Name: Fabricação de Nanocompósitos Antibacterianos de Óxido de Grafeno/Cobre (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprenda a fabricar nanocompósitos de óxido de grafeno/cobre com atividade antibacteriana contra bactérias resistentes a antibióticos. Este método de baixo custo permite produção em larga escala para aplicações biomédicas.

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1. Preparação dos nanocompósitos GO/
NOTA: O tamanho e a morfologia das nanopartículas de que crescem nas nanofolhas de GO são determinados pelo grau de oxidação de GO, a concentração do precursor de e a concentração do agente redutor26.
<ol><li>Prepare 10 mL de suspensão de GO de 1 mg / mL em um frasco de vidro. Sonicar a suspensão de GO durante 1 h até que o GO esteja bem disperso em água destilada (DI).</li>
	<li>Prepare uma solução de CuCl20 mM 2 num frasco para injetáveis de vidro. Sonicar a solução de CuCl2 até que o CuCl2 esteja bem disperso em água DI.</li>
	<li>Adicionar 10 ml da solução de CuCl2 20 mM à solução de GO e sonicar a mistura a 70 °C durante 1 h.</li>
	<li>Prepare uma solução de NaBH20 mM 4. CUIDADO: Este procedimento deve ser realizado em uma capela de exaustão química. Uma reação redox ocorre assim que o agente redutor NaBH4 é introduzido na água. Preparar a solução de NaBH4 imediatamente antes da experiência.</li>
	<li>Preparando a mistura de NaBH4, GO e CuCl2<ol><li>Adicione 20 mL da solução 20 mM de NaBH4 à mistura de GO e CuCl2 , mexendo com uma barra magnética a 200 rpm. Após adicionar a solução de NaBH4 , mexa continuamente por 30 min. CUIDADO: Este procedimento deve ser realizado em uma capela de exaustão química.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugação da mistura<ol><li>Transferir a mistura do passo 1.5.1 para um tubo de centrifugação. Centrifugue a solução a 23.000 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. CUIDADO: Ao operar a centrífuga, sempre mantenha o equilíbrio colocando tubos de igual peso.</li>
	</ol></li>
	<li>Ressuspenda a mistura de nanocompósitos GO/com 10 mL de água DI e sonice-os para permitir que o precipitado se disperse uniformemente por toda a solução.</li>
	<li>Centrifugue a solução a 23.000 × g por 10 min em temperatura ambiente; Em seguida, remova o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas 1.7-1.8 mais uma vez para remover os produtos químicos que não reagiram.</li>
	<li>Adicione 1 mL de água destilada aos nanocompósitos GO/e sonice a mistura para dispersar o sedimento uniformemente por toda a fase líquida. NOTA: Colete todas as soluções de nanocompósitos GO/em um tubo cônico.</li>
	<li>Liofilizar a solução a -60 °C sob vácuo durante a noite até que os nanocompósitos GO/estejam completamente secos e obtenham o pó nanocompósito GO/.</li>
	<li>Armazene o pó nanocompósito GO/a -20 °C até o uso.</li>
</ol>2. Preparação de bactérias para o teste antibacteriano
CUIDADO: Este procedimento deve ser realizado em uma cabine de segurança biológica com uma lâmpada de álcool. Os resíduos bacterianos devem ser autoclavados antes do descarte. Ao manusear bactérias resistentes a antibióticos, luvas, aventais e máscaras devem ser usados, e as mãos devem ser lavadas com sabão ou desinfetante para as mãos após o experimento. Sempre desinfete completamente; Se ocorrer contaminação na área experimental, desinfete-a imediatamente com etanol 70%.
<ol><li>Preparação de meios de cultura bacterianos<ol><li>Misture 20 g de ágar tríptico de soja e 500 mL de água destilada em um frasco. Esterilize a mistura em autoclave a 121 °C por 15 min.</li>
		<li>Prepare a placa de ágar despejando 15 mL da solução de ágar em uma placa de Petri antes que o ágar endureça. Conservar a placa de ágar-ágar a 4 °C até à utilização. NOTA: Isso deve ser feito rapidamente antes que a solução de ágar endureça. Para evitar contaminação, esterilize a placa de ágar com UV por 15 min durante o endurecimento.</li>
		<li>Misture 15 g de caldo tríptico de soja (TSB) e 500 mL de água destilada em um frasco. Esterilize a mistura em autoclave a 121 °C por 15 min.</li>
		<li>Alíquota 40-50 mL da solução de caldo em um tubo cônico de 50 mL. Conservar o caldo a 4 °C até à utilização. NOTA: Para evitar contaminação, esterilize o caldo aliquotado com UV por 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura bacteriana<ol><li>Inocular a solução-mãe MSRA ou P. aeruginosa na placa de ágar usando uma alça. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C com uma incubadora agitada durante 24 h.</li>
		<li>Inocule uma colônia da bactéria em 10 mL do caldo usando um laço. Incubar o caldo a 37 °C com uma incubadora agitada a 200 rpm durante 24 h.</li>
		<li>Repita as etapas 2.2.1-2.2.2 mais uma vez para obter bactérias com as mesmas características.</li>
		<li>Após 24 h, diluir em série a solução bacteriana dez vezes com água destilada estéril. Inocular 100 μl da suspensão bacteriana diluída na placa de ágar e espalhar com um espalhador. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C com uma incubadora agitada durante 24 h. NOTA: O nível de diluição depende das bactérias. Procure preparar menos de 100 colônias em uma placa de ágar.</li>
		<li>Contar as colónias bacterianas após 24 h de incubação para determinar a unidade formadora de colónias (UFC) utilizando a equação (1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66762/66762eq01.jpg" style="margin: auto;"> Características (1)</li>
		<li>Repita as etapas 2.2.4-2.2.5 pelo menos 3x para confirmar se a UFC da bactéria é relativamente constante.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Teste antibacteriano usando o método de caldo de microdiluição
<ol><li>Dia 1) Inocule uma colônia da bactéria da placa de ágar em 10 mL do caldo usando um laço. Incubar o caldo a 37 °C com uma incubadora agitada a 200 rpm durante 24 h.</li>
	<li>Dia 2) Prepare a mistura de nanocompósitos GO / em pelo menos três concentrações usando solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco. Sonicar a suspensão de nanocompósitos GO/até que os nanocompósitos GO/estejam bem dispersos em DPBS. NOTA: Neste protocolo, foram testados 500, 250, 125 e 62,5 μg/mL da mistura nanocompósita GO/.</li>
	<li>Prepare as soluções de controle. O controle negativo é a SPBD, e o controle positivo é 1% de uma solução de penicilina/estreptomicina na SPBD que matará a bactéria.</li>
	<li>Adicione 100 μL da suspensão de nanocompósitos GO/e as soluções de controle em placas de 96 poços. Adicione todas as amostras em triplicado. NOTA: Esterilize as amostras com UV por 15 minutos antes de aplicá-las às bactérias.</li>
	<li>Com base na UFC após 24 h de incubação, diluir a suspensão bacteriana usando TSB a 1 × 106 UFC/mL. NOTA: As concentrações iniciais de MRSA e suspensão de cultura de P. aeruginosa em nosso estudo, de acordo com a etapa 2.2.5, são de 4,5 × 109 UFC/mL e 3 × 109 UFC/mL, respectivamente. Concentrações bacterianas de 1 × 106 UFC/mL são obtidas diluindo as culturas em 4.500x e 3.000x, respectivamente.</li>
	<li>Inocular 100 μL da suspensão bacteriana diluída de 1 ×10 6 UFC/ml nos alvéolos de amostra nas placas de 96 poços. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C usando uma incubadora agitada a 200 rpm por 24 h. NOTA: A concentração final de bactérias é de 5 × 105 UFC/mL após mistura com 100 μL de amostra.</li>
	<li>Dia 3) Misture vigorosamente a amostra e as suspensões bacterianas com uma ponta de micropipeta de 200 μL. Diluir em série a mistura amostra-bactéria dez vezes com água destilada estéril. NOTA: O nível de diluição depende das bactérias. Procure preparar menos de 100 colônias em uma placa de ágar.</li>
	<li>Inocular 100 μl da suspensão bacteriana diluída na placa de ágar e espalhar com um espalhador. Incubar a placa de ágar-ágar a 37 °C com uma incubadora agitada durante 24 h.</li>
	<li>Dia 4) Conte as colônias bacterianas e determine os valores de UFC para confirmar a atividade antibacteriana dos nanocompósitos GO/usando a equação (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66762/66762eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Óxido de grafeno antibacteriano/nanocompósitos de cobre para bactérias resistentes

<ol><li>Doron, S., Gorbach, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infections%3A+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22International+Encyclopedia+of+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Bacterial infections: Overview.</a> International Encyclopedia of Public Health. , 273-282 (2008).</li>
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<li>Sánchez-López, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-based+nanoparticles+as+antimicrobial+agents%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Metal-based nanoparticles as antimicrobial agents: An overview.</a> Nanomaterials (Basel). 10 (2), 292(2020).</li>
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<li>Liang, X., Govindaraju, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+applicability+of+polyaniline+coated+gold+nanorods%3A+A+study+of+antibacterial+and+redox+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BioChip+J%22%5BJournal%5D)">Dual applicability of polyaniline coated gold nanorods: A study of antibacterial and redox activity.</a> BioChip J. 12 (2), 137-145 (2018).</li>
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<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%2Fcopper+nanoderivatives-modified+chitosan%2Fhyaluronic+acid+dressings+for+facilitating+wound+healing+in+infected+full-thickness+skin+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide/copper nanoderivatives-modified chitosan/hyaluronic acid dressings for facilitating wound healing in infected full-thickness skin defects.</a> Int J Nanomedicine. 15, 8231-8247 (2020).</li>
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<li>Afreen, G., Shoeb, M., Upadhyayula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+reactive+oxygen+species+generated+from+rgo%2Fcds+qd+heterostructure+for+photodegradation+and+disinfection+of+pollutants+in+waste+water%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of reactive oxygen species generated from rgo/cds qd heterostructure for photodegradation and disinfection of pollutants in waste water.</a> Mater Sci Eng C. 108, 110372(2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Cepas bacterianas MDR clínicas&nbsp;</td><td>Hospital Universitário Chung-Ang (Seul, Coreia do Sul)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobre (II) di-hidratado</td><td>Duksan</td><td>10125-13-0</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura por Emissão de Campo (FE-SEM)</td><td>Carl Zeiss</td><td>SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de grafeno</td><td>Sigma</td><td>796034</td><td></td></tr><tr><td>Borohidreto de Sódio</td><td>Sigma</td><td>71320</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Soja Tríptica</td><td>BD difco</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tríptico</td><td>BD difco</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de nanocompósitos antibacterianos de Óxido de grafeno/cobre

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDS) foram realizadas para confirmar a formação de nanocompósitos GO/. A Figura 1A, B mostra que nanopartículas heterogêneas de foram cultivadas nas folhas de GO. Conforme mostrado na Figura 1C, o mapeamento EDS confirmou que as partículas na folha GO eram nanopartículas de.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66762/66762fig01.jpg"> Figura 1: Características dos nanocompósitos GO/. (A) Microscopia eletrônica de transmissão, (B) microscopia eletrônica de varredura e (C) imagens de espectroscopia de raios-X por dispersão de energia confirmando a formação de nanocompósitos GO/. Barras de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66762/66762fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As cepas bacterianas, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), isoladas de feridas de pacientes, exibem resistência a vários antibióticos, conforme descrito na Tabela 1 e na Tabela 2. A Figura 2A,B ilustra a eficácia antibacteriana dos nanocompósitos GO/contra MRSA e P. aeruginosa, respectivamente. Notavelmente, o crescimento bacteriano foi significativamente inibido à medida que a concentração dos nanocompósitos GO/aumentou. Descobrimos que 125 μg/mL dos nanocompósitos GO/sintetizados foram suficientes para uma atividade antibacteriana eficaz contra MRSA e P. aeruginosa. Especificamente, 99,8% do MRSA e 84,7% do P. aeruginosa foram erradicados pelo tratamento com 500 μg/mL de nanocompósitos GO/. As diferentes porcentagens de erradicação bacteriana podem ser atribuídas às estruturas biológicas distintas de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Bactérias Gram-positivas, como MRSA, possuem uma parede celular que compreende mais de 90% de peptidoglicano. Em contraste, bactérias gram-negativas, como P. aeruginosa, têm apenas 5% -20% de peptidoglicano em suas paredes celulares com uma membrana externa. Essa membrana externa fornece às bactérias gram-negativas uma resistência robusta a agentes antimicrobianos, impedindo a penetração desses agentes27. No entanto, os nanocompósitos GO/podem efetivamente eliminar bactérias resistentes a antibióticos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66762/66762fig02v2.jpg"> Figura 2: Efeitos antibacterianos dos nanocompósitos GO/. (A) MRSA e (B) Pseudomonas aeruginosa obtida de feridas clínicas. Os dados são apresentados como média ± EPM (n = 4). p &lt; 0,001; p &lt; 0,0001. MRSA = Staphylococcus aureus resistente à meticilina; P = controle positivo; N = controle negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66762/66762fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Antibióticos</td>
			<td>CIM (μg/mL)</td>
			<td>Interpretação</td>
		</tr><tr><td>Clindamicina</td>
			<td>≤ 0,25</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Ciprofloxacina</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Eritromicina</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina</td>
			<td>≥ 16</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Mupirocina</td>
			<td>≥ 512</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-G</td>
			<td>≥ 0,5</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Tigeciclina</td>
			<td>≤ 0,12</td>
			<td>S</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Teste de suscetibilidade a antibióticos contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina. Abreviaturas: CIM = concentração inibitória mínima; S = suscetível; R = resistente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Antibióticos</td>
			<td>CIM (μg/mL)</td>
			<td>Interpretação</td>
		</tr><tr><td>Cefotaxima</td>
			<td>32</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Ciprofloxacina</td>
			<td>≤ 0,25</td>
			<td>S</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina</td>
			<td>2</td>
			<td>S</td>
		</tr><tr><td>Minociclina</td>
			<td>≥ 16</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Ticarcilina/CA</td>
			<td>32</td>
			<td>Eu</td>
		</tr><tr><td>Tigeciclina</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>Trimetoprima/sulfa</td>
			<td>80</td>
			<td>R</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Teste de sensibilidade a antibióticos contra P. aeruginosa. Abreviaturas: CIM = concentração inibitória mínima; S = suscetível; I = Intermediário; R = resistente.

Fabricação de Nanocompósitos Antibacterianos de Óxido de Grafeno/Cobre

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...

fabrication-of-antibacterial-graphene-oxidecopper-nanocomposites

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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