Name: Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a realizar imagens de bioluminescência in vivo em camundongos infectados com Trypanosoma cruzi para avaliar a eficácia de novos fármacos antiparasitários contra a doença de Chagas.

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Os autores agradecem a Amanda Franscisco, John Kelly e Fanny Escudié por fornecerem treinamento e suporte ao BLI em ensaios de eficácia de medicamentos, John Kelly e Simone Calderano por fornecerem parasitas e Gabriel Padilla pelo apoio em estudos com animais. A.C.S recebeu uma bolsa CAPES PSDE para treinamento na London School of Hygiene and Tropical Medicine (Reino Unido). Os autores também gostariam de agradecer à Plataforma de Pesquisa em Citometria de Fluxo e Imagem (FLUIR) do Centro de Pesquisa Científica da Universidade de São Paulo (CEFAP-USP) pelo apoio técnico na análise do equipamento IVIS Spectrum, e ao Laboratório de Genética e Controle Sanitário ICB-USP pelos ensaios pós-experimentação para controle de qualidade de camundongos como livres de patógenos específicos. Este projeto foi financiado pela DNDi. A DNDi agradece aos seus doadores, públicos e privados, que forneceram financiamento para todas as atividades da DNDi desde sua criação em 2003. Uma lista completa dos doadores da DNDi pode ser encontrada em https://dndi.org/about/donors/.

Protocolo para Avaliação de Medicamentos para Modelo Bioluminescente In Vivo da Doença de Chagas

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A imagem de bioluminescência é um método inovador que permite a detecção de um gene de relatório usando um espectro visível e infravermelho de radiação eletromagnética. Portanto, não há necessidade de marcadores radiomarcados para rastrear sua amostra35. O BLI é adequado para modelos de roedores e outras espécies pequenas. É muito útil para estudos pré-clínicos porque é mais seguro e permite várias rodadas de imagem, causando o mínimo de desconforto ao animal. Além disso, a imagem in vivo é muito flexível devido à possibilidade de combinar bioluminescência, fluorescência e outras técnicas, como a tomografia por emissão de pósitrons36.
A imagem óptica é governada por propriedades físicas ópticas, como absorção e espalhamento. Todos os tecidos absorvem e espalham luz de comprimentos de onda distintos de maneira diferente37. Um passo crítico é selecionar um gene repórter sem levar em conta o comprimento de onda emitido da luz produzida pela reação química. Embora um nível de expressão do gene repórter possa ser alto in vitro em ensaios bioluminescentes, os mesmos níveis de expressão podem não ser alcançados ao progredir para o ambiente in vivo. Neste protocolo, usamos a versão otimizada para códon de Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 com desvio para o vermelho para tripanossomatídeos9, que emite luz a 617 nm, uma das mais adequadas para estudos in vivo 39. Comprimentos de onda maiores que 600 nm são menos absorvidos e espalhados pelos cromóforos endógenos do corpo, especialmente hemoglobina e melanina. Assim, as luzes vermelhas podem ser transmitidas através de vários centímetros de tecido, permitindo que os fótons cheguem à câmera CCD mesmo de dentro dos tecidos viscerais39,40.
Uma área de preocupação em ambientes de imagem é a falta de uma compreensão abrangente de sua função e efeitos. Binning, uma técnica de pré-processamento, combina as informações adquiridas por detectores contíguos em um pixel maior. Esse processo melhora a relação sinal-ruído, reduzindo o ruído de fundo e melhorando a sensibilidade. No entanto, diminui a precisão da resolução espacial, resultando em uma imagem pixelada41,42. Essa compensação é uma consideração importante em sua estratégia de imagem.
Com base no Perfil do Produto Alvo e no Perfil do Candidato Alvo para a doença de Chagas34, o estudo de prova de conceito está focado na sensibilidade para detectar o T. cruzi e ajudar a estabelecer se um novo candidato a medicamento pode alcançar uma cura estéril (representada pela falta de recidiva após várias rodadas de imunossupressão). Portanto, executamos o BLI usando o fator de binning mais alto sem supersaturar a imagem. Quando a imagem supersatura, uma nova aquisição é realizada usando um fator de binning mais baixo. Durante a análise, uma correção matemática é aplicada às imagens que exigiram binning diferente. Dessa forma, os dados finais devem ser apresentados usando o mesmo binning. A Tabela 1 demonstra os diferentes valores obtidos quando fatores binning distintos foram aplicados na mesma imagem e ROIs.
Tabela 1: Influência das configurações de binning na quantificação do BLI. Quantificação de três ROIs na imagem do modelo agudo (d13) e do modelo crônico (d118), analisadas em diferentes fatores binning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Devido ao cenário atual da doença de Chagas na clínica, os esforços de descoberta de medicamentos visam eliminar completamente os parasitas (cura parasitológica)27,34. Portanto, o protocolo pré-clínico in vivo inclui abordagens que superam as limitações da sensibilidade técnica do BLI. Uma das abordagens é tratar os camundongos com ciclofosfamida para diminuir a resposta imune que controla a carga parasitária. Outra estratégia é diminuir a profundidade do tecido e remover camadas de músculos, pele e pêlo que obstruem o caminho da luz para a câmera. Através do procedimento ex vivo, pequenas manchas bioluminescentes podem ser detectadas, revelando focos parasitários abaixo do limiar de BLI in vivo, como mostrado na Figura 5C em resultado ex vivo de camundongo tratado por Posa.
Projetar um experimento piloto para avaliar o próprio modelo e a dinâmica da infecção é crucial para estabelecer um experimento preciso para a avaliação da eficácia do medicamento antiparasitário. Assim, o pesquisador poderá definir as configurações adequadas de BLI e o curso do tempo de infecção com antecedência. Em um experimento exploratório, uma ferramenta que pode ser útil para definir as configurações de aquisição é a 'Exposição automática'. Com essa ferramenta, o pesquisador estabelece a prioridade de três configurações (Tempo de exposição, Binning e F/Stop) para adquirir a melhor imagem possível. Em particular, o pesquisador deve garantir que as imagens sejam adquiridas dentro da faixa dinâmica da câmera CCD, sem supersaturação ou subexposição, o que pode ser verificado através dos limites mínimo e máximo da escala e do recurso de autoexposição (Menu Editar > Preferências > Aquisição de Guias > Exposição Automática de Abas). Nesse protocolo, a abertura da câmera foi ajustada no valor máximo (F/Stop: 1), e diferentes tempos de exposição e fatores binning foram definidos para modelos agudos e crônicos. Essas configurações fornecem previsibilidade de tempo para executar diferentes rodadas de imagem simultaneamente. Considerando que o método repórter é baseado em uma reação enzimática, tanto a biodistribuição do substrato no camundongo quanto a cinética da luciferase influenciam o sinal bioluminescente e, portanto, a quantificação da infecção (Figura 1B). Consequentemente, a aquisição de imagens em diferentes momentos da cinética enzimática introduz variabilidade de dados que não pode ser contabilizada ou corrigida e afeta o cálculo do fluxo total (fótons/segundo) ou radiância (fótons/segundo/cm2/esterradiano). Além disso, a infecção por T. cruzi exibe posicionamento espacial dinâmico em camundongos (diferentes áreas e tecidos, profundidade e carga parasitária). Portanto, estabelecer um valor de contagens a serem adquiridas pode perder fontes de sinal mais fracas (baixo número de parasitas em um determinado ponto mais profundo do tecido) se a fonte de outro sinal mais forte atender aos critérios de auto-exposição definidos.
Um recurso complicado do software Living Image é exibir a imagem adquirida em uma escala de cores automática. Não há opção para pré-definir a escala para exibir automaticamente uma nova imagem adquirida de acordo com os valores de escala selecionados (consulte a etapa 6.2 do protocolo). Essa situação obriga o pesquisador a alterar manualmente as imagens, uma a uma, para os valores máximos e mínimos escolhidos. Como consequência, os usuários não experientes e não bem treinados não têm a leitura adequada durante a sessão de aquisição e podem enganar os dados ou perder informações importantes naquele momento. Para isso, o experimento piloto é benéfico.
Uma das perguntas mais comuns sobre o projeto do experimento de prova de conceito é como escolher a duração e a dose do tratamento. Para novas entidades químicas, esses parâmetros são geralmente definidos pela potência e seletividade do composto in vitro, em combinação com dados gerados pelo metabolismo e farmacocinética do medicamento (DMPK) e estudos de tolerabilidade conduzidos antes do teste in vivo para eficácia. Em resumo, após a identificação de compostos capazes de matar seletivamente o parasita no interior das células, os primeiros experimentos de ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção) são realizados in vitro para estimar a solubilidade aquosa dos compostos, a permeabilidade celular e a estabilidade metabólica, entre outros parâmetros. Se os compostos mostrarem um bom equilíbrio de propriedades in vitro (geralmente definidas em perfis de candidatos-alvo), então esses candidatos são progredidos para estudos de farmacocinética in vivo (PK) em camundongos saudáveis, que descrevem a exposição do composto no sangue (e possivelmente também nos tecidos) e fornecem uma ideia geral da tolerabilidade em diferentes níveis de dose17, 34,43. Idealmente, o objetivo da avaliação farmacocinética na maioria das doenças infecciosas é determinar a viabilidade de atingir concentrações plasmáticas livres (corrigidas para ligação às proteínas plasmáticas) que estão acima das concentrações EC50 / EC90 44 - a concentração efetiva que mata ou pelo menos inibe o crescimento de 50% ou 90% dos parasitas, respectivamente - por um período de tempo suficientemente longo. Se for alcançada exposição suficiente em um determinado nível de dose, esse regime pode ser usado durante os estudos de eficácia usando o modelo Chagas BLI. Para estudos de reposicionamento de medicamentos, devem estar disponíveis dados farmacocinéticos in vitro e in vivo. Um bom começo para o reperfilamento de medicamentos são os bancos de dados químicos, como o PubChem45, que fornecem dados reconhecidos que podem ser convertidos em camundongos usando escala alométrica46 para estimar regimes de tratamento seguros e não tóxicos a serem testados. No entanto, nem sempre é esse o caso. Os estudos de PK ainda são um campo negligenciado na ciência acadêmica, e poucas empresas farmacêuticas publicam seus resultados de PK. A comunidade científica de descoberta de medicamentos recomenda incluir a avaliação farmacocinética in vivo junto com ensaios de eficácia de medicamentos (farmacodinâmica)47. Portanto, a imagem pré-clínica é compatível com medições compostas simultaneamente, e essa abordagem associada aumenta a robustez dos dados.
Além disso, o manuseio, o peso e as condições de saúde dos camundongos são monitorados durante todo o experimento. Sinais de toxicidade e efeitos colaterais, como curvatura, tremor, perda de equilíbrio, falta de vontade de se mover, relutância em alimentar ou beber, prostração ou quaisquer outras anormalidades presentes no grupo ou por condições individuais de camundongos, devem ser registrados e relatados em estudos pré-clínicos. Um dos objetivos da imagem óptica é garantir o bem-estar dos animais. Assim, os parâmetros humanos devem ser aplicados em camundongos com sinais de dor descritos na escala 'Grimace48. Além disso, os camundongos foram pesados semanalmente durante a aquisição do BLI e, mais frequentemente, durante a dosagem do medicamento e o tratamento com CTX. Seguindo os regulamentos de bem-estar animal, os camundongos que perdem mais de 20% do peso corporal devem ser imediatamente sacrificados humanamente.
O modelo bioluminescente do T. cruzi é hoje o modelo experimental de última geração para a descoberta e desenvolvimento de novos tratamentos para a doença de Chagas. Modelo que replica as principais características da infecção por T. cruzi e da doença de Chagas49, permitindo o monitoramento em tempo real da parasitemia e a diferenciação de compostos com perfis de eficácia variados associados a modos de ação conhecidos. O BLI é uma técnica que aumenta a assertividade na identificação de tecidos infectados. Permite a seleção precisa de tecidos infectados para serem utilizados em uma ampla gama de abordagens, incluindo todos os métodos clássicos já aplicados na pesquisa do T. cruzi 50,51. Além disso, permite que os pesquisadores explorem tecnologias de ponta e desenvolvam novas33. Além disso, o BLI proporciona melhoria do bem-estar animal e uso mais racional de acordo com os princípios dos 3Rs10,35, tudo de uma só vez.
Vários grupos de pesquisa focados em doenças tropicais negligenciadas são colocados em países onde os dispositivos de imagem in vivo não estão disponíveis. Para superar o cenário atual, novas redes internacionais como a Global BioImaging e seus consórcios associados promovem ações para fornecer acesso aberto às instalações centrais de imagem e melhorar a formação de pessoal e cientistas de imagem 52,53. Essas iniciativas, juntamente com protocolos de usuário amigáveis como este, podem oferecer condições que democratizam tecnologias de ponta para todos os pesquisadores. A implementação desse método na descoberta pré-clínica de medicamentos ofereceu uma sólida leitura de eficácia e valor preditivo do resultado clínico, facilitando a descoberta de medicamentos para a doença de Chagas.

A doença de Chagas é endêmica na América Latina e afeta aproximadamente sete milhões de pessoas em todo o mundo1. Anualmente, mais de 50.000 mortes e perdas econômicas de cerca de 7 bilhões de dólares resultam da natureza incapacitante dessa doença2. A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, um parasita hemoflagelado heteroxênico capaz de infectar mamíferos (silvestres e domésticos) e triatomíneos vetores (Hemiptera, Reduviidae)3 nas Américas, onde a transmissão vetorial é estabelecida. Outras vias importantes de infecção incluem transfusão de sangue, transplante de órgãos, transmissão oral (pela ingestão de alimentos contaminados com um triatomíneo infectado)4 e transmissão congênita. As vias de transmissão não vetoriais têm contribuído para a disseminação da doença de Chagas para áreas não endêmicas 3,5.
A doença de Chagas se manifesta em duas fases clínicas. A fase aguda é, na maioria dos casos, assintomática. As infecções sintomáticas geralmente estão associadas a sinais inespecíficos, como febre, fadiga, mialgia, linfadenopatia, esplenomegalia e hepatomegalia. A fase aguda também está frequentemente associada à parasitemia patente e à circulação sistêmica de parasitas. O óbito pode ocorrer em até 10% dos casos diagnosticados, principalmente nos de infecção oral6. A fase crônica é frequentemente caracterizada por um longo período de ausência de quaisquer sintomas. Com o tempo, aproximadamente um terço dos pacientes infectados décadas antes apresenta manifestações cardíacas, geralmente acompanhadas de fibrose e inflamação miocárdica, e/ou distúrbios gastrointestinais relacionados principalmente ao desenvolvimento de síndromes de megaesôfago e/ou megacólon 3,5,6.
O tratamento etiológico da doença de Chagas consiste em apenas duas drogas: benznidazol e nifurtimox. Esses agentes antiparasitários estão disponíveis há mais de 50 anos e têm toxicidade considerável e eficácia limitada 5,7,8. Consequentemente, há uma necessidade premente de desenvolver tratamentos novos, seguros e mais eficazes para pacientes com doença de Chagas.
Técnicas mais sofisticadas e precisas possibilitam agora a obtenção de respostas para velhas perguntas que permitem avanços na busca de novos tratamentos para a doença de Chagas. Nesse sentido, a comunidade científica se beneficia muito dos parasitas geneticamente modificados para estudos in vivo sobre o curso da infecção e avaliação da eficácia dos medicamentos 9,10,11,12. Um ensaio longitudinal baseado no sistema de imagem de bioluminescência (BLI) permite a avaliação da eficácia durante e após o esquema de tratamento, levando à identificação de compostos com atividade tripanocida10,13. O método BLI fornece uma medição direta da carga parasitária, tanto em circulação quanto em tecidos e órgãos, por meio da quantificação da luz produzida pela linhagem geneticamente modificada T. cruzi CL Brener Luc::Neon11, que expressa constitutivamente a luciferase do vaga-lume12.
No entanto, quase 10 anos após o estabelecimento do modelo animal BLI da doença de Chagas e estudos de eficácia de drogas, apenas alguns grupos de pesquisa dominam essa técnica. Esse fato se deve não apenas ao acesso reduzido a equipamentos de imagem adequados, mas também à falta de treinamento e disponibilidade de protocolos estruturados e detalhados. Este método apresenta várias vantagens em relação a outras abordagens, que dependem da avaliação da parasitemia por microscopia, sorologia ou avaliação de infecção de órgãos/tecidos por qPCR para detecção de DNA do parasita, pois permite melhorar o bem-estar de camundongos e reduzir o uso de animais pela possibilidade de geração de dados mais robustos e integrados in vivo. Além disso, esse método é, sem dúvida, mais sensível, pois permite a detecção imediata de focos parasitários em órgãos viscerais após o tratamentomedicamentoso 10,12. Portanto, este protocolo visa orientar os grupos de pesquisa em Parasitologia e outras doenças infecciosas a estabelecerem essa metodologia em seus laboratórios, detalhando os procedimentos técnicos. Aqui, compartilhamos a experiência obtida com a implementação do modelo BLI da doença de Chagas no Brasil, o primeiro do gênero na América Latina, como parte dos esforços de descoberta de medicamentos coordenados pela iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi).

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa&trade; Analisador de Células X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança de Pesagem (instalações para animais)</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Revvity (antigo PerkinElmer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software FlowJ v10.7.1</td><td>Software BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image para Spectrum v4.7.1</td><td>Revvity (antigo PerkinElmer)</td><td></td><td>O software de análise sem licença chamado 'Aura Imaging' pode ser usado para os recursos mais básicos fornecidos pela Spectral Instruments Imaging (empresa Bruker) (https://spectralinvivo.com/software/)</td></tr> <tr><td>Software Microsoft Office</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Baixa Glicose</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,5% EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Meio LIT</td><td>In casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace&prime; s Inseto Médio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite d-luciferina sal de potássio</td><td>Revvity (antigo PerkinElmer)</td><td>122799</td><td>Também pode ser usado: VivoGlo Luciferina, grau in vivo (Promega/P1043); D-Luciferina, Sal Monopotássico (Thermo Scientific/88293) ou PierceD-Luciferina, Sal Monossódico* (Thermo Scientific/88291); D-Luciferina, Sal de Potássio (GoldBio/LUCK ou eLUCK); D-Luciferina, Sal de Sódio* (GoldBio/LUCNA ou eLUCNA) *As diferenças de sal de sódio ou potássio dependem de chances mínimas de solubilidade, no entanto, não afetam o desempenho in vivo.&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Ciclofosfamida (CTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr>(<tr><td>Hidroxipropil)metilcelulose (HPMC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>Álcool benzílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Benznidazol</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Posaconazol (formulação comercial Noxafil)</td><td>Schering-Phough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agulha de gavagem (aço inoxidável reto) - 22GA</td><td>Aton</td><td>&nbsp; CA2003</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL e agulha 31G</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL e agulha removível 26G</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL e agulha removível 24G X&frac34;</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Seringa Estéril 0.2 &micro; m</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel A4 Preto Fosco 120gr ou mais espesso</td><td>Cor do Papel/ Canson (Disponível em vários fornecedores)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>folha de alumínio</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara Neubauer</td><td>Disponível em vários fornecedores</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

Para controlar e diminuir o impacto na saúde pública de doenças de protozoários humanos, como doença de Chagas, leishmaniose e tripanossomíase humana africana, é necessário acelerar o desenvolvimento de novos medicamentos e vacinas. No entanto, esse processo está repleto de dificuldades, como biologia de parasitas altamente complexos e patogênese de doenças e, como típico de doenças tropicais negligenciadas, financiamento comparativamente limitado para pesquisa e desenvolvimento. Assim, modelos de estudo in vitro e in vivo que possam reproduzir suficientemente as principais características da infecção e da doença, ao mesmo tempo em que fornecem uso racional de recursos, são essenciais para o progresso da pesquisa para essas condições. Um exemplo é o modelo de camundongo de imagem de bioluminescência in vivo (BLI) para a doença de Chagas, que fornece detecção altamente sensível de luz de comprimento de onda longo gerada por parasitas Trypanosoma cruzi que expressam luciferase. Apesar dessa técnica se tornar a abordagem padrão para estudos de eficácia de medicamentos in vivo , os grupos de pesquisa ainda podem ter dificuldades para implementá-la devido à falta de treinamento prático adequado sobre manuseio de equipamentos e aplicação de procedimentos de controle de qualidade, mesmo quando o equipamento BLI adequado está prontamente disponível. Considerando esse cenário, este protocolo visa orientar desde o planejamento de experimentos até a aquisição e análise de dados, com detalhes que facilitem a implementação de protocolos em grupos de pesquisa com pouca ou nenhuma experiência com BLI, seja para doença de Chagas ou para outros modelos de camundongos infectologistas.

Usando um modelo de camundongo adequado baseado em parasitas transgênicos que expressam constitutivamente a luciferase, é possível reproduzir as principais características da infecção humana por T. cruzi causando danos mínimos ao hospedeiro, permitindo o rastreamento em tempo real dos parasitas por BLI de corpo inteiro do hospedeiro de forma longitudinal (ao longo da vida), por até vários meses12.
A Figura 3 mostra um experimento piloto demonstrando o curso do tempo de infecção por CL Brener Luc::Neon desde o dia 1 pós-infecção até 150 dpi em camundongos BALB/c. Nos primeiros 20 dpi, a carga parasitária inferida pela bioluminescência aumenta, típica do pico de parasitemia, seguida por uma diminuição acentuada na carga parasitária, devido ao controle imunológico dos camundongos. Assim, a fase aguda da infecção é considerada os primeiros 50 dpi. A fase crônica é definida quando a infecção atinge uma taxa bioluminescente constante, de 100-150 dpi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> Figura 3: Entendendo o modelo. Cinética da infecção por Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon em camundongos BALB/c (n = 11). Painel superior: imagens bioluminescentes ventrais e dorsais de diferentes momentos por 150 dias pós-infecção (dpi) com tripomastigotas 1 x 10³ da corrente sanguínea por injeção intraperitoneal. Escala do mapa de calor (em Log10) do sinal bioluminescente em radiância (p / s / cm2 / sr). Código de cores: Roxo = 5 x 103; vermelho = 1 x 107. Painel inferior: quantificação do sinal bioluminescente em Fluxo Total (p/s) de camundongos de corpo inteiro. Os dados são expressos como médias (linhas) e desvios padrão (regiões sombreadas). Os períodos definidos para as fases aguda e crônica da infecção neste modelo de camundongo são destacados em laranja. Os valores médios de luminescência de camundongos não infectados (n = 3) são mostrados como o limite (linha cinza claro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os resultados terapêuticos também podem ser previstos, uma vez que as principais fases da infecção são bem reproduzidas em um modelo de camundongo. Assim, o BLI agora é aplicado à ciência translacional por meio de estudos de prova de conceito que apoiam a tomada de decisão sobre o potencial de eficácia do composto e a progressão no pipeline de desenvolvimento10,27. No modelo agudo de camundongo, o tratamento oral deve ser iniciado quando a infecção atinge o pico de parasitemia (em torno de 14-21 dpi), caracterizado por um número elevado de tripomastigotas na corrente sanguínea (aproximadamente 1 x 105 tripomastigotas/mL - dados não mostrados) e infecção sistêmica. Na fase crônica, o tratamento com camundongos inicia-se em 100 dpi, quando a carga parasitária é comparativamente muito menor, com parasitemia subpatente estável.
Para demonstrar a aplicação do protocolo descrito acima na avaliação de agentes antiparasitários, comparamos a eficácia do tratamento do benznidazol (BZ), droga padrão utilizada para o tratamento da doença de Chagas, e do posaconazol (Posa), um inibidor da esterol 14α-desmetilase (CYP51) que falhou em ensaios clínicos para doença de Chagas, e que também se mostrou ineficaz como agente antiparasitário contra o T. cruzi in vitro e in vivo, inclusive no modelo BLI descrito neste protocolo 13,18,28,29,30.
Para o modelo de camundongo agudo, coortes de 6 camundongos por grupo foram tratadas por via oral por gavagem31 por 20 dias com Posa a 20 mg / kg ou BZ a 100 mg / kg, uma vez ao dia. Os camundongos também foram tratados com BZ por 5 dias a 100 mg / kg uma vez ao dia para avaliar o efeito de tratamentos curtos. Após a eliminação do composto (10 dias após o término do tratamento), os camundongos negativos para BLI foram imunossuprimidos, condição que promove recidiva da infecção quando a cura parasitológica não é alcançada (Figura 4A). O tratamento com Posa resultou em uma redução de 99,49% ± 0,27% (média ± desvio padrão) na carga parasitária inferida por bioluminescência no final do tratamento e permaneceu em níveis semelhantes de camundongos não infectados durante o período de eliminação do composto da droga (exceto para o camundongo # 3, com um sinal transitório a 40 dpi, e o camundongo # 2, que demonstrou um ponto fraco de BLI a 44 dpi). Em comparação com o grupo não tratado, o tratamento com BZ por 20 dias reduziu em 100% ± 0,01% a carga parasitária inferida pela bioluminescência ao final do tratamento. Em contraste, o tratamento curto com BZ por 5 dias levou a uma redução de 99,98% ± 0,03% a 19 dpi (semelhante ao nível limiar). No entanto, neste caso, a redução do BLI foi transitória e, nas aquisições subsequentes, todos os camundongos apresentaram reativação da infecção (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> Figura 4: Desenho de experimento de prova de conceito e resultados obtidos com imagens de bioluminescência no modelo agudo da doença de Chagas. (A) Gráfico esquemático do processo de linha do tempo no modelo de camundongo com doença de Chagas aguda para estudos pré-clínicos para avaliação da eficácia do composto. Pontos pretos: pontos de tempo de imagem. Frasco de remédio e barra laranja: início e fim do tratamento, respectivamente. Ícone da seringa: injeções de ciclofosfamida. DPI: dia pós-infecção. Código de cores: cinza = infecção não tratada; laranja = período de tratamento; azul = fase de eliminação do composto; amarelo = período de imunossupressão. (B) Curso de tempo de tratamento de Trypanosoma cruzi. Painel esquerdo: imagens de bioluminescência ventral de camundongos BALB/c (i) não tratados ou tratados por 20 dias com (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg, (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg tratados por 20 dias e (iv) BZ a 100 mg/kg tratados por 5 dias com (n = 6/grupo). Todos os tratamentos foram administrados por via oral por gavagem (10 mL/kg) uma vez ao dia. O mapa de calor da escala Log10 indica a intensidade do sinal bioluminescente de baixo nível (azul) a alto (vermelho). Gráfico à direita: quantificação de corpo inteiro dos dados de imagem de bioluminescência. Os dados são expressos como médias (linhas) e desvios padrão (regiões sombreadas). Legenda: Frasco de medicamento: início do tratamento (14 dpi); barra laranja: final do tratamento (18 dpi/33 dpi); injeções de ciclofosfamida com ícone de seringa (do dia 44-53); ponto laranja: camundongo analisado pelo procedimento ex vivo ; § dados excluídos devido a vazamento de D-luciferina na urina. (C) Procedimento ex vivo para detecção de focos de T. cruzi em órgãos e tecidos. A chave de distribuição da placa é apresentada na parte inferior da figura (criada com BioRender.com: ZY26LG8AOF). Mesma escala de radiância mostrada no painel vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Nesse modelo, o tratamento antiparasitário pode reduzir a carga parasitária abaixo do limite de detecção do BLI de 1000 parasitas. Assim, os camundongos aparecem como BLI negativo10. Para garantir que a cura parasitológica tenha sido alcançada, é necessário promover a imunossupressão de camundongos usando o tratamento com ciclofosfamida29,32. Camundongos que ainda têm uma carga parasitária indetectável após o tratamento medicamentoso se tornarão positivos para BLI após imunossupressão. Esse efeito é demonstrado mais extensivamente pelo tratamento com Posa no modelo agudo, que promove a recidiva do parasita. Neste experimento, o procedimento ex vivo foi realizado em camundongos com o menor sinal bioluminescente para avaliar o tropismo do tecido parasitário (Figura 4C). Camundongos não tratados mostram fortes sinais bioluminescentes, especialmente no trato gastrointestinal (TGI) e tecidos associados, como gordura visceral e mesentério. Além disso, a pele foi um local associado à persistência do parasito. Os camundongos tratados com Posa apresentaram manchas bioluminescentes de menor intensidade e mais restritas ao cólon, mesentério e gordura visceral. Por outro lado, em camundongos tratados com um regime de tratamento curativo, como BZ 100 mg/kg por 20 dias, nenhum sinal bioluminescente é detectado mesmo sob imunossupressão. Portanto, considerando que após promover condições para o sinal bioluminescente subir acima do nível limite de 1000 parasitas10 e aumentar a sensibilidade pela exposição dos órgãos viscerais, considera-se que BZ 100 mg/kg por 20 dias proporciona cura estéril. A avaliação da cura estéril foi previamente validada por diferentes técnicas 10,13,17,33,34.
Um desenho de estudo semelhante foi aplicado ao modelo crônico (Figura 5A), no qual camundongos (n = 6 / grupo) começaram a ser tratados no dia 100 pós-infecção. Neste ponto, Posa 20 mg / kg, BZ a 100 mg / kg ou 10 mg / kg uma vez ao dia foram administrados por via oral por 20 dias. Após o período de eliminação da droga, os camundongos BLI-negativos foram imunossuprimidos. Além disso, para avaliar a cura estéril, camundongos que ainda eram negativos para BLI no final da fase de imunossupressão foram submetidos a análise ex vivo .
Na infecção crônica, o tratamento com Posa a 20 mg / kg levou a uma diminuição de 95,03% ± 6,18% na carga parasitária inferida por bioluminescência no final do tratamento e permaneceu em níveis semelhantes de camundongos não infectados durante o período de eliminação do medicamento. Após a imunossupressão, a maioria dos camundongos apresentou um nível variável de sinal e distribuição de BLI (Figura 5B). O procedimento ex vivo revelou que um camundongo BLI negativo de corpo inteiro tratado com Posa tinha uma mancha bioluminescente no cólon detectável por meio de exame ex vivo ( Figura 5C ).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> Figura 5: Desenho do experimento de avaliação de drogas e resultados alcançados no modelo crônico de infecção por Trypanosoma cruzi por imagem de bioluminescência. (A) Gráfico esquemático do desenho do experimento do modelo de camundongo com doença de Chagas crônica. Pontos pretos: pontos de tempo de imagem. Frasco de remédio e barra laranja: início e fim do tratamento, respectivamente. Ícone da seringa: injeções de ciclofosfamida. Dpi: dia pós-infecção. Código de cores: Cinza = infecção não tratada; laranja = período de tratamento; azul = fase de eliminação do composto; amarelo = imunossupressão; lilás = recidiva. (B) Avaliação longitudinal da eficácia do tratamento no modelo crônico da doença de Chagas. Painel esquerdo: BLI ventral de camundongos BALB/c (i) não tratados ou tratados por 20 dias com (ii) posaconazol (Posa) a 20 mg/kg; (iii) benznidazol (BZ) a 100 mg/kg e (iv) BZ a 10 mg/kg (n = 6/grupo). Todos os tratamentos foram administrados por via oral por gavagem uma vez ao dia. Gráfico à direita: soma dos dados brutos do fluxo total ventral e dorsal. Chave: frasco de medicamento: início do tratamento (102 dpi); barra laranja: final do tratamento (121 dpi); Ícone amarelo da barra e da seringa: injeções de ciclofosfamida (do dia 131-142). Ponto laranja: camundongo analisado por procedimento ex vivo . ! camundongo morreu durante a anestesia. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;"> O camundongo exibe anormalidades abdominais. A escala do mapa de calor (Log10) indica a intensidade da bioluminescência na unidade de radiância de baixo nível (3 × 105 como azul) a alto (1 × 107 como vermelho). (C) Análise ex vivo do tropismo de T. cruzi em tecido. Detecção de bioluminescência de órgãos excisados de camundongos imunossuprimidos in vivo BLI-negativos após tratamento com Posa e BZ a 100 mg / kg ou camundongos com o sinal mais baixo em grupos não tratados e BZ a 10 mg / kg. A chave de distribuição da placa é mostrada na parte inferior da figura (criada com BioRender.com: ZY26LG8AOF). A escala de radiância é igual ao painel in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O tratamento com BZ a 100 mg/kg reduziu a bioluminescência a níveis limiares (93,87% ± 2,14%) a 122 dpi e encaminhou até o final do experimento. Considerando a análise ex vivo , BZ alcançou uma taxa de cura de 100% (6/6 camundongos), pois nenhum camundongo apresentou retorno do sinal bioluminescente mesmo quando imunossuprimidos e órgãos internos foram examinados. Isso significa falta de recaída. No entanto, o regime de tratamento com BZ com uma concentração mais baixa resultou em uma ligeira redução da bioluminescência (85,95% ± 18,43%), mas sem cura, pois os camundongos continuaram a mostrar focos de sinal bioluminescentes detectáveis em todos os pontos de tempo subsequentes. Assim, este modelo permite a diferenciação quantitativa entre tratamentos ineficazes (posaconazol e tratamento subótimo com benznidazol) e tratamentos eficazes (dosagem ideal e duração do tratamento com benznidazol).
Figura suplementar 1: Análise pré-infecção da expressão populacional de luciferase por T . cruzi por medição da fluorescência mNeonGreen do gene repórter. Citometria de fluxo da proteína fluorescente mNeonGreen expressa constitutivamente pelo parasita CL Brener Luc::Neon. Histograma normalizado do número de parasitas (eixo Y) pela intensidade de fluorescência mNeonGreen (eixo X). A legenda interna demonstra a cepa e a forma analisadas, a mediana de fluorescência e a porcentagem da população de fluorescência. As linhas de portão são definidas pela cepa do tipo selvagem CL Brener (WT) como controle não fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Exemplo de tabela de análise na medição do IVM. Dados brutos obtidos da quantificação por imagem de bioluminescência do dia 19 pós-infecção no modelo agudo usado nos resultados representativos mostrados na Figura 4B. Descrição dos grupos: Controle como camundongos não infectados (n = 3/grupo); veículo como camundongos infectados não tratados; posaconazol (Posa) a 20 mg/kg durante 20 dias; benznidazol (BZ) a 100 mg/kg por 20 dias; BZ a 100 mg/kg tratado por 5 dias (n = 6/grupo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

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