Analisando interações DNA-proteína com interferometria de biocamada baseada em estreptavidina
17 de janeiro de 2025
Este artigo descreve um protocolo para estudar as interações DNA-proteína usando um sistema de interferometria de biocamada (BLI) baseado em estreptavidina. Ele descreve as etapas e considerações essenciais para a utilização da cinética de ligação básica ou avançada para determinar a afinidade de ligação de equilíbrio (KD) da interação.
As interações de biomoléculas, incluindo interações proteína-proteína e proteína-DNA, são essenciais na pesquisa bioquímica. Neste estudo, usamos interferometria de biocamada, ou BLI, uma técnica eficiente para analisar essas interações. Nós nos concentramos na proteína de replicação A e sua afinidade de ligação por um DNA de fita única para mostrar os princípios e capacidades do BLI.
A interferometria de biocamada é um método fácil e econômico para estudar a cinética de proteínas. Ele permite o monitoramento rápido em tempo real das interações de proteínas e oferece um fluxo de trabalho direto com menos complexidade do que outras técnicas. Em nosso laboratório, estudamos o impacto das modificações pós-traducionais na estrutura e função das proteínas que são essenciais para manter a estabilidade do genoma.
Essas modificações podem iniciar efeitos em cascata nas vias de replicação e reparo. Ao estudar as interações de proteínas, pretendemos descobrir os mecanismos subjacentes que protegem a integridade do genoma. Para começar, prepare 12,5 nanomolares de três substratos de isca poli dT 32 de fita simples bio prime e quatro concentrações de RPA usando tampão BLI.
Usando uma pipeta, adicione 250 microlitros de tampão BLI em dois tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro e rotule-os como AND. Em uma placa separada de 96 poços, pipete 200 microlitros de tampão BLI em um poço. Posicione a bandeja de biossensores na placa de 96 poços de forma que um biossensor mergulhe no tampão BLI.
No software, clique na opção hidratar e defina o cronômetro para 10 minutos. Ajuste as configurações de execução para cada etapa, linha de base, associação e dissociação. Clique em executar no software e siga as instruções na mensagem de prompt.
Coloque dois compartimentos no suporte do tubo e conecte o biossensor hidratado ao sistema BLI. Deslize o suporte do tubo sob o biossensor na posição A e monitore a linha de base do biossensor. Depois de completar a linha de base inicial, abra a tampa e adicione quatro microlitros de tampão BLI ao porta-gotas.
Deslize o suporte de gota para a direita sob o mesmo biossensor na posição B.Assim que a tampa estiver fechada, monitore a curva BLI no software. Em seguida, abra a tampa e substitua o tubo A pelo tubo D.Deslize o novo tubo sob o biossensor na posição A antes de fechar a tampa e analise a etapa de dissociação na interface. Coloque o tubo A no suporte do tubo.
Conecte o biossensor hidratado ao sistema BLI e deslize o suporte do tubo sob o biossensor conforme mostrado anteriormente. Em seguida, clique em executar na interface do software para configuração de linha de base. Depois de adicionar quatro microlitros de isca de DNA de fita simples de 12,5 nanomolares ao suporte de gota e deslizá-lo sob o biossensor para a etapa de associação, monitore a curva BLI no software.
Em seguida, abra a tampa para substituir o tubo A por D.Deslize-o sob o biossensor e prossiga com a etapa de dissociação. Quando a etapa de dissociação estiver concluída, abra a tampa e retire o biossensor. Em seguida, coloque o biossensor na bandeja contendo o tampão BLI.
Usando uma pipeta, adicione 250 microlitros de tampão BLI a 10 tubos de microcentrífuga preta de 0,5 mililitro. Rotule os tubos como A1 a A5 e D1 a D5. Preencha os detalhes experimentais na interface do software e pressione o botão de cálculo para processar as informações. Em uma placa separada de 96 poços, pipete 200 microlitros de tampão de decapagem no poço, correspondendo à posição do biossensor hidratado.
Depois de colocar o tubo A1 no suporte do tubo, conectar o biossensor revestido com isca ao sistema BLI e deslizar o tubo sob o biossensor, pressione executar no software. Quando a etapa inicial da linha de base estiver concluída, abra a tampa e adicione quatro microlitros de tampão BLI ao porta-gotas. Deslize o suporte de queda sob o biossensor e monitore a etapa de associação na interface BLI.
Substitua o tubo A1 por D1. Deslize-o sob o biossensor e feche a tampa. Em seguida, monitore a etapa de dissociação na interface BLI. Quando a etapa de dissociação estiver concluída, abra a tampa, remova o biossensor e coloque-o de volta em sua bandeja contendo o tampão BLI.
Em seguida, conecte o biossensor revestido com isca e coloque o tubo A2 no suporte do tubo. Deslize o tubo sob o biossensor e clique em executar no software. Após a etapa da linha de base, adicione quatro microlitros de cinco RPA nanomolares no suporte de gota.
Deslize o suporte de gota sob o biossensor e feche a tampa. Monitore a curva de associação na interface do software. Remova o biossensor e mergulhe-o no tampão de decapagem por 30 segundos.
Em seguida, mergulhe o biossensor no tampão BLI por três minutos. Na tabela rotulada Run List, marque a caixa referência para a concentração do analito de zero nanomolar para servir como uma curva de referência, marque a caixa analisar, para todas as concentrações do analito. Selecione o início da associação e o início da dissociação para correção da etapa, escolha o ajuste global para o ensaio.
Em seguida, clique em analisar para processar os dados. Para exportar os dados ajustados, clique com o botão direito do mouse no gráfico gerado a partir dos dados analisados. Selecione exportar dados, escolha texto ou dados, clique em arquivo e navegue para salvar os dados no formato DAT.
Abra o software e selecione cinética avançada no painel esquerdo. Depois de colocar uma placa de 96 poços na bandeja do biossensor e adicionar 200 microlitros de tampão BLI a cinco poços, insira a bandeja do biossensor na placa para hidratar os sensores. Enquanto os biossensores são hidratantes, pipete 250 microlitros de tampão BLI em 10 tubos de centrífuga pretos de 0,5 mililitro.
Preencha os detalhes experimentais na interface do software e pressione o botão de cálculo para processar as informações. Depois de deslizar o suporte do tubo com o tubo A1 sob o biossensor, clique em executar para obter a linha de base inicial. Adicione quatro microlitros do buffer BLI ao porta-gotas.
Deslize o suporte de queda sob o biossensor, feche a tampa e monitore a curva de carregamento no software. A mudança espectral durante a ligação do RPA usando cinética básica demonstrou um aumento dependente da dose na força de ligação com a saturação alcançada em 40 nanomolares. A mudança espectral durante a ligação do RPA usando cinética avançada mostrou de forma semelhante a ligação dependente da dose, mas com biossensores individuais usados por concentração para maior precisão.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o estudo de interações DNA-proteína utilizando interferometria de camada biológica (BLI). Destaca a eficiência da BLI na análise de afinidades de ligação e o impacto das modificações pós-traducionais na função proteica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Interações proteína-DNA
- Cinética de ligação
Antecedentes
- As interações entre biomoléculas são fundamentais na pesquisa em bioquímica.
- A BLI é um método econômico para o estudo da cinética proteica.
- A técnica permite o monitoramento em tempo real das interações.
- Modificações pós-traducionais podem afetar a estrutura e a função das proteínas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar os princípios da BLI.
- Analisar a afinidade de ligação da proteína A de replicação ao DNA de fita simples.
- Fornecer um fluxo de trabalho simples para o estudo de interações proteicas.
Métodos Utilizados
- Sistema de interferometria de biocamada baseado em estreptavidina.
- Análise cinética de ligação básica e avançada.
- Monitoramento em tempo real de interações proteína-DNA.
- Avaliação da afinidade de ligação no equilíbrio (K D).
Resultados Principais
- Demonstração bem-sucedida da BLI para o estudo de interações DNA-proteína.
- Determinação da afinidade de ligação para a proteína A de replicação.
- Informações sobre o impacto das modificações pós-traducionais.
- Validação da BLI como método confiável para análise de cinética proteica.
Conclusões
- A BLI é uma ferramenta eficaz para estudar interações de biomoléculas.
- O método simplifica a análise da cinética de ligação.
- Compreender as interações proteína-DNA é essencial para a pesquisa sobre estabilidade do genoma.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise quantitativa das interações DNA-proteína é fundamental para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta precoce de fármacos. A interferometria de camada biológica baseada em estreptavidina (BLI) permite a medição em tempo real e sem marcação dos parâmetros cinéticos de ligação, conferindo maior confiabilidade preditiva na investigação de vias e na triagem de portfólios. A capacidade de determinar constantes cinéticas precisas acelera a tomada de decisões em pontos críticos do desenvolvimento biofarmacêutico.&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação quantitativa de hipóteses sobre ligação proteína-DNA relevantes para a função da via.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao fornecer cinética de associação e dissociação em tempo real.
- Facilita a validação funcional do alvo por meio da determinação precisa de KD.
- Melhora a confiabilidade preditiva para o avanço de alvos na linha de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara ensaios validados de ligação DNA-proteína para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Fornece saídas cinéticas quantitativas e reprodutíveis para padronização de ensaios.
- Permite avaliação rápida e escalonável de interações de ligação em múltiplas condições.
- Apóia avaliação confiável de compostos ao minimizar a complexidade e variabilidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas mecanicistas com vias relevantes para doenças, esclarecendo a dinâmica das interações proteína-DNA.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, apoiando estudos de biomarcadores e vias metabólicas.
- Reduz o risco translacional ao permitir avaliação robusta e quantitativa de interações moleculares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A análise de interação DNA-proteína baseada em BLI integra-se ao contínuo de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses sobre ligação proteína-DNA e mecanismos de vias.
- Triagem: Fornece dados cinéticos quantitativos padronizados para prontidão e reprodutibilidade de ensaios.
- Análises: Fornece constantes de associação, dissociação e equilíbrio para análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas a sistemas relevantes para doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para diversos estudos de interações proteína-DNA e proteína-proteína.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho com ensaios cinéticos padronizados, reprodutíveis e escalonáveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e o progresso eficiente em termos de capital da carteira de projetos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em estágio de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no design de ensaios cinéticos e na interpretação de dados.
- Requer acesso a instrumentação de interferometria de biocamada (BLI) e software analítico compatível.
- Exige padronização entre equipes para protocolos de ensaio e análise de dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes proteínas ou substratos de DNA e sistemas modelo.
- Depende da qualidade dos biossensores e da otimização do tampão para resultados reprodutíveis.
