Name: Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprenda a rastrear a fibrinólise de coágulos sanguíneos formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento usando o ensaio RT-FluFF. Este método melhora a relevância fisiológica dos testes de trombólise in vitro.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01HL167877. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os métodos mencionados abaixo estão de acordo com os protocolos do conselho de revisão institucional (IRB) e do comitê institucional de ética em pesquisa humana. Todos os voluntários saudáveis forneceram consentimento informado e por escrito antes da doação de sangue. É importante observar que todos os materiais referenciados no protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Embora o WB e o plasma humanos sejam discutidos ao longo deste protocolo, o uso de sangue animal de pesquisa e produtos sanguíneos com fator depletado pode ser comprado e substituído.
1. Coleta de sangue total
<ol><li>Colete sangue total venoso (WB) de voluntários saudáveis consentidos usando técnicas padrão de flebotomia. CUIDADO: Certifique-se de que as precauções universais sejam seguidas para reduzir o risco de contato com sangue ou outros materiais potencialmente infecciosos em todo este protocolo. O uso de luvas, jaleco e protetor facial são necessários.</li>
	<li>Colete ~ 50 mL de WB diretamente em tubos de citrato de sódio a 3,2% e agrupe imediatamente em tubos de 50 mL para uso subsequente. NOTA: Um tubo de descarte antes da coleta de sangue no tubo de citrato é necessário, além de garantir que os tubos sejam preenchidos até o volume recomendado pelo fabricante. WB recém-coletado recapitulará melhor a dinâmica de coagulação do hospedeiro. O armazenamento de curto prazo de WB em temperatura ambiente (≤4 h antes do uso) é permitido. WB não é armazenado durante a noite, pois isso demonstrou afetar a dinâmica de coagulação quando examinado por tromboelastografia15.</li>
</ol>2. Formação de coágulos
<ol><li>Em 3 mL de sangue total citrato, adicione fibrinogênio marcado com fluorescência (isotiocianato de fluoresceína [FITC]) (FITC-Fg) a uma concentração final de 60 μg / mL (proporção de 1:50 fibrinogênio marcado com fluorescência para fibrinogênio não modificado assumindo uma concentração plasmática endógena de fibrinogênio de 3 mg / mL). NOTA: Esta proporção pode ser aumentada para até 1:10 com impacto mínimo na morfologia do coágulo. 13,14 O fibrinogênio marcado com fluorescência pode ser comprado ou gerado pela reação do fibrinogênio com isotiocianato de fluoresceína (FITC). A mistura de fibrinogênio deve ser feita ≤5 minutos antes do início da corrida.<ol><li>Se o fibrinogênio tiver sido previamente aliquotado e congelado, inspecione o FITC-Fg descongelado para garantir que a polimerização não tenha começado prematuramente, tornando-o inutilizável (certifique-se da ausência de partículas ou fibras na solução).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar a configuração do laço de Chandler com um tambor de 120 mm de diâmetro em banho-maria a 37 °C (figura 1). Certifique-se de que o dispositivo de loop de Chandler seja capaz de girar a uma taxa de rotação fixa de 0-90 rpm durante todo o processo de formação do coágulo. NOTA: Configuração e modificações adicionais do loop de Chandler podem ser encontradas em Zeng et al.16.</li>
	<li>Corte a tubulação (diâmetro interno 5/32", diâmetro externo 7/32") e forme laços que se encaixem firmemente, mas não firmemente ao redor do tambor. Para o tamanho de tubo recomendado discutido aqui, corte um tubo PCR padrão de 200 μL para uso como encaixe para conectar as extremidades do tubo para formar o circuito fechado. NOTA: Diferentes tamanhos de tubos podem ser utilizados para produzir coágulos de tamanhos diferentes16.</li>
	<li>Inicie a coagulação do sangue adicionando 200 mM de solução de cloreto de cálcio na proporção de 1:17 de solução de cálcio ao sangue total. Carregue o sangue no tubo (preencha ~ 50% do volume do tubo) usando uma seringa de 3 mL. Coloque imediatamente o laço no tambor de laço Chandler conectando as extremidades e comece a rotação.<ol><li>Garanta a mistura adequada com uma inversão suave antes do carregamento para evitar problemas decorrentes do assentamento dos componentes WB.</li>
		<li>Certifique-se de que uma quantidade igual de sangue seja adicionada a cada tubo a cada corrida, pois isso pode afetar o tamanho do coágulo se não for mantido consistente.</li>
		<li>Como as bolhas dentro da coluna de sangue também podem afetar a coagulação do sangue, remova-as movendo suavemente o tubo de maneira semelhante a uma "gangorra" para facilitar a fuga das bolhas antes de carregá-las no tambor.</li>
	</ol></li>
	<li>Gire o tambor parcialmente submerso no banho-maria a uma taxa de rotação de 40 RPM para atingir uma taxa de cisalhamento calculada de ~ 450 s-1. NOTA: Consulte Zeng et al. para obter informações sobre tesouras calculadas com base no tamanho da tubulação e na velocidade de rotação (20 a 60 RPM)16. As taxas de cisalhamento venoso e arterial típicas são 20-200 s-1 e 300-1.000 s-1, respectivamente, com ~ 400-500 s-1 sendo representativos da artéria pulmonar.</li>
	<li>Deixe os coágulos se formarem por 40-60 min em condições de pouca luz para minimizar o fotobranqueamento do fibrinogênio marcado com fluorescência.</li>
	<li>Depois que o tempo de coagulação desejado for atingido, remova os coágulos da tubulação e use-os imediatamente. Para garantir a remoção suave dos coágulos sem comprometer a estrutura, inverta suavemente o tubo para permitir que o coágulo deslize lentamente para fora do tubo para um pequeno recipiente. NOTA: O armazenamento de coágulos formados em plasma citrato ou PBS durante a noite a 4 °C pode afetar a análise subsequente da digestão do coágulo no circuito de fluxo.</li>
</ol>3. Configuração do instrumento RT-FluFF
<ol><li>Certifique-se de que o aparelho de loop de fluxo esteja conectado conforme mostrado na Figura 2 e que todas as conexões estejam seguras. Em suma, o aparelho de loop de fluxo inclui, na ordem da direção do fluxo: Bomba > Amortecedor > Sensor de Pressão de Entrada > Coágulo > Sensor de Pressão de Saída > Fluorômetro > Reservatório Aquecido > Bomba. Ajuste a seleção da capacidade da bomba, vazão experimental, diâmetro e comprimento da tubulação, temperatura, volume do reservatório e tamanho/geometria do coágulo para atender às necessidades experimentais exclusivas de cada estudo. NOTA: Para este exemplo, a tubulação de mesmo diâmetro usada no loop de Chandler foi usada para RT-FluFF. A tubulação pode ser usada para várias execuções no mesmo dia, mas precisa ser monitorada quanto a degradação ou vazamento e trocada/enxaguada conforme necessário. Recomenda-se o enxágue com água destilada morna entre as corridas. Dependendo do projeto experimental, pode ser necessário substituir a tubulação após cada execução.</li>
	<li>Assim que toda a tubulação estiver presa, ligue o monitor de pressão. Verifique se o monitor de pressão lê 0 mmHg para os sensores de entrada e saída. Caso contrário, abra as válvulas para garantir que os sensores de pressão estejam abertos à pressão atmosférica e zere os sensores.</li>
	<li>Ligue o bloco de aquecimento ou banho-maria que está sendo usado e monitore a temperatura ao longo do experimento. Mantenha a temperatura próxima a 37 °C para imitar a temperatura fisiológica do corpo humano.</li>
	<li>Ligue a bomba na vazão desejada para verificar se há vazamentos e verificar se os sensores de pressão estão funcionando. NOTA: Uma taxa de fluxo de ~ 160 mL / min neste tamanho de tubulação representará uma taxa de cisalhamento de ~ 500 s-1.</li>
	<li>Desligue a bomba para facilitar o carregamento do coágulo.</li>
</ol>4. Carregando o coágulo no circuito de fluxo
<ol><li>Se um coágulo feito anteriormente que foi armazenado estiver sendo usado, certifique-se de levar o coágulo à temperatura ambiente antes de carregá-lo no sistema de loop de fluxo.</li>
	<li>A perda de massa do coágulo é uma importante medida de desfecho para ensaios de trombólise. É uma prática recomendada medir a massa do coágulo antes de carregá-lo no circuito de fluxo, em vez de confiar em medições anteriores.<ol><li>As medições da massa do coágulo devem sempre ser feitas da mesma maneira todas as vezes para garantir a consistência entre as amostras e os dias de ensaio, pois o conteúdo líquido dentro e sobre os coágulos pode afetar significativamente sua massa. A melhor prática é secar suavemente os coágulos nos lenços de laboratório até que eles não liberem mais uma quantidade significativa de líquido no lenço, tomando cuidado para não comprimir o coágulo durante o processo de medição.</li>
	</ol></li>
	<li>Mergulhe o coágulo no plasma (autólogo ou com correspondência de tipo) ou outra solução de fase móvel usada no circuito de fluxo (como PBS ou meio definido) em um recipiente raso, como um prato de pesagem. A solução em fase móvel deve ser retirada diretamente do reservatório do sistema de 50 mL para controlar o volume total do sistema. Nenhum agente de teste trombolítico ou farmacêutico deve estar presente durante o estágio de carga do coágulo. Recomenda-se que o volume total da fase móvel para executar o loop de fluxo seja de ≥50 mL e deve ser consistente em todas as amostras.</li>
	<li>Remova a seção central da tubulação do loop de fluxo (entre os sensores de entrada e saída) e conecte uma seringa de 10 mL a uma extremidade da tubulação.</li>
	<li>Usando a extremidade livre do tubo, coloque-o no plasma (ou fase móvel) e pegue um pequeno volume da solução para preparar o tubo. Em seguida, coloque a entrada do tubo perto do coágulo, examinando cuidadosamente o coágulo para identificar a cabeça (normalmente a extremidade ligeiramente mais grossa do coágulo) e a cauda (extremidade oposta à cabeça). A cabeça do coágulo deve ser posicionada em direção ao sensor de pressão de entrada e longe da saída. Coloque o tubo na extremidade da "cauda" do coágulo e aspire-o para dentro do tubo com a seringa. NOTA: nos casos em que a direcionalidade da cabeça/cauda do coágulo não pode ser determinada visualmente, a direcionalidade pode ser melhor atribuída com base no conhecimento da direção de rotação do loop de Chandler - a cabeça do coágulo está voltada para a direção oposta da rotação do tambor.</li>
	<li>Conecte a tubulação de volta ao aparelho principal de forma que o coágulo fique mais próximo do sensor de pressão de saída (a cabeça do coágulo deve estar voltada para longe do sensor de saída). Prenda o coágulo em sua posição perfurando o tubo e a cabeça do coágulo com duas agulhas de 30 G em um padrão "X". Deixe essas agulhas durante a corrida. NOTA: Dependendo do dampener e das configurações da bomba, agulhas adicionais podem ser necessárias para garantir que o coágulo não se fragmente prematuramente. Se necessário, uma tela pode ser adicionada à tubulação a jusante do coágulo para evitar que fragmentos de coágulo circulem no sistema. Uma vez que um número definido de agulhas tenha sido estabelecido para reter o coágulo, mantenha-o consistente em todas as condições.</li>
	<li>Pegue o restante da solução de fase móvel e coloque-o em um tubo de 50 mL como reservatório.</li>
	<li>Coloque o reservatório no banho-maria e coloque a tubulação de entrada e saída (a saída é do fluorômetro e a entrada vai para o cabeçote da bomba).</li>
	<li>Verifique se o fluorômetro que está sendo usado está conectado e monitorado. Verifique se o valor inicial é apropriado em comparação com uma linha de base do sistema somente de fase móvel no início do experimento. NOTA: Se um fluorômetro em linha não estiver disponível, a amostragem periódica em série do reservatório pode ser realizada em intervalos definidos durante todo o período de análise do loop de fluxo. As frações coletadas podem ser lidas usando uma placa de 96 poços imediatamente após a conclusão do experimento em qualquer espectrofotômetro disponível comercialmente.</li>
	<li>Adicione 500 μL de 100.000 ng/mL de tPA diretamente ao volume do reservatório para atingir uma concentração final de 1.000 ng/mL de tPA em 50 mL. O volume, a concentração e o medicamento específico adicionado dependerão da concentração circulante desejada e do volume do reservatório do sistema.</li>
	<li>Verifique o seguinte antes de ligar a bomba:<ol><li>Todos os cruzamentos são seguros.</li>
		<li>As duas válvulas acima dos sensores de pressão estão na posição fechada apropriada.</li>
		<li>Qualquer plasma residual (ou fluido) foi reposto no reservatório.</li>
		<li>O trombolítico foi adicionado ao reservatório e devidamente misturado.</li>
		<li>A tubulação de entrada está perto do fundo do reservatório (isso garante bolhas mínimas).</li>
		<li>A tubulação de saída está segura e na altura apropriada para a pressão desejada (dependendo da localização do vaso que está sendo modelada).</li>
		<li>O sentido de rotação da bomba está correto (Ordem de fluxo: Bomba > Dampener > Coágulo > Fluorômetro > Reservatório > Bomba).</li>
		<li>Se as RPMs da bomba forem muito altas (>150 rpm), comece em uma velocidade mais lenta e aumente para garantir que a rápida mudança de pressão não fragmente o coágulo ou cause vazamento na tubulação.</li>
		<li>Certifique-se de que o sistema esteja registrando os dados adequadamente do fluorômetro e/ou que os suprimentos estejam preparados para amostragem periódica da fase móvel para leituras de ponto de tempo pós-experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligue a bomba e ajuste-a para atingir a vazão volumétrica desejada de 160 mL/min ou aumente a vazão até que a pressão desejada seja alcançada. O sistema se encherá de fluido e bolhas. As bolhas aumentarão artificialmente as leituras fluorométricas, portanto, observe se as bolhas se dissiparem. Quando o fizerem, apague as luzes e comece a aquisição de dados.</li>
	<li>Deixe a bomba funcionando até que o coágulo esteja significativamente degradado ou o tempo experimental desejado tenha decorrido (≥60 min). Adicione reagentes, conforme necessário, ao sistema durante todo o experimento através do reservatório para criar condições experimentais únicas testando uma variedade de variações trombolíticas. NOTA: O tempo experimental dependerá da vazão da bomba (nível de cisalhamento) e da concentração de trombolítico.</li>
	<li>Uma vez concluído o ensaio, reduza a vazão volumétrica e remova a tubulação de entrada enquanto a bomba ainda estiver funcionando para empurrar a maior parte do fluido do sistema para o reservatório (alguma fase móvel permanecerá na tubulação). Desconecte a seção da tubulação contendo coágulo no lado do sensor de pressão de saída da tubulação e abaixe-a em um barco de pesagem.</li>
	<li>Remova as agulhas que prendem o coágulo no lugar para coletar o fluido remanescente de dentro do sistema e os fragmentos do coágulo/coágulo. Use uma seringa para ajudar a limpar o sistema conforme necessário.</li>
	<li>Pesar e processar o coágulo restante para análise adicional, como o cálculo da porcentagem de massa perdida ou para histologia.</li>
</ol>5. Limpando o sistema
<ol><li>Entre as amostras, enxágue todo o sistema com água morna em alta rotação (>150 rpm). Carregue a água no reservatório e passe pelo sistema por pelo menos 2 min, esvazie e corra novamente para dois enxágues completos do sistema. Após esses enxágues, se a leitura do fluorômetro não retornar à linha de base, repita o processo de enxágue por um ciclo adicional. Se ainda não tiver retornado à linha de base, troque completamente a tubulação antes de analisar a próxima amostra. NOTA: Durante os experimentos, a tubulação pode ser reutilizada entre as amostras; No entanto, devido à perfuração com agulhas usadas para manter o coágulo no lugar, a seção da tubulação entre os sensores de pressão de entrada e saída deve ser substituída após cada execução. Em algumas condições experimentais, pode ser necessário substituir todo o conjunto de tubos após cada execução ou ensaios de agrupamento para eliminar qualquer contaminação cruzada da amostra.</li>
	<li>Depois que todas as amostras tiverem sido executadas para a experimentação daquele dia, remova todos os tubos e descarte. Esfregue as junções em T com água quente e uma escova de cerdas até ficarem limpas e deixe secar e enxágue a seringa dampeners com água quente. Use 70% de EtOH para ajudar na esterilidade.</li>
</ol>

Combinando o Chandler Loop e o RT-FluFF para monitoramento de lise de coágulos ex vivo

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Formação e rotulagem de coágulos A alça de Chandler demonstrou fornecer um meio fácil e eficaz de gerar coágulos de forma reprodutível que imitam trombos in vivo 16. Parâmetros de ajuste fino, como tamanho da tubulação, velocidades de rotação, diâmetro do tambor e tempo de coagulação, permitem a rápida geração de coágulos sob diferentes condições de cisalhamento que podem capturar características arquitetônicas apreciadas em uma variedade de trombos que imitam fontes a...

As doenças decorrentes fundamentalmente de etiologias tromboembólicas apresentam uma importante fonte de morbidade e mortalidade na sociedade atual. As manifestações da patogênese tromboembólica incluem, mas não estão limitadas a, infartos do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, tromboses venosas profundas e embolia pulmonar1. Uma enorme quantidade de pesquisas em andamento, abrangendo várias disciplinas, gira em torno do desenvolvimento de métodos seguros e eficazes para lidar com a trombose patogênica. Variações nas manifestações arteriais e venosas da trombose e localizações anatômicas variadas resultaram no desenvolvimento de diferentes abordagens de tratamento. No entanto, o tratamento agudo geralmente depende do uso de trombólise farmacológica via ativadores de plasminogênio com potencial para trombectomia mecânica em certas circunstâncias clínicas2.
O desenvolvimento de novas estratégias de tratamento farmacológico depende fundamentalmente de modelos animais in vivo e modelos de digestão in vitro para testes pré-clínicos 3,4. Os modelos in vivo se beneficiam naturalmente de sua capacidade de capturar a complexa interação de vários parâmetros fisiológicos na eficácia do tratamento, que incluem a depuração de agentes farmacêuticos, bem como interações celulares com medicamentos. No entanto, essa mesma complexidade geralmente torna esses modelos bastante caros e introduz problemas adicionais ao tentar isolar a farmacodinâmica / cinética subjacente em animais que diferem significativamente da fisiologia humana. O desenvolvimento de modelos in vitro ajudou a facilitar um ambiente de teste destilado no qual o desenvolvimento e a triagem de medicamentos podem ser realizados, mas muitas vezes carecem da fidelidade necessária para recapitular o estado da doença que está sendo estudado.
Protocolos in vitro comumente encontrados para testar novos trombolíticos dependem da utilização de coágulos formados e lisados sob condições estáticas, em que a massa residual do coágulo serve como desfecho primário 5,6. Infelizmente, essas técnicas não levam em conta os aspectos mecânicos da lise do coágulo, como fluxo turbulento e quedas de pressão transtrombo, que podem alterar significativamente a farmacodinâmica dos medicamentos em teste. Além disso, os coágulos formados sob condições estáticas contêm microarquitetura que difere dos coágulos fisiológicos. A presença de cisalhamento durante a formação do coágulo demonstrou reprodutivelmente afetar as características do coágulo resultante, como ativação plaquetária e reticulação da fibrina. Os coágulos produzidos sob fluxo de cisalhamento exibem heterogeneidade complexa da ponta à cauda que está ausente em coágulos formados estaticamente 7,8. Tais desvios da arquitetura fisiológica do coágulo podem afetar a importante caracterização do desenvolvimento de medicamentos que inclui a penetração do medicamento dentro de um trombo e a subsequente eficiência da lise9.
Para abordar algumas dessas limitações associadas ao uso de modelos estáticos de coagulação / lise de coágulo, a adoção da alça de Chandler para formação de coágulos e lise de coágulos na presença de cisalhamento ressurgiu10. Embora tais sistemas permitam uma melhor representação da dinâmica do fluxo e gerem coágulos com arquitetura fisiologicamente mais relevante em comparação com ensaios relativamente estáticos, suas condições de fluxo simplificadas ainda representam um desvio das condições fisiológicas. Por fim, abordagens microfluídicas também foram realizadas devido à sua facilidade de imagem e padrões de fluxo uniformes; no entanto, eles permanecem uma remoção significativa das condições fisiológicas esperadas dentro dos vasos maiores afetados principalmente na maioria dos distúrbios tromboembólicos clinicamente relevantes 11,12.
Com a discussão acima em mente, desenvolvemos um modelo de trombólise in vitro de alta fidelidade para triagem pré-clínica de drogas trombolíticas. O modelo visa abordar algumas das armadilhas atuais detalhadas acima no domínio da nova triagem de terapia trombolítica e foi validado quanto à reprodutibilidade e sensibilidade em concentrações variadas de ativador de plasminogênio tecidual (tPA). O sistema aqui descrito oferece fluxos de cisalhamento fisiológicos utilizando uma bomba peristáltica, um amortecedor de pressão, um reservatório aquecido, dois sensores de pressão, um fluorômetro em linha e um análogo de coágulo formado por cisalhamento de Chandler marcado com fluorescência para facilitar o rastreamento em tempo real da fibrinólise13. Em conjunto, o sistema geral é chamado de Ensaio de Fibrinólise de Fluxo Fluorométrico em Tempo Real (RT-FluFF Assay)14 e este manuscrito discutirá os meandros da configuração e execução bem-sucedidas de ensaios neste modelo de trombólise in vitro de alta fidelidade.

<table><tbody><tr><td>30 G&nbsp; Agulhas Hipodérmicas Descartáveis</td><td>Exel International&nbsp;</td><td>26439</td><td>Outros consumíveis</td></tr><tr><td>6 mm HSS Ferramenta de estoque de barra de torno 150 mm de comprimento</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>loop Chandler,&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplaca transparente UV de fundo plano transparente de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3635</td><td>Outros consumíveis, copolímero acrílico não tratado, seringas não estéreis</td></tr><tr><td>Air-Tite Luer-lock não esterilizadas de 60 mL Aparelho</td><td>Air-Tite</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF, amortecedores</td></tr><tr><td>Sistema de água ultrapura Arium Mini Plus</td> Fonte de água <td>Sartorius</td><td>NA</td><td>DI</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5670</td><td>Outros consumíveis</td></tr><tr><td>Transdutores BP descartáveis</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td>Aparelho RT-FluFF</td></tr><tr><td>Drager Siemans HemoMed Pod</td><td>Drager</td><td>5588822</td><td>Aparelho RT-FluFF</td></tr><tr><td>Drager Siemans Monitor de Paciente</td><td>Drager</td><td>SC 7000</td><td>Aparelho RT-FluFF</td></tr><tr><td>Tambor (cilindro, diâmetro 120 mm, largura 85 mm)</td><td></td><td></td> <td>Laço Chandler,</td></tr> <tr><td>Face Shield</td><td>Moxe</td><td>SHIELDS10</td><td>Loop de Chandler,&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibrinogênio de plasma humano, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>Outros consumíveis</td></tr><tr><td>Encaixe, policarbonato, torneira de quatro vias, Luer Lock macho, não estéril</td><td>Masterflex</td><td>30600-04</td><td>RT-FluFF aparelho</td></tr><tr><td>Fluoresceína (FITC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>outros consumíveis banho-maria</td></tr><tr><td>de uso geral</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>Loop de Chandler,&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Aquecimento 4 & 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>RT-FluFF Aparelho</td></tr><tr><td>Fonte Humana Plasma Fresco-Congelado</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>Outros Consumíveis, anticoagulante CPDA-1</td></tr><tr><td>Sangue Humano Total&nbsp;</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-WB-SDS&nbsp;</td><td>Outros consumíveis, anticoagulante CPDA-1</td></tr><tr><td>L/S Easy-Load II Cabeça de Bomba para Tubulação de Precisão de Alto Desempenho, Carcaça PPS, Rotor SS</td><td>Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF Aparelho, Cabeça de Bomba</td></tr><tr><td>L/S Bomba de Acionamento Digital de Velocidade Variável com E/S Remota, 6 a 600 rpm; 90 a 260 VAC</td><td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF Aparelho, Controlador de</td></tr><tr><td>Velocidade do Motor</td><td>da Bomba CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Conectores Tipo T da Nalgene</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>RT-FluFF</td></tr><tr><td>Aparelho Tubulação de bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>06424-15&nbsp;</td><td>Outros consumíveis</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>Outros Consumíveis, Pó, pH 7.4, para preparar soluções de 1 L</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação Comutada</td><td>SoulBay</td><td>UC03U</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringas descartáveis de plástico Thermo Scientific National Target 10 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>outros consumíveis</td></tr><tr><td>Ativador de plasminogênio de tecido, humano</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0831</td><td>Outros consumíveis</td></tr><tr><td>ID de tubulação 1/4 '', OD 3/8 ''</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>outros consumíveis, cortados em seções de 1,5 cm para conectar a tubulação a conectores</td></tr> <tr><td>tipo TID da tubulação 5/32", OD 7/32"</td><td>Tygon</td><td>ND-100-65, ADF 00009&nbsp;</td><td>Outros consumíveis</td></tr><tr><td>V3 365 nm Mini - Luz Negra UV Lanterna</td><td>uvBeast</td><td>uvB-V3-365-MINI</td><td>Chandler loop, usado para verificar coágulos completos</td></tr><tr><td>ZGA37RG ZYTD520 Motor DC, 12 V, 100 rpm</td><td>Pangyoo</td><td>ZGA37RG</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

O tromboembolismo e as complicações relacionadas são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo e vários ensaios foram desenvolvidos para testar a eficiência dos medicamentos trombolíticos in vitro e in vivo. Há uma demanda crescente por modelos de coágulos in vitro fisiologicamente mais relevantes para o desenvolvimento de medicamentos devido à complexidade e ao custo associados aos modelos animais, além de sua frequentemente falta de traduzibilidade para a fisiologia humana. Fluxo, pressão e taxa de cisalhamento são características importantes do sistema circulatório, com coágulos formados sob fluxo exibindo morfologia e características de digestão diferentes dos coágulos formados estaticamente. Esses fatores geralmente não são representados em ensaios convencionais de digestão de coágulos in vitro , o que pode ter implicações farmacológicas que afetam as taxas de sucesso da tradução de medicamentos.
O ensaio defluorólise orométrica de Flowing (RT-FluFF) foi desenvolvido como uma plataforma de teste de trombólise de alta fidelidade que usa coágulos marcados com fluorescência formados sob fluxo de cisalhamento, que são então digeridos usando plasma circulante na presença ou ausência de agentes farmacêuticos fibrinolíticos. Modificar as taxas de fluxo das etapas de formação e digestão do coágulo permite que o sistema imite as condições arteriais, pulmonares e venosas em configurações experimentais altamente diversas. As medições podem ser feitas continuamente usando um fluorômetro em linha ou tomando pontos de tempo discretos, bem como uma medição convencional da massa do coágulo do ponto final. O ensaio RT-FluFF é um sistema flexível que permite o rastreamento em tempo real da digestão do coágulo sob condições de fluxo que representam com mais precisão as condições fisiológicas in vivo, mantendo o controle e a reprodutibilidade de um sistema de teste in vitro.

Formação de coágulo de alça de Chandler Na formação de coágulos, geralmente buscamos quadruplicados para garantir que, se existissem outliers de coágulos (com base na morfologia bruta e na massa), ainda tivéssemos a capacidade de executar ensaios de trombólise triplicada. Assumindo condições ideais de carga, os coágulos devem ser todos bastante uniformes em comprimento (~ 3,3 cm), peso (~ 100 mg) e aparência, conforme representado na Figura 3. Ao empregar o FITC-Fg, també...

Os ensaios de trombólise in vitro muitas vezes têm lutado para replicar as condições in vivo, seja no trombo modelo que está sendo digerido ou no ambiente em que a trombólise está ocorrendo. Aqui, exploramos como o acoplamento do loop de Chandler e do ensaio de fibrinólise de fluxo fluorométrico em tempo real (RT-FluFF) é usado para monitoramento de lise de coágulo de alta fidelidade, ex-vivo.

Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

A trombose está associada a inúmeras condições médicas e os tratamentos atuais correm o risco de sangramento grave. O fluxo do sistema circulatório afeta significativamente a estrutura do coágulo sanguíneo. A incorporação do fluxo em modelos in vitro pode melhorar sua relevância fisiológica, aprimorando a seleção de melhores candidatos para testes in vivo.Os ensaios para o estudo de fibrinolíticos utilizam predominantemente coágulos estáticos ou sistemas microfluídicos para avaliar propriedades como tempo de lise, estrutura do coágulo ou viscoelasticidade. Os ensaios estáticos de lise do coágulo geralmente dependem de medições espectrofotométricas ou determinação da massa do coágulo como pontos finais para avaliar a eficiência da fibrinólise. O teste trombolítico atual usa coágulos formados estaticamente, que diferem estruturalmente daqueles formados em condições de fluxo.Os sistemas microfluídicos consideram a dinâmica do fluxo, mas suas escalas menores criam hemodinâmica e estruturas de coágulo únicas. O ensaio RT-FluFF atualmente desenvolvido facilita o monitoramento da fibrinólise em tempo real em condições fisiológicas de fluxo. Isso significa que agora temos uma plataforma qu

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O modelo de trombose induzida por FeCl3 em camundongos é descrito aqui. Um método para monitorar o crescimento do trombo por observação de microscopia intravital em um vaso mesentérico e por medição do fluxo sanguíneo na artéria carótida é apresentado.

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Nós relatamos um procedimento refinada do cloreto férrico (FeCl3) modelos de trombose induzidas na carótida e mesentérica artéria, bem como veia, caracterizado de forma eficiente através de microscopia intravital para monitorar tempo para oclusiva formação de trombos.

Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

A fibrina é responsável pela formação de coágulos durante a hemostasia e trombose. Ensaios de turbidez e tromboelastograhy (TEG) podem ser utilizados como ferramentas sinérgicas que fornecem avaliação complementar de um coágulo. Essas duas técnicas juntas podem dar mais informações sobre como as condições de coagulação afetam a formação de coágulos fibrinas.

Alavancando a Turbidez e a Tromboelastografia para Caracterização Complementar do Coágulo

Apresentado aqui é um protocolo para um modelo de loop hemodinâmico in vitro padronizado. Este modelo permite testar a hemocompatibilidade de tubos de perfusão ou stents vasculares de acordo com a norma ISO (Organização Internacional para Padronização) 10993-4.

Um modelo de loop hemodinâmico in vitro para investigar a hemocitocompatibilidade e ativação celular hospedeira de dispositivos médicos vasculares

Os modelos tradicionais de AVC fototrombótico (STP) induzem principalmente agregados plaquetários densos de alta resistência ao tratamento lítico com ativador do plasminogênio tecidual (tPA). Aqui um modelo de PTS murino modificado é introduzido pela co-injeção de trombina e corante fotossensível para fotoativação. O modelo de PTS com trombina produz coágulos mistos plaquetas:fibrina e é altamente sensível à trombólise tPA.

Modelo de AVC fototrombótico enriquecido com fibrina e sensível ao tPA

A entrega de líticos auxiliados por histotripsy ou a lysotripsy está em desenvolvimento para o tratamento de trombose venosa profunda. Um procedimento in vitro é apresentado aqui para avaliar a eficácia desta terapia combinada. São discutidos protocolos-chave para o modelo de coágulo, orientação de imagem e avaliação da eficácia do tratamento.

Um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Aprenda a rastrear a fibrinólise de coágulos sanguíneos formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento usando o ensaio RT-FluFF. Este método melhora a relevância fisiológica dos testes de trombólise in vitro.

Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro (Vídeo) | JoVE Journal

Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro

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