Name: Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a isolar microglia hipotalâmica de camundongos adultos usando MACS para estudar interações entre microglia e neurônios e os efeitos da nutrição no metabolismo cerebral.

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A AN é apoiada pelo Institut Universitaire de France (IUF), pela Universidade de Bordeaux, pela Fundação Francesa para Pesquisa do Cérebro (FRC), pelo GLN (Grupo de Nutrição Lipídica) e pela Agência Nacional de Pesquisa (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). A CA foi apoiada pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Este projeto recebeu financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon Europe da União Europeia no âmbito das Redes de Doutorado MSCA 2021, nº 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Todos os experimentos em animais descritos foram conduzidos em estrita conformidade com as recomendações da União Europeia (2013/63/UE) e foram aprovados pelo comitê de ética local da Universidade de Bordeaux (CEEA50) e pelo Ministério Francês de Ensino Superior, Pesquisa e Inovação (resumo não técnico do projeto aprovado NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).
O protocolo a seguir é realizado em camundongos C57BL/6 adultos com idade média de 2 a 4 meses. No entanto, pode ser realizado em todas as idades e condições de camundongos, levando em consideração que a paisagem celular imune do SNC pode ser alterada e a porcentagem de macrófagos e monócitos residentes pode ser aumentada (por exemplo, no envelhecimento e neurodegeneração).
1. Preparação das soluções
NOTA: Os seguintes volumes e soluções referem-se estritamente ao isolamento de células Cd11b+.
<ol><li>Determine o volume total de D-PBS/0,5% de albumina de soro bovino (BSA) necessário com base no número de amostras. Prepare a solução usando o D-PBS disponível comercialmente com cálcio e magnésio e pó de BSA (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prepare os tubos de dissociação rotulados (C-Tubes) e encha cada um com 1.900 μL de tampão Z, fornecido no kit de dissociação do tecido cerebral adulto (consulte a Tabela de Materiais). Descongele as enzimas e mantenha-as no gelo, juntamente com todos os tampões necessários nas etapas a seguir.</li>
	<li>Prepare e coloque o volume apropriado de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (consulte a Tabela de Materiais) necessário para a perfusão (etapa 2.6) no gelo. Calcule 10 mL para cada animal mais 10% em excesso.</li>
	<li>Para análise de RT-qPCR, prepare tampão qPCR por amostra: 2,5 μL de tioglicerol + 250 μL de tampão de lise, usando um kit disponível comercialmente para purificar o RNA (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Para quantificação de proteínas, prepare o tampão de lise diluindo o coquetel de inibidores de fosfatase e o coquetel de inibidores de protease 1:100 em um tampão de extração de mamíferos (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Para a detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) e ensaio de fagocitose, prepare 1x HBSS a partir do 10x HBSS disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, prepare o buffer FACS adicionando 0,2% BSA a 1x HBSS.</li>
</ol>2. Remoção do cérebro
<ol><li>Sedar o animal com uma dose de 20 mg/kg de xilazina; Em seguida, eutanasiar o camundongo com uma overdose de 400 mg / kg de pentobarbital e colocá-lo em decúbito dorsal em uma bandeja de dissecação. NOTA: Outras combinações anestésicas para sacrificar o animal também podem funcionar.</li>
	<li>Encha uma seringa de 10 mL com 10 mL de 1x PBS gelado e coloque-a em uma agulha borboleta 21 G.</li>
	<li>Uma vez que o camundongo esteja completamente anestesiado (verifique beliscando as patas para garantir a falta de resposta), a respiração interrompida e o coração esteja em fibrilação, cubra a pele com uma pinça e abra a cavidade torácica com uma tesoura, ao nível das últimas costelas e do esterno.</li>
	<li>Use a tesoura para fazer um corte profundo ao longo das laterais da caixa torácica em direção ao topo da caixa torácica para expor o coração.</li>
	<li>Insira a agulha 21 G na parte distal do ventrículo esquerdo (certifique-se de que aproximadamente 1/3 da agulha esteja dentro do ventrículo). Faça imediatamente uma incisão no átrio direito usando a tesoura.</li>
	<li>Infunda 10 mL de 1x PBS gelado para limpar o cérebro de quaisquer células imunológicas circulantes. NOTA: Verifique visualmente o cérebro para garantir que esteja limpo e bem perfundido.</li>
	<li>Corte a cabeça do rato, extraia cuidadosamente o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri cheia de gelo e coberta com papel alumínio. NOTA: A placa de Petri e a folha ajudam a ver os pedaços do cérebro. É benéfico manter um ambiente fresco durante o corte das peças cerebrais para limitar as atividades metabólicas.</li>
	<li>Isole o hipotálamo usando uma pinça e corte-o em pedaços pequenos com lâminas de barbear.<ol><li>Para identificar e dissecar o hipotálamo, coloque o cérebro de cabeça para baixo de modo que o córtex fique ventral e o hipotálamo visível dorsalmente na superfície superior. Separe o hipotálamo, que está localizado na parte inferior do cérebro em ambos os lados do terceiro ventrículo, usando uma pinça curva. O peso médio do hipotálamo de camundongos C57BL/6 adultos é de 15 mg. NOTA: Os pedaços de cérebro devem ser o menor possível (<0,5 mm). Cortar em pedaços pequenos é uma etapa crítica, pois permite uma melhor dissociação e um maior rendimento de células.</li>
	</ol></li>
	<li>Colete os pedaços do hipotálamo em tubos de dissociação (tubos C) previamente preenchidos com 1.900 μL de tampão Z (etapa 1.2). NOTA: Para ter um bom rendimento de células microgliais suficiente para realizar ensaios, agrupe um mínimo de dois (para quantificação de proteínas) ou três (para qPCR e RNAseq) hipotálamos por tubo.</li>
</ol>3. Dissociação tecidual
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas no gelo. Não vórtice a suspensão celular em nenhuma etapa; misture cuidadosamente apenas com uma pipeta de 1.000 μL.
<ol><li>Preparar a mistura enzimática 2 de acordo com a Tabela 1 (calculando o volume total para todos os tubos + 10% em excesso). Em cada tubo C, adicione 50 μL da enzima contida na mistura 1 (ver Tabela 1) e 30 μL da mistura enzimática 2. Todas as enzimas são fornecidas no kit de dissociação do tecido cerebral adulto (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Feche os tubos C e coloque-os de cabeça para baixo no dissociador com os suportes de aquecimento de acordo com as instruções do fabricante. Execute o programa 37C_ABDK_02.</li>
	<li>Prepare tubos de pressão de 15 mL (consulte a Tabela de Materiais) com filtros de 70 μm em cima deles. Molhe o filtro com 2 mL de D-PBS.</li>
	<li>Quando o programa de dissociação/digestão terminar, esvazie o tubo C no filtro e raspe com uma ponta de 200 μL para reduzir a perda celular, aumentando a filtração celular e reduzindo a aderência do homogeneizado de tecido no filtro.</li>
	<li>Lave o tubo com 2 x 5 mL de D-PBS, esvazie as lavagens no filtro e raspe com uma ponta de 200 μL entre as lavagens.</li>
	<li>Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular com o volume apropriado de D-PBS frio de acordo com a Tabela 1.</li>
	<li>Misture imediatamente cuidadosamente com 450 μL de reagente de gradiente de densidade (Solução de Remoção de Detritos, consulte a Tabela de Materiais) e cubra muito suavemente com 2 mL de D-PBS frio (consulte a Tabela 1). NOTA: Para obter as diferentes camadas de gradiente de densidade, o D-PBS deve ser sobreposto suavemente gota a gota, com o mínimo de "perturbação" possível, 1 mL de cada vez com uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C com aceleração lenta e travão lento (se 9 for equivalente a cheio, utilizar 5).</li>
	<li>Três fases são formadas. Aspire as duas fases superiores completamente e descarte-as. Certifique-se de não aspirar a terceira fase inferior.</li>
	<li>Encha com 1800 μL de D-PBS frio e inverta suavemente o tubo 3 vezes.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C com aceleração total e travão total e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular pipetando lentamente para cima e para baixo com 2 mL de D-PBS / BSA.</li>
</ol>4. Isolamento magnético de células CD11b +
<ol><li>Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C e aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular em 90 μL de tampão D-PBS/BSA.</li>
	<li>Adicione 10 μL da mistura de microesferas CD11b e misture bem com a pipeta.</li>
	<li>Incubar durante 15 min a 2-8 °C no frigorífico, não no gelo; lavar as células adicionando 1 ml de D-PBS/BSA e centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C; aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente em 500 μL de D-PBS/BSA.</li>
	<li>Inicie o programa POSSEL2 no separador seguindo as instruções na tela. Coloque as pequenas colunas (consulte a Tabela de Materiais) no campo magnético. NOTA: Colunas pequenas ou grandes podem ser escolhidas para classificação de células magnéticas, de acordo com o número médio de células esperado. Colunas pequenas têm capacidade de até 1 × 107 células rotuladas e colunas grandes de até 1 × 108. Ao isolar células de pequenas estruturas, como o hipotálamo, pequenas colunas são aconselhadas. Os volumes dos reagentes são diferentes quando se utilizam colunas grandes (ver instruções do fabricante).</li>
	<li>Umedeça as colunas (consulte a Tabela de Materiais) com 500 μL de D-PBS/BSA. Se a fração negativa de células (CD11b-) for necessária para análise posterior, coloque uma placa coletora sob as colunas e, em seguida, aplique a suspensão celular nas colunas.</li>
	<li>Execute três etapas de lavagem adicionando 500 μL de D-PBS/BSA de cada vez na coluna, cada vez esperando que o tampão passe pela coluna. NOTA: é importante evitar que a parte superior da coluna seque, por isso é aconselhável não esperar até que todo o buffer tenha passado.</li>
	<li>Transferir o efluente total da fração CD11b- dos poços da placa coletora para tubos de 15 mililitros.</li>
	<li>Remova a coluna do separador, coloque-a em um tubo de 5 mL e pipete 1 mL de D-PBS / BSA na coluna.</li>
	<li>Lave imediatamente a fração de célula marcada magneticamente aplicando firmemente o êmbolo fornecido com a coluna.</li>
	<li>Eventualmente, conte as células CD11b + com um hemacitômetro ou qualquer outro método; Espere ~ 15.000 células por hipotálamo.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 300 ×g durante 10 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.</li>
</ol>5. Análises
<ol><li>Para a análise de RT-qPCR, ressuspenda os grânulos celulares com tampão qPCR (para preparação, ver passo 1.3) e armazene os tubos a -80 °C até à extração do ARNm. Isole o RNA total, processe-o e analise-o seguindo as diretrizes do MIQE14. Finalmente, sintetize o cDNA e execute qPCR usando um dispositivo RT-PCR. Consulte a Tabela de Materiais para todos os kits usados disponíveis comercialmente.</li>
	<li>Para quantificação de proteínas, lave os pellets celulares com D-PBS (sem BSA) pelo menos 2x para eliminar o BSA. Em seguida, ressuspenda os grânulos celulares de dois hipotálamos com 20 μL de tampão de lise. Prossiga com a quantificação de proteínas com um kit de ensaio de proteínas (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Seguimos as instruções do fabricante15 para quantificar proteínas para realizar o ensaio de atividade de serina/treonina quinases.</li>
	<li>Para a detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em células microgliais, ressuspenda o pellet em 1x HBSS. Trate as células seguindo o protocolo do fabricante do kit para Ensaio de Citometria de Fluxo (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, ressuspenda as células tratadas em 200 μL de tampão FACS (para preparação, consulte a etapa 1.5) e execute o FACS para detectar células estressadas oxidativamente.</li>
	<li>Para o ensaio de fagocitose, incube as células classificadas em D-PBS/BSA com esferas de látex fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min. Adapte o número de contas para ter 4 contas por célula em média. Em seguida, centrifugar a 300 × g durante 7 min a 4 °C, ressuspender em 200 μl de tampão FACS e ler a emissão de fluorescência por FACS (λex 575 nm; λem 610 nm).</li>
</ol>

Isolamento da microglia hipotalâmica de camundongos usando MACS para ensaios in vitro

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</ol>

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

O protocolo atual apresenta o isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongos adultos recém-perfundidos por Magnetic-Activated Cell Sorting. Os resultados apresentados acima confirmam a pureza e viabilidade das células isoladas, bem como a eficácia deste método para caracterizar funcionalmente a microglia ex vivo, por exemplo, através da atividade fagocítica e quantificação da produção de ROS. Métodos clássicos para o isolamento de uma população de células específica também podem ser usados para células microgliais. O fracionamento do gradiente de densidade é um método bem conhecido para a separação de diferentes células e suas partículas de acordo com seu tamanho e/ou densidade. Esta técnica pode ser aplicada para o isolamento e cultura de microglia primária. No entanto, a purificação da micróglia adulta requer uma classificação adicional das células cerebrais isoladas usando a classificação de células ativadas por fluorescência ou imunomagnéticas.
Especificamente, o FACS depende de anticorpos bioquímicos marcados com fluorescência para rotular as células e distingui-las de acordo com um grande número de variáveis que vão além dos marcadores de superfície, como seu tamanho e estado metabólico. No entanto, o processo de purificação celular pode ser mais lento e não tão suave, aumentando o número de células mortas, além de exigir um rendimento inicial substancial. Portanto, o pequeno número de microglia hipotalâmica já é um fator limitante. O MACS utiliza esferas magnéticas conjugadas a certos anticorpos contra epítopos celulares específicos e pode funcionar com um rendimento inicial modesto, facilitando os estudos específicos da região sobre a dinâmica microglial. Devido ao forte campo magnético das microesferas, é necessária uma rotulagem mínima; portanto, é mais suave que o FACS, garantindo a manutenção da integridade da célula. Além disso, o MACS é mais rápido que o FACS quando o manuseio simultâneo de várias amostras é necessário. Isso fornece a vantagem distinta de manter a alta viabilidade celular que também pode vir de um pequeno rendimento inicial (Tabela 3).
Os principais desafios no isolamento da microglia do hipotálamo, que podem ser efetivamente resolvidos por meio da tecnologia MACS, incluem alcançar um rendimento final suficiente e garantir a preservação da integridade celular. A quantidade de células necessária depende da natureza da análise escolhida pós-isolamento. Por exemplo, o estudo do papel funcional da microglia in vitro requer um número substancial de células. Isso ressalta a importância de um pool inicial da mesma região do cérebro de camundongos distintos com condições idênticas antes de prosseguir para o processo de isolamento. Por outro lado, técnicas como sequenciamento de célula única de alta precisão não requerem uma grande população de células e, por sua vez, não é necessário agrupar vários camundongos.
Para maximizar o rendimento celular, é crucial aderir a etapas específicas do protocolo. A dissociação eficaz é iniciada cortando o hipotálamo em pequenos pedaços e, em seguida, garantindo que eles sejam mantidos no tampão na parte inferior do tubo durante o processo. Então, uma combinação de dissociação mecânica com degradação enzimática da matriz extracelular garante um rendimento celular significativamente alto. No entanto, devemos ser extremamente cautelosos com a interpretação dos resultados, uma vez que a dissociação enzimática realizada a 37 °C pode induzir alterações transcricionais e translacionais19. Para evitar alterações tecnicamente mediadas, os controles apropriados com inibidores transcricionais e translacionais podem ser usados19. Também é possível proceder à dissociação enzimática a uma temperatura mais baixa, como em uma câmara fria (a eficácia pode ser reduzida), embora a dissociação possa depender mais do efeito mecânico do que enzimático. Após a dissociação, a suspensão celular é pré-lavada e transferida para os filtros, e duas lavagens mais completas dos tubos são realizadas para evitar a perda celular. Mais uma etapa crítica é a remoção de detritos e mielina obtida pela centrifugação do gradiente de densidade e pela formação de diferentes camadas. Portanto, atingir um rendimento final considerável requer um manuseio meticuloso do tecido hipotalâmico e da suspensão celular, mantendo-os sempre no gelo para desacelerar o metabolismo e manter seu fenótipo in vivo .
Além disso, existem certos pontos que devemos ser extremamente cuidadosos para alcançar a mais alta pureza da microglia e manter o fenótipo das células da microglia. Inicialmente, a perfusão realizada a 4 °C é crucial para a eliminação de todas as células CD11b+ circulantes, garantindo o maior potencial de pureza da microglia. No entanto, em caso de ruptura da barreira hematoencefálica, uma porcentagem maior de células imunes circulantes pode colonizar o cérebro, interferindo no estudo da própria micróglia. Para mitigar esse problema, uma abordagem alternativa envolve a implementação de uma rodada secundária de isolamento magnético utilizando microesferas conjugadas ao anticorpo CD45. CD45 é um marcador de superfície celular exibindo alta expressão em macrófagos20 e o fluxo subsequente desta rodada compreende apenas as células microgliais. Essa estratégia de usar duas rodadas de isolamento magnético aumenta a especificidade do processo; no entanto, leva mais tempo, o que representa um risco potencial de interrupção da integridade celular e/ou fenótipo da microglia. Portanto, um fator crucial para preservar as características funcionais e a integridade das células envolve isolar rapidamente o tecido cerebral e mantê-lo no gelo até que o processo de dissociação seja iniciado. Em resumo, essa abordagem analítica aprimora a compreensão da função e do comportamento microglial, fornecendo informações valiosas sobre suas respostas dinâmicas no hipotálamo.

A microglia corresponde a 5-20% do total de células neurais e são as únicas células gliais que se originam de progenitores eritromieloides no saco vitelino e começam a colonizar o cérebro em desenvolvimento por volta do dia embrionário E9.5 1,2. São células de vida longa com a capacidade de se auto-renovar lentamente, independentemente das células derivadas da medula óssea3. Como algumas das células mais altamente dinâmicas, elas são capazes de adquirir diversos fenótipos em resposta a pistas contextuais e ambientais 2,4. Entre os sinais capazes de modular sua atividade, os danos ao sistema nervoso central (SNC), a atividade neuronal, bem como os nutrientes, são os mais potentes. Um crescente corpo de pesquisas demonstrou o papel fundamental da microglia em lesões, doenças neurodegenerativas e obesidade 2,5,6. No entanto, o papel preciso da microglia nos processos fisiológicos e na fisiopatologia requer mais estudos. Portanto, sua caracterização transcricional, metabólica e funcional em diferentes condições é de grande importância e requer seu isolamento, uma vez que estudos in situ são apropriados para localização de DNA, RNA e proteínas e comparações qualitativas, bem como caracterização morfológica da microglia.
Existem várias técnicas descritas para o isolamento da microglia, entre as quais estão o método do gradiente de Percoll7, a classificação de células por citometria de fluxo (FACS) 8 e a classificação de células ativadas magneticamente (MACS). A seleção do método apropriado depende dos objetivos do estudo e do nível de pureza necessário para aplicações a jusante. O isolamento da microglia pura do cérebro de camundongos adultos, especialmente de pequenas estruturas cerebrais como o hipotálamo, é um desafio devido ao número limitado de células microgliais. A dissociação suave automatizada do hipotálamo usando a tecnologia Miltenyi permite a purificação de um rendimento relativamente alto da microglia em um curto espaço de tempo com a capacidade de processar até oito amostras ao mesmo tempo com um gentleMACS Octo Dissociator.
A homogeneização do tecido é seguida pela purificação da microglia usando a tecnologia baseada em coluna MACS e os grânulos CD11b + de tamanho nanomagnético supermagnético. Portanto, todas as amostras são processadas exatamente da mesma maneira, produzindo células CD11b + intactas. Vale ressaltar que o CD11b não está presente exclusivamente na microglia, mas também é expresso em outras células da linhagem mieloide, incluindo macrófagos e monócitos9. Para limitar isso, a perfusão cerebral com solução salina gelada antes da extração do hipotálamo (consulte a etapa 2.6 do protocolo) garante a eliminação da maioria das células mieloides, deixando apenas uma fração potencialmente pequena de macrófagos residentes ou aderidos aos vasos sanguíneos. Os macrófagos e monócitos residentes de um SNC saudável em estado estacionário constituem uma pequena porcentagem do total de células imunes cerebrais (~ 10% e <2%, respectivamente) 10 , 11 . Portanto, quando as células cerebrais são classificadas com esferas CD11b +, tanto a microglia quanto os macrófagos podem ser isolados, embora a grande maioria seja microglia.
O rendimento final da microglia e a manutenção de sua viabilidade nos permitem realizar ensaios ex vivo, bem como in vitro, com a vantagem de analisar regiões cerebrais específicas de interesse. As evidências mais recentes mostraram que a população de micróglias é altamente heterogênea, representando a expressão gênica específica da região e características morfológicas e função 2,12,13. Portanto, o protocolo atual visa isolar e analisar a micróglia adulta de maneira específica da região. De fato, podemos caracterizar os perfis genéticos, transcricionais e translacionais da microglia hipotalâmica adulta usando métodos como RT-qPCR e sequenciamento de RNA, bem como realizando análises funcionais in vitro.

<table><tbody><tr><td>Kit de Dissociação Cerebral Adulto</td><td>Miltenyi</td><td>130-107-677</td><td>O kit contém tampão Z, tampão Y, enzimas A e P, Solução de Remoção de Detritos, tampão A (para dissolver a enzima A).</td></tr><tr><td>Albumina Bovina FrV BSA</td><td>EuroMedex</td><td>04-100-812-C</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) MicroBeads, humano e camundongo - tamanho pequeno</td> Kit de Ensaio de Citometria de Fluxo Verde <td>Miltenyi</td><td>130-093-636</td><td></td></tr><tr><td>CellROX</td> Tubo de Centrífuga <td>Invitrogen</td><td>C10492</td><td></td></tr><tr><td>, Tampa Snap-Pop 15 mL</td><td>CellTreat</td><td>978449</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, cálcio, magnésio, glicose, piruvato</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator com Aquecedores</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, sem EDTA (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), cálcio, magnésio, sem fenol vermelho</td><td>Thermofisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>contas de látex, poliestireno modificado com carboxilato, vermelho fluorescente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&nbsp; 480 SYBR Verde I Master</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4707516001</td><td>Este reagente foi usado para realizar PCR.&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &micro; m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA</td><td>Thermofisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Extração de Mamíferos M-PER</td><td>Thermofisher</td><td>78503</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td>Referidas como pequenas colunas no protocolo.&nbsp;</td></tr><tr><td>Separador MultiMACS Cell24 Plus</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-637</td><td></td></tr><tr><td>PBSS, pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quanta biosciences</td><td>733-1177</td><td>O kit foi usado para sintetizar o cDNA.</td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td>O kit contém 1-tioglicerol e tampão BL (referido como tampão de lise no protocolo) e foi usado para isolar o RNA total.</td></tr><tr><td>Aspirador de segurança 21 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367282</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting

A microglia, como macrófagos residentes do cérebro, é essencial para manter a homeostase cerebral. Eles moldam os circuitos neuronais durante o desenvolvimento, pesquisam seu ambiente em busca de detritos ou células mortas, bem como respondem a infecções e lesões no cérebro, entre muitas outras funções. No entanto, seu importante papel no neurodesenvolvimento e na plasticidade e fisiopatologia sináptica não foi totalmente definido, destacando a necessidade de mais investigações. Para obter uma compreensão mais abrangente do papel da microglia nesses processos, precisamos isolar a microglia e caracterizá-la geneticamente, metabolicamente e funcionalmente. No entanto, o isolamento da microglia de camundongos adultos, especialmente de pequenas estruturas cerebrais, é um desafio, pois eles representam uma pequena porcentagem do total de células cerebrais, e o rendimento da microglia isolada costuma ser muito baixo. Aqui, o isolamento magnético da microglia usando microesferas CD11b + nos permite classificar as células microgliais do hipotálamo de um cérebro de camundongo adulto recém-perfundido. O método atual nos permite alcançar pureza e rendimento relativamente altos em um curto período, mantendo a viabilidade celular.

A avaliação do rendimento final depende do nível de pureza e da quantidade de células isoladas e pode ser determinada por RT-qPCR, contagem de células e quantificação de proteínas. A pureza das células magnéticas isoladas do hipotálamo foi confirmada pela análise da expressão gênica de CD11b, C1qa, Gad1 e GFAP com RT-qPCR (Figura 1). CD11b e C1qa são predominantemente expressos pela micróglia em um estado estacionário do SNC16 e Gad1 e GFAP servem como marcadores neuronais e astrocíticos, respectivamente. O cDNA total de um hipotálamo variou de 55 a 98 ng. Ressalta-se que apenas a fração positiva exibiu expressão de CD11b e C1qa, indicando a ausência de qualquer perda potencial de células microgliais na fração negativa. Os primers são fornecidos na Tabela 2.
Além disso, os níveis menores dos marcadores neuronais e astrocíticos garantem que a grande maioria das células isoladas sejam microglia, uma vez que os macrófagos e monócitos residentes constituem apenas 10% da paisagem total de células imunes de um cérebro saudável10,11. Esses resultados comprovam a eficácia da seleção magnética e abrem caminho para a aplicação de RT-qPCR para avaliar os níveis de expressão de todos os genes de interesse em células microgliais hipotalâmicas recém-selecionadas. Da mesma forma, uma análise de RNAseq pode ser realizada em microglia classificada por hipotálamos para ter uma visão abrangente de seu transcriptoma.
A quantidade de células isoladas foi determinada pela contagem de células e foi encontrada em ~ 15.000 células por hipotálamo (mencionado na etapa 4.10 do protocolo). Além disso, a concentração de proteína na microglia classificada foi quantificada, revelando uma concentração média de 0,5 μg/μL em células CD11b+ isoladas de dois hipotálamos agrupados (Figura 2). Esse conhecimento permite que diferentes ensaios sejam realizados dependendo de um limite mínimo de proteína. Além disso, ao agrupar mais hipotálamo, uma concentração mais alta pode ser alcançada, expandindo o escopo de análises potenciais. As proteínas extraídas da microglia hipotalâmica facilitam diversas técnicas, incluindo imunoensaios AlphaLISA e ensaios de atividade de quinase.
Além disso, o protocolo descrito permite aos pesquisadores realizar várias análises ex vivo , permitindo a exploração da atividade microglial e seu papel no hipotálamo em contextos fisiológicos e patológicos. A quantificação da produção de ROS representa um aspecto crucial da resposta imune microglial17. Portanto, após a separação, a microglia pode ser tratada com reagentes disponíveis comercialmente que permitem a detecção de ROS em células vivas, exibindo um sinal fluorescente aumentado após a oxidação. A microglia isolada magneticamente de três hipotálamos agrupados é suficiente para detectar ROS por FACS, conforme mostrado na Figura 3A, embora nossos resultados mostrem uma variabilidade bastante alta da produção de ROS celular entre as condições que analisamos. Vale ressaltar que, com o kit comercial acima mencionado (ver Tabela de Materiais), também pudemos avaliar a viabilidade de células Cd11b+ classificadas, graças a uma coloração de células mortas impermeabilizadas por células que exibe um aumento na fluorescência ao se ligar ao DNA. Especificamente, nossos dados mostram que 99% das células estão vivas (Figura 3B). Estratégias de gating foram usadas para distinguir entre células vivas e mortas, bem como células oxidativamente estressadas e não estressadas, com base em suas propriedades de fluorescência.
Outra característica principal da atividade microglial é a fagocitose, um processo dinâmico e rigidamente regulado que desempenha um papel fundamental na vigilância imunológica, no reparo tecidual e na homeostase geral do sistema nervoso central18. Notavelmente, células Cd11b+ classificadas com esferas acopladas magnéticas podem ser cultivadas por 24 h e depois incubadas com microesferas de látex fluorescentes em diferentes momentos para avaliar, seja por FACS ou por microscopia de fluorescência, alterações na atividade fagocítica sob diferentes condições. A microglia recém-selecionada também pode ser exposta a esferas fluorescentes ou a qualquer tipo de partículas acopladas a pHrodo (por exemplo, sinaptossomos) diretamente dentro do tubo, e a fagocitose pode ser avaliada por análise FACS.
Especificamente, incubamos diretamente no tubo contendo suspensão de células classificadas, microglia isolada de dois hipotálamos agrupados ou um cérebro inteiro com esferas de látex fluorescentes. A microglia que fagocitou pelo menos um grânulo fluorescente pode ser distinguida das células não fagocíticas por citometria de fluxo, uma vez que a microglia fagocítica exibirá uma fluorescência aumentada. Controles negativos, não incubados com contas, foram usados para gating. Em ambas as condições experimentais (camundongos alimentados com ração versus dieta rica em gordura (HFD)), observamos uma porcentagem muito baixa de micróglia fagocítica (Figura 4A). No entanto, esse resultado é mostrado aqui para demonstrar a eficácia desse método, que, notavelmente, permite também diferenciar entre células que falsificaram 1 grânulos, 2 grânulos, 3 grânulos e assim por diante (Figura 4B). Finalmente, todas as abordagens ômicas podem ser aplicadas à microglia hipotalâmica isolada. Sugerimos agrupar três hipotálamos para ter células suficientes para realizar esses ensaios.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig01.jpg"> Figura 1: Avaliação da pureza das células CD11b+ por RT-qPCR. Quantificação em células selecionadas da expressão de mRNA da integrina CD11b, subcomponente do complemento C1q, subunidade A C1q, ácido glutâmico descarboxilase Gad1 e proteína glial fibrilar ácida GFAP normalizada nos níveis de mRNA dos genes de manutenção Eef1a1 e Sdha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig02.jpg"> Figura 2: Quantificação de proteínas de células hipotalâmicas após a classificação celular. Quantificação da concentração de proteínas em células CD11b+ e CD11b- . As células CD11b+ e CD11b- foram lisadas em 20 μL de tampão de lise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig03.jpg"> Figura 3: Detecção de ROS em células vivas microgliais. Quantificação de (A) células oxidativamente estressadas e (B) células vivas em uma população de células Cd11b + classificadas, com gráficos de contorno FACS relativos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig04.jpg"> Figura 4: Quantificação da atividade fagocítica microglial. (A) Quantificação de células fagocíticas em células Cd11b + classificadas de dois hipotálamos ou um cérebro, com gráfico de contorno FACS relativo. (B) Porcentagem de células fagocíticas de acordo com o número de contas fagocitadas com gráfico de contorno FACS relativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Mistura enzimática 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Enzima A</td>
			<td>Tampão Y</td>
			<td>Enzima P</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solução de remoção de detritos</td>
			<td>Sobreposição D-PBS</td>
		</tr><tr><td>Estrutura de 15-100 mg</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Preparação da mistura de dissociação (os volumes referem-se a uma única amostra) e dos sobrepostores de gradiente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Genes</td>
			<td colspan="3">Proteína</td>
			<td colspan="3">Encaminhar</td>
			<td colspan="3">Inverter</td>
		</tr><tr><td>Itgam</td>
			<td colspan="3">Integrina alfa M (CD11b)</td>
			<td colspan="3">CTCATCACTGCTGGCCTATACAA</td>
			<td colspan="3">GCAGCTTCATTCATCATGTCCTT</td>
		</tr><tr><td>Sdha</td>
			<td colspan="3">Complexo de Succinato Desidrogenase Subunidade A de Flavoproteína</td>
			<td colspan="3">CCCTCTCATCATGGACATCAA</td>
			<td colspan="3">CAAGGTCTTGTCGATAACAGGT</td>
		</tr><tr><td>C1qa</td>
			<td colspan="3">Componente do complemento 1, subcomponente q, polipeptídeo alfa</td>
			<td colspan="3">CGAGGTGTGGATCGAAAAGG</td>
			<td colspan="3">GAAGATGCTGTCGGCTTCAGT</td>
		</tr><tr><td>Gad1</td>
			<td colspan="3">glutamato descarboxilase 1</td>
			<td colspan="3">GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAG</td>
			<td colspan="3">CTGGTCAGTATCGGAGGTCTT</td>
		</tr><tr><td>Gfap</td>
			<td colspan="3">proteína ácida fibrilar glial</td>
			<td colspan="3">AGGTCCGCTTCCTGGAACA</td>
			<td colspan="3">GGGCTCCTTGGCTCGAA</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Sequências de primers de RT-qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Classificação de células por citometria de fluxo (FACS)</td>
			<td>Classificação de células ativadas magneticamente (MACS)</td>
		</tr><tr><td>Anticorpos bioquímicos marcados com fluorescência</td>
			<td>Grânulos magnéticos conjugados a anticorpos</td>
		</tr><tr><td>Diferenciação além dos marcadores de superfície celular</td>
			<td>Diferenciação apenas de acordo com marcadores de superfície celular</td>
		</tr><tr><td>Rendimento inicial substancial</td>
			<td>Rendimento inicial modesto</td>
		</tr><tr><td>Mais lento que o MACS para manuseio simultâneo de muitas amostras</td>
			<td>Mais rápido que o FACS para manuseio simultâneo de muitas amostras</td>
		</tr><tr><td>Menos suave que o MACS</td>
			<td>Mais suave que o FACS</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Representação das características e limitações do FACS e do MACS

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Microglia, as the resident macrophages of the brain, are essential for maintaining brain homeostasis. They shape neuronal circuits during development, ...

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Neurociência

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