Name: Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Explore a remodelação sináptica dependente da experiência usando Drosophila. Este método permite manipular concentrações de odor e timing para estudar poda glial durante períodos críticos do desenvolvimento neural.

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<meta charset="utf8"></head><body>Remodelação sináptica induzida pela experiência olfativa no cérebro juvenil de Drosophila

<ol><li>English, S., Barreaux, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+sensitive+periods+in+development%3A+insights+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Behav+Sci%22%5BJournal%5D)">The evolution of sensitive periods in development: insights from insects.</a> Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Para Exposição a Odores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-110</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de etila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de odor</td><td>Glasslock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincéis</td><td>Winsor & </td><td>Newton Series 233</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Malha de arame</td><td>Scienceware</td><td>378460000</td><td></td></tr><tr><td>Dissecação cerebral</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 190 provas</td><td>Decon Labs</td><td>2801</td><td>Diluído a 70%</td></tr> <tr><td>Pinças</td> Ferramentas <td>de Ciência Fina</td><td>11251-30</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>Ciências do Microscópio Eletrônico</td><td>157-8</td><td>Diluído para 4%</td></tr> <tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td>Diluído para 1x</td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico Sylgard</td><td>Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Brain Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 cabra anti-frango</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>546 cabra anti-rato</td><td>Invitrogen</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino albumina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Frango anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>13970</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Avantor</td><td>48366-067</td><td>25 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Scotch</td><td>34-8724-5228-8</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&nbsp;</td><td>Microscópio Eletrônico Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>75 x 25 mm</td></tr><tr><td>Esmalte de unhas</td><td>Sally Hansen</td><td>109</td><td>Xtreme Wear, Invisível</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Estudos de desenvolvimento anti-CadN de ratos</td><td>Banco de hibridoma</td><td>AB_528121</td><td></td></tr><tr><td> Confocal/Análise</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualquer computador/laptop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zeiss 510 META&nbsp;</td></tr><tr><td>Software Fiji</td><td>Fiji</td><td></td><td>Versão 2.14.0/1.54f</td></tr></tbody></table>

remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a exposição ao odor do período crítico dependente da experiência olfativa e os métodos de imagem cerebral. O protocolo começa com a correspondência etária das pupas escuras do farato imediatamente antes da eclosão (Figura 1A). As pupas são colocadas em câmaras odoríferas por 4 h e, em seguida, os adultos recém-fechados são colocados em frascos novos no controle do veículo ou nas câmaras odoríferas EB dosadas (Figura 1B). Normalmente expomos ao odor por 24 horas, embora qualquer duração seja possível. Após a exposição ao odor, a dissecção cerebral começa removendo a cabeça do tórax e, em seguida, removendo o exoesqueleto da cutícula com pinça fina (Figura 1C). O cérebro isolado é limpo de quaisquer tecidos associados que possam interferir na imagem e, em seguida, imediatamente fixado em paraformaldeído a 4% e sacarose a 4% em PBS. Uma correção curta de 30 minutos é suficiente para uma boa integridade do tecido cerebral. O protocolo imunocitoquímico começa com um bloqueio de 1 h (por exemplo, BSA, NGS), incubação noturna em anticorpos primários (por exemplo, anti-GFP, -CadN) e, em seguida, uma breve incubação de 2 h em anticorpos secundários (Figura 1D). Os cérebros marcados são montados em lâminas de vidro sob lamínulas seladas com a superfície dorsal do cérebro para cima para obter a melhor imagem dos lobos antenais (Figura 1E). Observe que todas as amostras são cegas para as condições de genótipo e experiência, marcando a lâmina com uma designação codificada para decodificação posterior. Um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de imersão em óleo de 63x é usado para obter imagens dos lobos antenais centrais do cérebro (Figura 1F). Linhas de laser ideais para os fluoróforos usados são selecionadas (por exemplo, Argônio 488 e HeNe 543) para obter imagens da inervação do neurônio sensorial olfativo Or42a de VM7 no contexto dos glomérulos circundantes.
É importante selecionar o ganho ideal, o deslocamento, a resolução da imagem e a espessura da fatia óptica para capturar toda a projeção da pilha Z da inervação do neurônio Or42a nos glomérulos VM7. Todos os genótipos e condições de experiência a serem comparados são fotografados com configurações de microscópio idênticas. As pilhas Z são processadas usando o software ImageJ com alterações dependentes da experiência avaliadas principalmente pelo volume de inervação 7,14. Existem duas maneiras pelas quais as medições volumétricas foram calculadas. Calcula-se a área de inervação fatia por fatia usando a função de laço ImageJ e, em seguida, multiplica-se cada valor pela espessura de cada fatia (μm)8,9. O outro usa projeções Z de soma de fatias e multiplica o número de fatias de pilha Z pela espessura da fatia para determinar o volume médio. Ambos os métodos fornecem resultados consistentes. Além das medições de volume, a intensidade de fluorescência também pode ser avaliada com projeção de intensidade máxima de glomérulos VM716. A soma ponderada de todos os pixels é avaliada por meio da projeção máxima da fatia de soma do ImageJ, com o número de pixels em cada nível de intensidade somado para calcular a intensidade geral 8,9. O fundo pode ser subtraído quantificando uma região extra-glomerular de tamanho idêntico. Este método de subtração é mais demorado, mas mais preciso, pois é responsável por níveis variados de marcação de anticorpos de fundo em cada amostra de cérebro para produzir uma quantificação mais representativa dos valores de intensidade de fluorescência de inervação. As medições de intensidade são feitas em uma faixa típica de 18 a 30 fatias ópticas (0,37 μm / fatia) dentro de uma pilha Z, em média para cada cérebro16. Em quase todos os casos, as medições de intensidade e volume da fluorescência de inervação fornecem resultados consistentes.
Em todas as modalidades de medição, os resultados representativos permanecem inabaláveis; a experiência com odorante EB no início da vida resulta em uma perda significativa da inervação do neurônio Or42a. O glomérulo VM7 pode ser identificado de forma confiável por tamanho, forma e localização entre outros glomérulos olfatórios do lobo antenal mapeados com precisão ( Figura 2A ) e pela expressão direcionada do rótulo de membrana Or42a-mCD8 :: GFP acoplado à marcação glomerular com caderina antineural (CadN; Figura 2B). A exposição cronometrada ao controle do veículo odorífero (óleo mineral) resulta na inervação do neurônio Or42a indistinguível de um animal normal não tratado. Ainda assim, a experiência com odor EB nos primeiros dias após a eclosão (dpe) causa poda de glomérulos sinápticos (Figura 2C). Esse mecanismo de poda é totalmente restrito ao breve período crítico de início de vida 8,10. Normalmente, agora usamos exposições a odores de 24 horas para avaliar a poda sináptica dos glomérulos VM7 e a diminuição resultante no volume de inervação no cérebro juvenil de Drosophila. Uma exposição de 24 h (0-1 dpe) ao controle do veículo odorífero (óleo mineral) mantém a inervação normal e densa de Or42a-mCD8::GFP (verde) nos glomérulos sinápticos VM7 (círculos tracejados brancos) em ambos os lobos antenais do hemisfério cerebral (Figura 2D, à esquerda). Em contraste marcante, a exposição de 24 h (0-1 dpe) a 25% de odor EB dissolvido no óleo mineral resulta em forte poda da inervação de Or42a-mCD8::GFP (verde) e perda do volume glomerular sináptico (Figura 2D, à direita). Esses resultados são visualmente óbvios e consistentemente claros. Um dos maiores atributos deste protocolo de experiência com odor é a clareza dos resultados da imagem cerebral, que também são extremamente passíveis de quantificações diretas de intensidade e volume de fluorescência de inervação.
A principal vantagem deste protocolo de experiência com odor é a capacidade de aproveitá-lo para o estudo da restrição temporal e dos mecanismos dependentes da dose de odor durante a poda sináptica do período crítico. Para a eliminação da sinapse do neurônio Or42a impulsionada por EB no glomérulo VM7, o mecanismo de remodelação é restrito principalmente ao juvenil precoce (0-2 dpe), sem poda sináptica dependente da experiência detectável na maturidade (7-9 dpe), exceto modulação menor nos níveis mais altos de exposição ao EB8. Tal restrição temporal define um período crítico, e a compreensão desse mecanismo de tempo é um objetivo importante. Outro atributo deste protocolo é que a poda sináptica dependente da experiência é dependente da dose de EB (Figura 3). A exposição cronometrada ao controle do veículo odorífero (óleo mineral) com odor EB a 0% resulta na inervação normal do neurônio Or42a do glomérulo sináptico VM7, que é indistinguível de um animal não tratado. O cálculo do volume tridimensional de inervação do neurônio Or42a mostra um tamanho típico de um cérebro juvenil normal (2260 μm3; Figura 3A, à esquerda). Resultados representativos mostram que o aumento da concentração de odorante EB causa poda de glomérulos sinápticos progressivamente maior. Por exemplo, uma exposição de 24 horas (0-1 dpe) a 15% de odorante EB resulta em perda de inervação clara e consistente (Figura 3A, meio). A quantificação do volume de inervação 3D mostra uma redução notável em comparação com os controles do veículo (760 μm3 vs. 2260 μm3). Uma exposição de 24 h (0-1 dpe) a 25% de odor EB causa ainda mais perda de inervação (281 μm3; Figura 3A, à direita). Quantificações representativas para esta faixa de concentrações de odorante EB mostram resultados consistentes para intensidade de fluorescência ( Figura 3B ) e volume de inervação ( Figura 3C ). Essa dependência da dose permite o estudo dos meios para prevenir a poda sináptica, bem como melhorar a poda com menor exposição a odores para demonstrar o aumento da remodelação dos glomérulos sinápticos. Alguns estudos anteriores mostraram o efeito oposto do aumento do volume glomerular usando outros odores com esse protocolo10. A exposição ao odor EB no período crítico sempre resulta em poda de glomérulos sinápticos marcante e facilmente detectável.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma de estudos de exposição a odores no cérebro juvenil de Drosophila . (A) Pupas escuras de farato (90+ h pós-pupariação a 25 ° C) são coletadas e colocadas em câmaras odoríferas. Em condições de odor, 4 h são permitidas para eclosão e, em seguida, as moscas juvenis são transferidas para um frasco fresco. (B) As moscas da mesma idade são divididas em condições de experiência de controle do veículo (100% óleo mineral) ou butirato de etila (EB; % v/v em óleo mineral). Uma malha de arame fino (inserção) permite o acesso ao odor. As moscas são normalmente expostas por mais 20 h para um total de 24 h de exposição, 0-1 dia pós-eclosão (dpe). (C) As moscas são dissecadas removendo primeiro a cabeça e, em seguida, pinças finas são usadas para remover delicadamente o exoesqueleto da cutícula e isolar o cérebro juvenil. O cérebro isolado é limpo de todos os tecidos circundantes e traqueia saliente. (D) Cérebros isolados são fixados, bloqueados e, em seguida, incubados sequencialmente em anticorpos primários e secundários. A gama de anticorpos usados normalmente inclui uma sonda de membrana geral para revelar os glomérulos sinápticos do lobo antenal e uma sonda de membrana específica para os neurônios sensoriais olfativos Or42a. (E) Os cérebros marcados são colocados em um meio de montagem em uma lâmina de microscópio de vidro com espaçadores de fita sob uma lamínula selada. A orientação correta do cérebro (superfície dorsal para cima) é fundamental para a imagem ideal dos lobos antenais. (F) Os cérebros são fotografados usando um microscópio fluorescente confocal de varredura a laser. Todas as amostras são cegas para as condições de genótipo e experiência antes da imagem e análises quantificadas subsequentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig02.jpg"> Figura 2: Poda de glomérulos sinápticos do período crítico dependente da experiência do odorante. (A) Os glomérulos olfatórios do lobo antenal (AL) são mapeados com precisão. Alguns glomérulos sinápticos representativos são mostrados. A classe de neurônios sensoriais olfativos (OSN) do receptor Or42a inerva especificamente os glomérulos VM7. (B) Neurônios marcados com Or42a-mCD8::GFP (verde) inervam densamente os glomérulos VM7 emparelhados nos lados esquerdo (L) e direito (R) do cérebro, com marcação de anticorpos N-Caderina (CadN) de todos os glomérulos sinápticos AL (magenta). A linha de voo é w1118; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Representação gráfica esquemática da inervação de Or42a OSN dos glomérulos sinápticos VM7 na condição de controle do veículo (100% óleo mineral; esquerda) e exposição ao butirato de etila (% EB v / v em óleo mineral; direita) durante o período crítico juvenil. A poda de inervação dependente da experiência ocorre apenas com a exposição à EB no início da vida, com sinapses eliminadas e axônios perdidos, resultando em redução do volume de inervação. (D) Imagens confocais representativas da inervação de Or42a OSN dos glomérulos sinápticos VM7 emparelhados (círculos de contorno branco tracejado; Or42a-mCD8::GFP, verde) após o controle do veículo a óleo (esquerda) e 25% de exposição EB (direita) por 24 h (0-1 dpe). A experiência com odor EB impulsiona a poda sináptica e a perda de volume de inervação. Esse mecanismo dependente da experiência é temporalmente restrito e transitoriamente reversível apenas dentro de um período crítico olfativo bem definido nos primeiros dias após a eclosão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig03.jpg"> Figura 3: Quantificando a intensidade e o volume de fluorescência da inervação dos glomérulos sinápticos dependentes da dose de EB. (A) Inervação marcada com Or42a-mCD8::GFP em um glomérulo sináptico VM7 (verde) exposto de 0-1 dpe ao controle de óleo mineral do veículo odorífero (0% EB, esquerda), 15% EB (meio) ou 25% EB (direita). Abaixo: As mesmas imagens com a inervação glomerular delineada (círculos brancos) e o volume de inervação tridimensional calculado. O controle do veículo tem inervação do glomérulo sináptico VM7 por neurônios Or42a que é indistinguível dos animais não tratados. A experiência do período crítico com 15% de exposição ao odor EB resulta em poda óbvia do glomérulo sináptico, com uma diminuição de 66% no volume de inervação tridimensional neste caso. A exposição ao nível mais alto de 25% de EB resulta em maior poda, com uma perda de quase 90% do volume do glomérulo sináptico neste caso. Assim, pode-se imaginar a poda dependente da dose à medida que a experiência com odor aumenta. (B) Resultados representativos da intensidade de fluorescência marcada com Or42a-mCD8::GFP dentro dos glomérulos sinápticos VM7 expostos de 0-1 dpe ao controle do veículo odorífero (óleo, verde), 15% EB (meio, laranja) ou 25% EB (direita, preto). (C) Resultados representativos dos volumes de inervação tridimensionais dos glomérulos VM7 sob as mesmas condições de exposição ao odor do período crítico. Os gráficos de dispersão mostram todos os pontos de dados individuais com a média ± SEM. A significância é indicada como p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) e p ≤ 0,0001 (****). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Early-life olfactory sensory experience induces dramatic synaptic glomeruli remodeling in the Drosophila juvenile brain, which is experientially ...

experience-dependent-remodeling-juvenile-brain-olfactory-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

A identificação de moléculas e vias que controlam a plasticidade sináptica e a memória ainda é um grande desafio na neurociência. Aqui, é descrito um fluxo de trabalho abordando a quantificação relativa de proteínas sinápticas supostamente envolvidas na reorganização molecular das sinapses durante a aprendizagem e consolidação da memória em um paradigma de aprendizagem auditiva.

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

Aqui, treinamos os ratos em uma tarefa de aprendizagem associativa para testar a discriminação do odor. Este protocolo permite também para estudos sobre aprendizagem-induzido mudanças estruturais no cérebro.

Uma objetiva e reproduzível teste de aprendizagem olfactiva e discriminação em ratos

Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.

Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

O protocolo aqui apresentado fornece informações sobre o eletroencefalograma (EEG) simultâneo e avaliação comportamental em tempo real. Discutimos todas as etapas envolvidas neste protocolo como uma solução atraente para pesquisadores em muitos campos da neurociência, particularmente nas áreas de aprendizagem e memória.

Monitoramento Simultâneo da Eletrofisiologia Wireless e Teste Comportamental de Memória como Ferramenta para Estudo da Neurogênese do Hipocampo

Este protocolo descreve o procedimento de dissecção, condição cultural e imagem ao vivo de um sistema de explant antena-cérebro para o estudo do conjunto do circuito olfativo.

Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila

Explore a remodelação sináptica dependente da experiência usando Drosophila. Este método permite manipular concentrações de odor e timing para estudar poda glial durante períodos críticos do desenvolvimento neural.

Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida (Vídeo) | JoVE Journal

Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

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