Avaliação da quebra da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo com lesão cerebral traumática leve

Procuramos entender os intrincados mecanismos subjacentes à lesão cerebral traumática leve causada pela exposição a ondas de choque induzidas por explosão. Também estamos investigando métodos para aliviar esses sintomas. Foi uma descrição abrangente da fase inicial da quebra da barreira hematoencefálica devido a ondas de choque induzidas por explosão de baixa intensidade.

Especificamente, a quebra começa abruptamente aproximadamente três horas após a exposição, e as lesões afetadas sofrem remodelação por aproximadamente um dia após o início. Este método nos permite examinar a quebra do BBB com mais detalhes, fornecendo uma métrica adicional para avaliar a eficácia de vários tratamentos que podem ser empregados em caso de explosão. Para começar, prepare um tubo de choque para expor o animal às ondas de choque induzidas pela explosão.

Posicione o mouse anestesiado a cinco centímetros de distância da extremidade de saída do tubo de choque, garantindo que o eixo do corpo esteja paralelo, mas não alinhado com o eixo do tubo. Em seguida, aplique uma única onda de choque com um pico de sobrepressão de 25 quilopascais na cabeça do animal. Para a injeção de azul de Evans, prepare uma solução de azul de Evans a 4% em volume em solução salina.

Vortex a solução e armazene-a no escuro até o uso. Injete a solução de azul de Evans na veia da cauda na dosagem de 2,5 microlitros por grama. Depois de perfundir o camundongo anestesiado com o corante FITC-dextrano e paraformaldeído, use tesouras e pinças cirúrgicas para remover cuidadosamente o cérebro.

Fixe o cérebro durante a noite no mesmo fixador a quatro graus Celsius. No dia seguinte, substitua o fixador por PBS. Para começar, obtenha o cérebro fixo de um camundongo tratado com ondas de choque injetado com corantes de azul de Evans e FITC-dextrano.

Prepare uma placa de 24 poços com 500 microlitros de glicerol a 20% em tampão fosfato ajustado para pH 7,4 em cada poço. Usando um cortador de cérebro, corte o cérebro coronalmente em 12 fatias, cada uma com um milímetro de espessura. Transfira cada fatia para o poço correspondente da placa de 24 poços e armazene a placa a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas.

Em seguida, substitua a solução por tampão fosfato de glicerol a 50% e armazene-a novamente a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas. Por fim, substitua a solução por 100% de glicerol. Para observação microscópica imediata, deixe as fatias repousarem por pelo menos duas horas em temperatura ambiente.

Adicione 500 microlitros de glicerol ao fundo de um prato com fundo de vidro de 35 milímetros. Transfira a fatia de cérebro para a solução de glicerol e cubra a superfície com uma lamínula. Remova o excesso de glicerol da borda da tampa do vidro.

Meça a intensidade de fluorescência da fatia sob um microscópio de fluorescência. Após a medição microscópica, retorne a fatia ao poço da placa. Adicione 500 microlitros de tampão fosfato a cada poço e armazene a placa de 24 poços a quatro graus Celsius durante a noite.

Substitua a solução por tampão fosfato de glicerol a 30% e incube a placa a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas antes de realizar a imuno-histoquímica A marcação azul de Evans demonstrou que a quebra da barreira hematoencefálica ou BBB começou dentro de seis horas após a exposição à onda de choque da explosão e durou até sete dias. Os pontos de fluorescência variaram em tamanho e intensidade, com os pontos de acesso somente azul de Evans indicando quebra de BBB durante a injeção de azul de Evans e reparo após a injeção de FITC-dextrano. Aglomerados de astrócitos reativos foram intimamente associados a locais de degradação da BHE confirmados por imuno-histoquímica.

Microglia ativada e microglia amebóide foram observadas ao lado de astrócitos reativos três dias após a exposição à onda de choque da explosão.