na membrana basal, têm propriedades celulares únicas que podem complicar o isolamento dos núcleos11,12. Essas propriedades podem exigir protocolos de dissociação agressivos, o que pode comprometer a integridade estrutural de populações de células mais delicadas. Em terceiro lugar, algumas células (por exemplo, megacariócitos) podem ultrapassar 100 μm de diâmetro e representar dificuldades para várias plataformas comerciais de célula única existentes13. Além disso, o manuseio inadequado pode levar a danos celulares e respostas ao estresse durante as etapas iniciais do isolamento celular, envolvendo hidrólise enzimática e dissociação mecânica, o que pode afetar os perfis de expressão gênica11,14.
Por essas e outras razões, uma abordagem de núcleo único pode ser uma alternativa preferível aos métodos de célula única15. Dada a estabilidade superior da membrana nuclear em comparação com a membrana celular, o envelope nuclear pode permanecer intacto mesmo após a criopreservação do tecido16. Isso pode facilitar a extração nuclear e aumentar a diversidade de tipos de amostras adequados para modalidades de sequenciamento de próxima geração. Em segundo lugar, os núcleos exibem maior resistência a perturbações mecânicas e tendem a manifestar menos mudanças transcricionais durante a dissociação14. Portanto, os núcleos podem fornecer maior estabilidade do RNA e perfis transcricionais mais reprodutíveis. Uma terceira vantagem digna de nota dos métodos de núcleo único é a falta de restrições de tamanho celular e a aplicabilidade para células maiores, como cardiomiócitos ou megacariócitos12. Em quarto lugar, os núcleos servem como substratos adequados para análises multiômicas, que oferecem insights expandidos da análise integrada da expressão gênica, regiões de cromatina acessíveis e outros parâmetros17, permitindo uma compreensão mais profunda da heterogeneidade, desenvolvimento e estados funcionais celulares18.
Ao traçar o perfil das iPSCs durante o desenvolvimento hematopoiético, as abordagens multiômicas podem ajudar a definir os processos de desenvolvimento em modelos de doenças normais ou patológicas. As comparações de células derivadas de iPSC com células ou tecidos primários também podem fornecer uma avaliação da fidelidade do modelo iPSC à biologia in vivo , facilitando a melhoria do modelo iPSC e a descoberta de novas populações de células e fatores que impulsionam a formação de sangue.
Embora muitos grupos tenham navegado com sucesso no isolamento nuclear e na análise de sequenciamento de próxima geração resultante, o isolamento de núcleos de alta qualidade continua sendo uma barreira para alguns laboratórios interessados em realizar análises baseadas em núcleo único. Este manuscrito detalha um protocolo para isolar núcleos de qualidade de células derivadas de iPSC previamente criopreservadas. Nós nos concentramos em células estromais/endoteliais aderentes e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à estrutura e conteúdo que exigem modificações personalizadas e solução de problemas para aumentar a recuperação de núcleos de alta qualidade passíveis de sequenciamento de próxima geração ou outros experimentos.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes de cultura de células</solução de</td> dimetilsulfóxido ><td></td><td></td><td></td></tr>forte <tr><td>(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>673439</td><td></td></tr> Solução salina <tr><td>tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>GeminiBio</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td><células>fortes</células></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tronco pluripotentes induzidas</td> fortes <td>N/A</td><td>N/A As</td><td>iPSCs usadas neste estudo foram obtidas através do CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility</td></tr><tr><td>Cell Staining Reagents&nbsp; Solução </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagentes de Remoção de Células Mortas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de Remoção de Células Mortas (Anexina V)</td><td>StemCell Technologies</td><td>17899</td><td>Este kit foi projetado para o esgotamento de tipos de células indesejadas marcadas com biotina. O kit inclui coquetel de remoção de células mortas (anexina V), coquetel de seleção de biotina e contas de dextrano. Este kit tem como alvo a fosfatidilserina no folheto externo da membrana celular das células apoptóticas usando a Anexina V. As células indesejadas são marcadas com Anexina V, anticorpos biotinilados e partículas magnéticas e separadas sem colunas usando um ímã EasySep. As células desejadas são simplesmente despejadas em um novo tubo.</td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l Micropipeta</td><td>Wards ciência</td><td>470231606</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; l Micropipeta</td><td>Wards science</td><td>470231598</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; l Ponta Universal Estendida</td><td>Oxford Lab Products</td><td>OAR-1000XL-SLF</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; l Micropipeta</td><td>Wards science</td><td>470231602</td><td></td></tr><tr><td>frascos criogênicos de 2,0 ml</td><td>Corning</td><td>431386</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l Micropipeta</td><td>Wards ciência</td><td>470231608</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Micropipeta</td><td>Wards science</td><td>470231600</td><td></td></tr><tr><td>5ml Tubo de fundo redondo de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Corning DeckWork 0.1-10 &micro; l Estação de Ponta de Pipeta</td><td>Corning</td><td>4143</td><td></td></tr><tr><td>Corning DeckWork 1-200 &micro; l Estação de Ponteira de Pipeta</td><td>Corning</td><td>4144</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Contagem</td><td>CytoSMART</td><td>699910591</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi Cell Strainer, 40 &micro; m&nbsp;</td><td>Bel-Art</td><td>H136800040</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>NALGENE Cryo 1&deg; C Recipiente de Congelamento</td><td>Nalgene</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de Isolamento de Núcleos</td><td></td><td></td><td>Os reagentes de isolamento de núcleos incluem Tampão de Lise,&nbsp; Tampão de lavagem e tampão de núcleos diluídos e tampão de diluição de lise. A constituição desses buffers está na Tabela 1, 2 e 3. Nosso método de isolamento de núcleos melhorou o isolamento dos protocolos do kit padrão (por exemplo, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Guia do Usuário de Expressão Gênica [CG000338]). Este protocolo pode ser usado com vários kits comerciais, incluindo o Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).</td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Células Mortas</td><td>STEMCELL</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>Solução DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi Cell Strainer, 40 &micro; m</td><td>Bel-Art</td><td>H136800040</td><td></td></tr><tr><td>MACS solução de estoque de albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>7786303</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio, 1</td><td>M Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substituto</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Livre de nuclease Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Núcleos (20X)</td><td>10X Genômica</td><td>2000153</td><td></td></tr><tr><td>Protetor Inibidor de RNase</td><td>Sigma</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio, 5 M</td><td>Sigma</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4</td><td>Sigma</td> Cloridrato de <td>Trizma T2194</td><td></td></tr><tr><td>(Tris-HCl) (pH7.4)</td><td>Sigma</td><td>T3252-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Outros equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Microscópio</td><td>699910591</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CytoSMART Zeiss</td><td>Primostar 3</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

Nuclear Isolation from Cryopreserved In Vitro Derived Blood Cells

Modelos baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são excelentes plataformas para entender o desenvolvimento do sangue, e as células sanguíneas derivadas de iPSC têm utilidade translacional como reagentes de testes clínicos e terapias de células transfusíveis. O advento e a expansão da análise multiômica, incluindo, entre outros, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq) e o sequenciamento de cromatina acessível por transposase (snATACseq), oferece o potencial de revolucionar nossa compreensão do desenvolvimento celular. Isso inclui biologia do desenvolvimento usando modelos hematopoiéticos in vitro . No entanto, pode ser tecnicamente desafiador isolar núcleos intactos de células cultivadas ou primárias. Diferentes tipos de células geralmente requerem preparações nucleares personalizadas, dependendo da rigidez e do conteúdo celular. Essas dificuldades técnicas podem limitar a qualidade dos dados e atuar como uma barreira para os investigadores interessados em realizar estudos multiômicos. A criopreservação de amostras é frequentemente necessária devido a limitações na coleta e/ou processamento de células, e amostras congeladas podem apresentar desafios técnicos adicionais para o isolamento nuclear intacto. Neste manuscrito, fornecemos um método detalhado para isolar núcleos de alta qualidade de células derivadas de iPSC em diferentes estágios de desenvolvimento hematopoiético in vitro para uso em fluxos de trabalho multiômicos de núcleo único. Focamos o desenvolvimento do método no isolamento de núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à identidade estrutural e celular. As etapas de solução de problemas descritas limitaram a aglomeração e os detritos nucleares, permitindo a recuperação de núcleos em quantidade e qualidade suficientes para análises a jusante. Métodos semelhantes podem ser adaptados para isolar núcleos de outros tipos de células criopreservadas.

Empregamos o protocolo acima mencionado para extrair núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC criopreservadas e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes (flutuantes). Uma representação esquemática detalhada do procedimento de isolamento nuclear pode ser encontrada na Figura 1.
Para o exame morfológico, os núcleos isolados foram corados com azul de tripano e visualizados ao microscópio. O exame morfológico nuclear é crítico imediatamente antes do processamento, pois detritos ou núcleos agrupados podem diminuir ou impedir a geração de dados de qualidade devido a entupimentos em instrumentos microfluídicos de precisão. O exame microscópico de núcleos isolados de uma amostra preparada usando um protocolo de kit convencional mostrou a presença de detritos e ≥1 agregado nuclear por campo visualizado (Figura 2A-B). Essas amostras foram descartadas devido à qualidade inferior.
Os núcleos de alta qualidade são redondos e intactos, com pouco ou nenhum aglomerado, como os que observamos após a otimização do método (Figura 2C-D). Não observamos agregados ou aglomeração nessas amostras. Esses núcleos eram de qualidade e quantidade suficientes para suportar o processamento e a análise a jusante. Solução de problemas semelhantes e otimização de protocolo podem se estender a outros tipos de células criopreservadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66490/66490fig01v2.jpg"> Figura 1: Diagrama ilustrando a extração de núcleos de células criopreservadas. Representação visual detalhando as etapas envolvidas no isolamento nuclear de células criopreservadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66490/66490fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66490/66490fig02.jpg"> Figura 2: Núcleos isolados de células derivadas de iPSC humanas criopreservadas. Núcleos isolados de células estromais/endoteliais aderentes coradas com azul de tripano mostram detritos significativos (A) pequenas partículas e (B) agregados nucleares (partículas grandes) que impediram análises a jusante. Após a realização das modificações técnicas aqui apresentadas, núcleos de alta qualidade foram isolados de (C) células progenitoras hematopoiéticas derivadas de iPSC humanas criopreservadas ou (D) populações de células estromais/endoteliais em quantidades suficientes para suportar análises a jusante. Para referência, essas células progenitoras hematopoiéticas não aderentes foram coletadas no dia 9 + 8 e células estromais/endoteliais aderentes no dia 9 + 7 da diferenciação hematopoiética, conforme descrito em4. Observe que a morfologia nuclear pode diferir entre os tipos de células. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66490/66490fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Preparação do tampão</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Buffer de lise de 0,5X</td>
			<td>Estoque</td>
			<td>Final</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>1X tampão de lise</td>
			<td>1X</td>
			<td>0,5 vezes</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão de diluição de lise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão de lise</td>
			<td>Estoque</td>
			<td>Final</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Digitonina</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>6 μl</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Substituto Nonidet P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Água livre de nuclease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,67 mL</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNase</td>
			<td>40 U/μl</td>
			<td>1 U/μl</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7,4)</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Interpolação-20</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Tampão de diluição de lise</td>
			<td>Estoque</td>
			<td>Final</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>6 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Água livre de nuclease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,72 mL</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNase</td>
			<td>40 U/μl</td>
			<td>1 U/μl</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7,4)</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Preparação do tampão de lise 0,5x. Esta solução é designada para o procedimento de isolamento dos núcleos na etapa 4.2. O tampão de lise e o tampão de diluição de lise são misturados para preparar o tampão de lise de 0,5x. É imperativo preparar um novo tampão imediatamente antes de cada experimento e mantê-lo no gelo. Observe que a solução de problemas para alguns tipos de células pode envolver diluições 1x, 0,5x ou inferiores de tampão de lise para facilitar o isolamento do núcleo intacto.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Preparação do tampão</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tampão de lavagem</td>
			<td>Estoque</td>
			<td>Final</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>12 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8 μL</td>
		</tr><tr><td>Água livre de nuclease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3,40 ml</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNase</td>
			<td>40 U/μl</td>
			<td>1 U/μl</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7,4)</td>
			<td>1 milhão</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr><tr><td>Interpolação-20</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Preparação do tampão de lavagem. Esta solução é utilizada durante o isolamento dos núcleos. Este deve ser preparado fresco antes de cada experimento e mantido no gelo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Preparação do tampão</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tampão de núcleos diluídos</td>
			<td>Estoque</td>
			<td>Final</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>Água livre de nuclease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de núcleos</td>
			<td>20X</td>
			<td>1X</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNase</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Preparação do tampão de núcleos diluídos. Esta solução é usada na etapa 5.2. Deve ser preparado fresco antes de cada experimento e mantido no gelo.

Descrevemos um protocolo para extrair núcleos de alta qualidade de tipos de células estromais/endoteliais e sanguíneas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por criopreservas, para apoiar análises de sequenciamento de próxima geração de núcleo único. A produção de núcleos intactos e de alta qualidade é imperativa para experimentos multiômicos, mas pode ser uma barreira à entrada no campo para alguns laboratórios.

Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based models are excellent platforms to understand blood development, and iPSC-derived blood cells have translational ...

Meu laboratório estuda genes e mecanismos que afetam a formação de células sanguíneas. Produzimos células sanguíneas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e queremos fazer isso de forma mais eficiente para apoiar a produção em escala clínica de terapias celulares adaptadas para pacientes específicos. Usamos modalidades genômicas de célula única para identificar padrões na expressão gênica e outros fatores que podem ajudar a apoiar a formação de células sanguíneas.Um grande desafio para a produção de células sanguíneas in vitro é que é caro e ineficiente. Estamos usando abordagens genéticas para resolver isso. Queremos usar pistas da genética humana e da hematopoiese in vivo para orientar as melhorias que fazemos no sistema in vitro.Estamos tentando usar genômica funcional e análises de núcleo único para avançar no campo em termos de identificação de genes e redes de sinalização que impulsionam a formação dos tipos certos de células sanguíneas in vitro. A criação de um conjunto de dados multiômicos de alta qualidade nos ajudou a descobrir fatores de transcrição, energia e maquinário regular que impulsionam a diferenciação in vitro das células sanguíneas. Estamos usando esses dados para entender dados genéticos humanos, como loci, e fatores incertos que estão impulsionando a diferenciação que não conseguimos ver antes.Estamos muito entusiasmados em desenvolver insights desses conjuntos de dados multimodais que conseguimos gerar com base no isolamento de núcleos de alta qualidade. Pretendemos concentrar nossos estudos futuros em genes e mecanismos de desenvolvimento que podem produzir tipos de células sanguíneas, em última análise, em escala clínica in vitro.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Aprenda a isolar núcleos de alta qualidade a partir de células sanguíneas derivadas de iPSCs criopreservadas para análises de sequenciamento de núcleo único. Este protocolo avança pesquisas em genômica e terapia celular.

Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

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