Name: Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprenda bioimpressão 3D de alto rendimento para modelagem vascular em placas de seis poços. Este método automatizado melhora a reprodutibilidade de modelos de vasos sanguíneos in vitro para testes farmacológicos em doenças como aterosclerose.

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1. Geração de código G para a bioimpressora
<ol><li>Para gerar e visualizar o caminho de impressão, visite uma ferramenta de simulação de código G online (por exemplo, NCviewer).</li>
	<li>Clique no ícone Novo arquivo na interface para criar um novo arquivo de código G.</li>
	<li>Gere um caminho de impressão escrevendo manualmente os comandos do código G para o canal de sacrifício e a câmara de silício. Use as dimensões de uma placa padrão de seis poços como referência para criar a geometria. NOTA: O código G usado aqui é baseado no código de Controle Numérico Computadorizado (CNC). As funções de cada comando são fornecidas na Tabela Suplementar S1. O formato de placa de seis poços foi selecionado devido à sua compatibilidade com leitores comerciais de microplacas e configurações de microscopia e sua capacidade de acomodar volumes adequados de mídia para suportar a maturação do endotélio, minimizando assim a necessidade de trocas frequentes de mídia. Este protocolo de fabricação também pode ser adaptado para uso com outras placas de poços padrão.</li>
	<li>Quando o código G estiver concluído, clique no ícone Salvar arquivo na interface para baixar o arquivo com extensão .nc. NOTA: Qualquer outro algoritmo de geração de código G disponível pode ser usado para gerar os caminhos de impressão. A geometria do canal vascular pode ser manipulada neste código G.</li>
</ol>2. Preparação de tintas sacrificiais e de câmara de silício
NOTA: As fontes de todos os materiais usados neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.
<ol><li>Combine dois tipos de polímeros de silicone, SE1700 e polidimetilsiloxano (PDMS), na proporção de 10:2. Adicione o agente de cura de cada polímero na proporção de 10:1, polímero para agente de cura.</li>
	<li>Use um misturador planetário para misturar e desgaseificar completamente a mistura de polímeros a 2.000 rpm.</li>
	<li>Com uma espátula, transfira o polímero de silicone misturado para uma seringa descartável de 10 mL. Centrifugue a seringa carregada a 400 × g durante 3 min a 5 °C para garantir uma consistência uniforme e evitar bolhas durante a impressão. NOTA: A tinta da câmara deve ser usada dentro de 2 h após a adição dos agentes de cura para garantir a qualidade de impressão ideal. Conservar a seringa a 5 °C enquanto prepara para a impressão. Esse processo ajuda a retardar a cura da tinta, o que pode alterar os parâmetros de impressão.</li>
	<li>Pesar o Pluronic F-127 (PF127) para preparar uma solução-mãe a 40% (p/v) de PF127 em água destilada.</li>
	<li>Misturar a solução PF127 numa batedeira planetária durante 3 min a 400 × g para obter homogeneidade. Manter a mistura homogeneizada a 4 °C para a dissolução completa do PF127.</li>
	<li>Prepare uma solução estoque de trombina de 1.000 unidades/mL em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). NOTA: Armazene a solução estoque de trombina em alíquotas de 100 μL para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. As alíquotas devem ser conservadas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.</li>
	<li>Antes de imprimir, prepare a tinta sacrificial misturando trombina em uma diluição de 1:10 com PF127 até uma concentração final de trabalho de 36% (p / v) para PF127 e 100 unidades / mL para trombina. Para preparar 1 mL de tinta sacrificial, misture 100 μL de solução estoque de trombina com 900 μL de solução estoque PF127. NOTA: Ao preparar a tinta sacrificial para imprimir uma única placa, um volume total de 1 mL é mais do que suficiente.</li>
</ol>3. Processo de fabricação
<ol><li>Antes de iniciar o processo de fabricação, trate uma placa de seis poços com plasma de oxigênio (O2) a uma intensidade de 100 watts por 1 min.</li>
	<li>Siga o procedimento descrito na seção 2 para preparar as tintas sacrificial e de silicone, garantindo que as tintas estejam livres de bolhas e misturadas de forma homogênea para uma impressão consistente. Coloque cuidadosamente as tintas no cabeçote de impressão da bioimpressora. Defina a temperatura da cabeça da bioimpressora para 37 °C para a tinta sacrificial e 5 °C para a tinta de silicone.</li>
	<li>Conecte um bico cônico de rosca dupla de 22 G à seringa de silicone. Para a tinta sacrificial, escolha o tamanho do bico de acordo com o diâmetro do canal desejado. NOTA: Aqui, demonstramos três tamanhos de bicos: 18 G, 20 G e 22 G. Os parâmetros de impressão ideais, incluindo pressão de impressão e velocidade do cabeçote de impressão, são descritos na Tabela 1.</li>
	<li>Carregue o código G desejado e pressione a função servo ready na interface de software da bioimpressora por 3 s. Posicione a chapa no palco no ponto inicial do código G e clique em iniciar para iniciar o processo de impressão. NOTA: Normalmente, a fabricação de uma placa contendo seis câmaras requer aproximadamente 1 h e 10 min. A etapa 3.4, envolvendo o carregamento e a execução do código G, está sujeita a variações dependendo da bioimpressora específica usada. Certifique-se de que as condições estéreis sejam mantidas durante o uso da bioimpressora para evitar contaminação.</li>
	<li>Coloque uma tampa sobre a placa e transfira-a para uma incubadora de CO2 umidificada a 37 °C por 72 h para curar as câmaras de silício. NOTA: Embora a cura do silício possa ocorrer em um ritmo mais lento dentro da incubadora, a placa não deve ser colocada dentro de um forno seco.</li>
</ol>4. Preparação de hidrogel e incorporação de canais
<ol><li>Prepare um tubo cônico de 50 mL contendo 20 mL de 1x PBS. Coloque 0,01 g de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) no tubo cônico para fazer uma solução LAP a 0,05% (p / v). Vortex até que o pó esteja completamente dissolvido. NOTA: Enrole o tubo cônico em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Conservar a solução-mãe LAP a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 3 g de metacrilato de gelatina (GelMA) e 0,2 g de fibrinogênio a 20 mL de solução LAP para atingir uma concentração final de 15% de GelMA e 1% de fibrinogênio (referido como GelFib). Colocar a mistura num banho-maria a 37 °C e periodicamente misturar em vórtice até que a solução esteja totalmente dissolvida.</li>
	<li>Após a fabricação, conforme descrito na Seção 3, adicione 300 μL de GelFib pré-aquecido em cada câmara de hidrogel para incorporar o padrão de sacrifício. Reticule rapidamente o GelMA com luz ultravioleta (UV) em um comprimento de onda de 405 nm com uma intensidade de 85 mW / cm2 por 120 s. Repita este procedimento para todos os outros poços. NOTA: O fibrinogênio se reticula rapidamente ao entrar em contato com o padrão de sacrifício contendo trombina. Recomendamos adicionar hidrogel e realizar reticulação UV individualmente para cada poço para evitar a gelificação indesejada de GelMA à temperatura ambiente. Além disso, condições estéreis devem ser mantidas para evitar contaminação durante o processo de cura UV.</li>
	<li>Adicione 1 mL de DPBS a cada lado do canal vascular em cada poço e mantenha a placa a 4 °C por 15 min para liquefazer o PF127.</li>
	<li>Após 15 min, aspire o DPBS e repita o passo 4.5 3x para a lavagem completa do PF127.</li>
	<li>Antes de introduzir células nos canais, perfunda DMEM F12 contendo 1% de Matrigel por 30 min através dos canais para aumentar a fixação celular.</li>
</ol>5. Cultura HUVEC
<ol><li>Pré-aqueça o meio de crescimento de células endoteliais (ECGM) em banho-maria a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Enquanto isso, recupere um frasco de HUVECs criopreservados do tanque de nitrogênio, afrouxe suavemente a tampa do frasco e reaperte-o para liberar nitrogênio dos fios. Descongele imediatamente as células submergindo o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C durante 2 min, garantindo que permanece uma pequena quantidade de gelo no interior do frasco. Enxágue o frasco com etanol a 70% para evitar contaminação. NOTA: Use óculos de segurança ao recuperar células do tanque de nitrogênio. A tampa do frasco para injetáveis deve ser mantida acima do nível da água durante este processo.</li>
	<li>Prepare um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de ECGM pré-aquecido. Com uma micropipeta, transfira cuidadosamente as células descongeladas do frasco para o tubo cônico. Para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás, adicione 1 mL de meio fresco pré-aquecido ao criogenial, enxágue o interior e transfira as células restantes para o tubo cônico.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cónico a 200 × g durante 3 min para obter um sedimento celular. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender as células em 10 ml de meio fresco, transferir as células para um balão T75 e colocar o balão dentro de uma incubadora de CO2 humidificada a 37 °C. NOTA: Esta etapa é importante para remover o dimetilsulfóxido presente no meio de congelamento no criogênico por meio de centrifugação.</li>
	<li>Atualize o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80-90% de confluência.</li>
</ol>6. Endotelização de canais
<ol><li>Pré-aqueça ECGM, DPBS, solução neutralizadora de tripsina e ácido etilenodiaminotetracético (TE) de tripsina em banho-maria a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>A 90% de confluência, enxágue as células em um frasco T75 com 10 mL de DPBS, adicione 1 mL de TE a 0,25% ao frasco e incube-o por 3 min.</li>
	<li>Bata suavemente nas laterais do frasco e adicione 5 mL de solução neutralizadora de tripsina para neutralizar o TE. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Use 5 mL de ECGM fresco para coletar as células restantes e adicioná-las ao tubo cônico.</li>
	<li>Centrifugue o tubo cônico a 250 × g por 3 min para coletar o pellet da célula.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 mL de ECGM fresco. Conte as células com um hemocitômetro e repita a Etapa 6.4 para obter um pellet de células. Ressuspenda 3 milhões de células em 90 μL de ECGM fresco.</li>
	<li>Antes de introduzir a suspensão celular no canal, aspire brevemente o canal a vácuo para limpar o lúmen. NOTA: Evite a sucção prolongada do canal para evitar danos à sua integridade.</li>
	<li>Carregue suavemente o canal com uma suspensão de células a uma densidade de semeadura de 0,5 milhão de células por poço. Use uma micropipeta para adicionar ~ 15 μL desta suspensão para preencher o canal. NOTA: A densidade de semeadura pode variar dependendo do tamanho do canal. Essa densidade é otimizada para um canal impresso com um bico de 20 G e um diâmetro interno de aproximadamente 900 μm.</li>
	<li>Coloque a placa dentro da incubadora por 2 h. Em seguida, inverter a placa a 180°, mantendo-a em posição plana durante as 2 h seguintes.</li>
	<li>Após 4 h, lave o canal com DPBS para remover as células não aderentes e mortas. Adicione 2 mL de ECGM fresco a cada poço (1 mL de cada lado do canal). Inicie a cultura dinâmica em um balancim em um ângulo de inclinação de 10° e 5 rpm posicionando a placa no balancim com os canais paralelos à direção do balanço. Atualize o meio de crescimento a cada dois dias. NOTA: A cultura dinâmica aumenta a troca de meio entre os reservatórios e canais e ajuda as células a proliferar durante a noite.</li>
</ol>7. Avaliação da maturação do endotélio
<ol><li>Pré-aqueça ECGM e DPBS em banho-maria a 37 °C por 30 min e reagente do Kit de Contagem de Células-8 (CCK8) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Faça uma solução de trabalho de CCK8 misturando 100 μL de reagente CCK8 com 1 mL de ECGM fresco para cada poço. Enquanto trabalha para uma placa/6 canais, prepare 600 μL de reagente CCK8 combinando-o com 6 mL de ECGM fresco.</li>
	<li>Remova o meio de crescimento por sucção e enxágue os canais com DPBS. Adicione 1 mL de solução de trabalho CCK8 a cada poço e deixe a placa permanecer plana dentro da incubadora por 30 min. Depois, inicie a cultura dinâmica em um rocker conforme descrito na etapa 6.9 e continue esse processo pelas próximas 3 h.</li>
	<li>Após 3 h, remova o conteúdo de cada poço inclinando a placa para um lado e transfira-o para uma nova placa de seis poços. Enxágue os canais com DPBS e adicione meio fresco. NOTA: Cubra a placa com papel alumínio até a medição da absorbância. Mantenha um volume de reagente consistente em todos os poços para garantir leituras uniformes. Durante a pipetagem, evite cuidadosamente a introdução de bolhas de ar, que podem atrapalhar a precisão das leituras de densidade óptica.</li>
	<li>Depois de agitar suavemente a placa por 15 s para garantir uma mistura uniforme das cores, use um leitor de microplacas para medir a absorbância a 450 nm.</li>
	<li>Repita este procedimento em intervalos de tempo predefinidos. Calcule a densidade óptica média para cada ponto no tempo e trace uma curva de crescimento no software gráfico. Essa curva indica a maturação relativa do endotélio ao longo do tempo.</li>
</ol>8. Ensaio de permeabilidade
<ol><li>Remova o meio de um poço de interesse. NOTA: Para o ensaio de permeabilidade, recomenda-se o processamento de cada poço separadamente para evitar que outros canais sequem, o que pode alterar sua permeabilidade vascular.</li>
	<li>Prepare 6 mL de solução de 0,1 mg / mL de dextrano conjugado com FITC dissolvendo 70 kDa de dextrano FITC em DPBS. NOTA: Prepare uma solução estoque de 20 mg / mL de dextrano FITC dissolvendo 100 mg de dextrano FITC em 5 mL de DPBS. Depois de agitar suavemente a solução, alíquota de 500 μL em tubos de 1,5 mL para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Estas alíquotas podem ser conservadas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses. Antes de realizar o ensaio, dilua a solução estoque a uma concentração de trabalho de 0,1 mg / mL.</li>
	<li>Posicione a placa firmemente na platina do microscópio e ajuste a ampliação da objetiva no modo de contraste de fase para garantir uma visibilidade clara da parede do canal na região de interesse, juntamente com o gel localizado nas proximidades, dentro do campo de visão. NOTA: Para uma avaliação eficaz da permeabilidade, tente maximizar a área do gel ao redor da região de interesse no campo de visão; Este aspecto é fundamental para o monitoramento preciso do transporte de dextrano.</li>
	<li>Depois de focar na área desejada, mude do contraste de fase para o modo de fluorescência. Na guia de aquisição de imagem , adicione FITC ao canal de campo amplo e adquira uma imagem antes de adicionar a solução de dextrana, para calcular a intensidade de fluorescência de fundo. Em seguida, adicione 1 mL de solução de trabalho de dextrana FITC em um lado do canal e deixe a solução fluir em direção ao outro lado do poço, impulsionada pela diferença de pressão hidrostática.</li>
	<li>Adquira imagens em intervalos de tempo predeterminados - com mais frequência para canais com alta permeabilidade e com menos frequência para aqueles com menor permeabilidade.</li>
</ol>9. Medição da intensidade de fluorescência no ImageJ
<ol><li>No software de análise de imagem ImageJ, meça a intensidade no ponto de tempo inicial (It1), a intensidade média observada no ponto de tempo posterior (It2) e a intensidade devido ao ruído de fundo (Ib), conforme descrito abaixo. Utilizar a equação (1) para calcular o coeficiente de permeabilidade (Pd). t1 e t2 referem-se aos pontos de tempo iniciais e posteriores de aquisição da imagem. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">Características (1)<ol><li>Inicie o ImageJ e abra a imagem adquirida no ponto de tempo inicial.</li>
		<li>Defina a escala em ImageJ. Navegue até Analisar | Definir escala. Insira a escala e a unidade de medida conhecidas.</li>
		<li>Selecione a ferramenta retângulo e desenhe um retângulo sobre a área do gel onde a medição da intensidade de fluorescência é necessária.</li>
		<li>Navegue até Analisar | Defina Medidas e certifique-se de que o valor médio de cinza esteja marcado. NOTA: Esta opção mede a intensidade média dentro da área selecionada. Outros parâmetros podem ser selecionados conforme necessário para a análise fornecida.</li>
		<li>Com a área ainda selecionada, navegue até Analisar | Meça ou simplesmente pressione M. Aguarde a abertura de uma janela de resultados , mostrando a intensidade média de fluorescência e quaisquer outros parâmetros selecionados.</li>
		<li>Faça três medições e calcule o valor médio da intensidade de fluorescência em uma planilha.</li>
		<li>Repita este procedimento para as imagens capturadas no ponto de tempo subsequente t2, bem como aquelas tiradas antes da adição da solução de dextrano para o cálculo da intensidade de fluorescência no ponto de tempo posterior, para determinar a fluorescência de fundo.</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Bioimpressão 3D para fabricação rápida de redes vasculares usando vasos em uma placa

<table><tbody><tr><td>Pipeta Sorológica de 10 mL</td><td>SPL SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL&nbsp;</td>Tubo cônico <td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3D Bioprinter&nbsp;</td><td>T & R Biofab</td><td>3DX-Printer</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Armários de Segurança Biológica</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios invertidos de campo claro Kit de</td> contagem de células <td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>(CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de contagem de células (CCK8)</td>Frasco <td>de cultura de células</td> <td>GlpBio</td> GK10001 <td></td></tr><tr><td>75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal reduzida do fator de crescimento (GFR) Corning Matrigel, sem LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td></td><td>destilada</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Grau de Cultura de Células</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, Kit PDMS-Sylgard 184a</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 Transparente W/C 1.1 KG Kit&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais MV 2 (Pronto para usar)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Micro pipeta(1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 99.9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio de plasma bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Esferas fluorescentes (1.0 &mu; m, verde)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA-pó (Gelatina metacrilato) 50 g</td><td>Materiais 3D&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, meio de congelamento de cultura de células de recuperação, 50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs (células endoteliais da veia umbilical humana)</td><td>Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubadora</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Kit de viabilidade/citotoxicidade vivo/morto (para células de mamíferos)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lítio Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfato em pó&nbsp;</td><td>Tokoyo Indústria Química CO.</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, tampa da câmara de contagem</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, hemocitômetro, câmara de contagem de células</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>eppendorf</td><td>Centrífuga 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Omnicure UV Laser</td><td>EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Planetário</td><td>THINKY CORPORATION, japão</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de tratamento de plasma</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Amortecedor</td> Pre-feito do <td>aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td>de Pluronic F-127 Sigma</tr><tr><td>, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>Armário de armazenamento de reagentes</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de imagem de células vivas em tempo real</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geladeira</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D digital</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Scoop-Spatula</td><td>CachePor</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>sigma, Tripsina-EDTA solition, 0,25%</td> <td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td> <td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Barril Ponta Cap</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Tally</td><td>Counter Control Company</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>Bico cônico (18 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>Bico cônico (22 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>Bico cônico 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>Trombina de plasma bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador, 4 canais</td><td>ETL</td><td>SL. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Solução Neutralizante de Tripsina</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL UG frasco de pomada</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL UG frasco de pomada</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de peso</td><td>Sartorius</td><td>bce2241-1skr</td><td></td></tr></tbody></table>

método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

A plataforma VOP, com flexibilidade de tamanho e padrão, foi fabricada com um sistema de bioimpressão de várias cabeças. Canais, ocos e capazes de perfusão, foram semeados com HUVECs para facilitar a endotelização e foram posteriormente avaliados com um ensaio de permeabilidade (Figura 1A). Para demonstrar a capacidade de fabricação multiescala desse método, imprimimos três configurações distintas: reta, bifurcada e complicada (Figura 1B). Por meio de uma abordagem de fabricação direta, seis canais vasculares ocos e perfusáveis embutidos em uma matriz de hidrogel podem ser produzidos dentro de uma placa padrão de seis poços. Esses canais podem então ser endotelizados com HUVECs (Figura 2A). As células rapidamente se ligam e proliferam para cobrir a superfície luminal do canal vascular (Figura 2B). As células aderidas às superfícies luminais inferior e superior exibem uma distribuição uniforme dentro do lúmen (Figura Suplementar S1).
A placa foi colocada em uma incubadora umidificada por 3 dias para permitir a cura da tinta de silicone, garantindo que o padrão de sacrifício permanecesse livre de dessecação (Figura 3A). Para avaliar o fluxo através desses canais, microesferas verdes foram introduzidas, demonstrando que os canais são efetivamente perfusíveis (Vídeo Suplementar S1). O diâmetro dos canais foi variado de 558 ± 38 μm a 1094 ± 45 μm, alterando o tamanho do bico de 22 G para 18 G durante a impressão do padrão de sacrifício. Além disso, a configuração geométrica dos canais foi manipulada pela modificação do código G da bioimpressora (Arquivo Suplementar 1) para permitir a impressão de padrões complicados e bifurcados (Figura 3B).
A duração da reticulação com UV foi otimizada para 120 s, o que suporta a proliferação celular efetiva (Figura Suplementar S2). Essa duração de reticulação resultou em um ambiente fisiologicamente mais relevante que promove a proliferação de células endoteliais, provavelmente devido às propriedades mecânicas equilibradas e porosidade do hidrogel, facilitando uma melhor fixação celular e subsequente proliferação. Os HUVECs proliferaram efetivamente na superfície luminal e mostraram uma morfologia semelhante a paralelepípedos no dia 5 após a semeadura. A maturação do endotélio foi avaliada com o ensaio CCK8 realizado nos dias 1, 3 e 5 (Figura 4A,B). A maturação do endotélio foi verificada por imunomarcação para CD31 5 dias após a semeadura celular, que demonstrou a localização de CD31 nas junções apertadas (Figura 4D).
Para avaliar a função de barreira do endotélio, perfundimos uma solução de dextrana 70 kDa através dos canais no dia 5 de maturação. Para comparação, foi selecionado um canal de controle sem endotélio (nu). O canal endotelizado exibiu mudanças mínimas na fluorescência dentro da região do gel perivascular ao longo do tempo, sugerindo assim que o endotélio manteve efetivamente sua função de barreira. No entanto, os canais nus exibiram um aumento da fluorescência na região perivascular do gel, indicando maior permeabilidade devido à ausência de endotélio (Figura 4C e Figura 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> Figura 1: Preparação de canais vasculares impressos e suas configurações. (A) Esquema de fabricação, endotelização e ensaio de permeabilidade de canais vasculares impressos. (B) Esquema das três configurações demonstradas neste método: reta, bifurcada e complicada. Abreviatura: VOPs = vasos em um prato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> Figura 2: Linha do tempo de fabricação para impressão do padrão de sacrifício e da câmara de silício, bem como a endotelização do canal vascular. (A) A ilustração representa um único poço da placa do poço e AA' refere-se à vista ao longo do plano da seção transversal. (B) Imagens representativas das etapas envolvidas no processo de fabricação. Barras de escala = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abreviaturas: GelFib = 15% de metacrilato de gelatina e 1% de fibrinogênio em solução de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio a 0,05% p/v; HUVECs = Células endoteliais da veia umbilical humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> Figura 3: Vasos em uma placa. (A) Imagem bruta de vasos em uma placa após a impressão do padrão de sacrifício e da câmara de silício. (B) Demonstração de fabricação multiescala de canais vasculares com uma variedade de configurações e tamanhos, perfundidos com microesferas verdes. Barras de escala = 200 μm (canais retos), 1.000 μm (canais contorcidos e bifurcados). Abreviaturas: ID = diâmetro interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> Figura 4: Canais vasculares e sua maturação e permeabilidade endotelial. (A) Imagens microscópicas de fluorescência dos canais vasculares nos dias 1, 3 e 5 após a semeadura com HUVECs marcados com proteína fluorescente verde, mostrando a proliferação e morfologia de paralelepípedos de HUVECs no dia 5. (B) A maturação endotelial foi avaliada com o ensaio CCK-8 nos dias 1, 3 e 5 após a semeadura celular. (C) Ensaio de permeabilidade dos canais vasculares endotelizados (endotélio +) e nus (endotélio -). (D) Imagens representativas da coloração de CD31 ilustram a localização de CD31 em junções apertadas no dia 5. (E) Quantificação da permeabilidade difusional. Barras de escala = 200 μm (A, C, D). Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliais da veia umbilical humana; GFP = proteína fluorescente verde; GFP HUVECs = HUVECs marcados com GFP; CCK-8 = kit de contagem de células 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tinta de impressão</td>
			<td colspan="2">Parâmetros de impressão</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Calibre do bocal</td>
			<td>Temperatura (°C)</td>
			<td>Pressão do ar (kPa)</td>
			<td>Velocidade da cabeça (mm/min)</td>
		</tr><tr><td>Tinta sacrificial</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tinta de silicone</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Parâmetros de impressão para as tintas sacrificiais e de silicone.
Arquivo suplementar 1: script G-Code contendo os comandos para impressão 3D do padrão de sacrifício e da câmara de silício dentro de uma placa de seis poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S1: Imagens representativas da superfície luminal inferior e superior após a semeadura celular mostrando a fixação de GFP-HUVEC nos planos focais inferior e superior. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: UU' = plano focal superior; LL' = plano focal inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S2: Proliferação de GFP-HUVEC sob diferentes durações de reticulação com UV (405 nm). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliais da veia umbilical humana; GFP = proteína fluorescente verde; GFP HUVECs = HUVECs marcados com GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo Suplementar S1: Perfusão com microesferas verdes mostrando a perfusão efetiva através dos canais retos, contorcidos e bifurcados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar S1: Funções dos comandos G-code e M-code. NOTA: No código G, X, Y e Z indicam as coordenadas de movimento ao longo dos eixos X, Y e Z, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

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