Name: Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a preparar um modelo de pancreatite aguda grave em camundongos C57BL/6J usando injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo. Este método não invasivo permite estudar alvos terapêuticos e mecanismos inflamatórios envolvendo HMGB1.

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Este estudo foi apoiado por Projetos de Pesquisa em Saúde e Ciências Médicas na cidade de Huainan (No. HNWJ2023005); Programa do Plano Municipal de Ciência e Tecnologia na Cidade de Huainan (No.2023151); Programa de Treinamento em Inovação e Empreendedorismo para Estudantes do Colégio Provincial de Anhui (nº S202310361254); O nono lote do "50 · Estrelas da Ciência e Tecnologia" na cidade de Huainan e no Projeto de Construção de Especialidades Clínicas Chave da Província de Anhui. Gostaríamos de expressar nossa gratidão ao Departamento de Laboratório do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui por fornecer os dados de teste relevantes.

Induzindo lesão pancreática em camundongos por meio de injeção intraperitoneal de drogas

<ol><li>Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+severe+acute+pancreatitis%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Management of severe acute pancreatitis: An update.</a> Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).</li>
<li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF11+ameliorates+severe+acute+pancreatitis+through+modulating+macrophage+M1+and+M2+polarization+by+targeting+the+TGFbetaR1%2FSMAD-2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway.</a> Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).</li>
<li>Zhang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+method+of+an+ideal+model+of+multiple+organ+injury+of+rat+with+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).</li>
<li>Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+regenerating+protein+%28reg+I%29+and+reg+I+receptor+mRNA+are+upregulated+in+rat+pancreas+after+induction+of+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).</li>
<li>Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+molecular+weight+heparin+on+pancreatic+micro-circulation+in+severe+acute+pancreatitis+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model.</a> Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).</li>
<li>Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemorrhagic+pancreatitis+%28massive+necrosis%29+with+fat+necrosis+induced+in+mice+by+DL-ethionine+fed+with+a+choline-deficient+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet.</a> Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+XIAP+reduces+the+severity+of+acute+pancreatitis+via+regulation+of+cell+death+and+nuclear+factor-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity.</a> Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+Protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPP4+inhibitor+attenuates+severe+acute+pancreatitis-associated+intestinal+inflammation+via+Nrf2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling.</a> Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+protects+severe+acute+pancreatitis+by+inhibiting+HMGB-1+active+secretion+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages.</a> Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sitagliptin+activates+the+p62-Keap1-Nrf2+signalling+pathway+to+alleviate+oxidative+stress+and+excessive+autophagy+in+severe+acute+pancreatitis-related+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Schmidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+better+model+of+acute+pancreatitis+for+evaluating+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.</a> Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+paracentesis+drainage+attenuates+severe+acute+pancreatitis+by+enhancing+cell+apoptosis+via+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway.</a> Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).</li>
<li>Fontaine, D. A., Davis, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attention+to+background+strain+is+essential+for+metabolic+research%3A+C57BL%2F6+and+the+international+knockout+mouse+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium.</a> Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+CHRM3+activation+causes+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice.</a> JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).</li>
<li>Sah, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerulein-induced+chronic+pancreatitis+does+not+require+intra-acinar+activation+of+trypsinogen+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice.</a> Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+AMPK+ameliorates+acute+severe+pancreatitis+by+suppressing+pancreatic+acinar+cell+necroptosis+in+obese+mice+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models.</a> Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).</li>
<li>Jin, C., Li, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+severe+acute+pancreatitis+model+in+mice+induced+by+combined+Rain+Frog+Peptide+and+lipopolysaccharide+and+exploration+of+its+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Exp+Bio+Sinica%22%5BJournal%5D)">Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism.</a> Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Roy, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Ubap2+deletion+regulates+glucose+tolerance%2C+inflammation%2C+and+protection+from+Caerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis.</a> Cancer Lett. 578, 216455(2023).</li>
<li>Chen, R., Kang, R., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+HMGB1+secretion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mechanism of HMGB1 secretion and release.</a> Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).</li>
<li>Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+mechanisms+of+major+DAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Release mechanisms of major DAMPs.</a> Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+circulating+histones+in+predicting+persistent+organ+failure+and+mortality+in+patients+with+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis.</a> Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).</li>
<li>Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+high+mobility+Group+Box+1+and+Interleukin-6+levels+in+acute+pancreatitis%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis.</a> J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Atualmente, faltam meios eficazes para melhorar a alta taxa de mortalidade em pacientes com pancreatite aguda grave. É crucial investigar a eficácia dos medicamentos no aumento dos mecanismos de estabilidade imunológica. Existe uma necessidade urgente de um modelo animal ideal para pancreatite aguda grave. Camundongos com histórico genético C57BL/6J são amplamente utilizados em pesquisas biomédicas, incluindo estudos sobre fisiopatologia SAP. Mais de 70 anos de diferenciação genética em camundongos B6J resultaram na deleção espontânea de vários éxons15, levando à redução da sensibilidade à lesão pancreática induzida por Caeruleína16. Além disso, os modelos animais existentes de pancreatite aguda apresentam limitações como trauma cirúrgico ou aplicabilidade apenas em animais maiores, o que dificulta as investigações científicas utilizando esses modelos. Portanto, é altamente valioso estabelecer um modelo animal estável, eficiente e conveniente usando essa cepa genética específica.
A ceruleína é um análogo da colecistocinina que induz danos ao tecido pancreático, causando obstrução relativa do fluido digestivo pancreático e da secreção enzimática por meio de injeções de alta frequência em um curto período quando os camundongos jejuaram e armazenaram quantidades suficientes de fluido digestivo17. O LPS é o principal componente encontrado nas paredes celulares bacterianas e pode causar MODS e SIRS em camundongos18. Um estudo anterior demonstrou que a combinação de injeções de caeruleína em diferentes frequências com doses variadas de LPS administradas por injeção intraperitoneal induziu alterações patológicas semelhantes às observadas na PAS humana19,20. Este estudo usou uma abordagem não invasiva para induzir vários graus de lesão pancreática, combinando diferentes frequências de injeções de ceruleína com diferentes doses de LPS administradas por via intraperitoneal em camundongos. Garantir a absorção uniforme pelo peritônio foi crucial durante o desenvolvimento do protocolo. Para cumprir esse requisito, é crucial seguir rigorosamente as etapas da injeção intraperitoneal para garantir um controle preciso sobre a administração de cada medicamento. Além disso, a fricção suave e a aplicação de pressão adequada no local da injeção com um cotonete estéril após cada injeção de medicamento são essenciais para a distribuição uniforme do medicamento por toda a cavidade peritoneal. Além disso, a colocação exata e precisa da cabeça do alfinete na cavidade peritoneal, com a agulha apontando para a área central do abdome superior, é de extrema importância. Deve ser realizado um treino prévio para permitir que os operadores percebam com precisão qualquer ausência de resistência ao inserir a agulha na cavidade abdominal. A utilização de uma bomba de infusão microquantitativa em vez da operação manual pode potencialmente melhorar a qualidade da injeção de medicamentos; Infelizmente, isso não foi implementado neste estudo. No entanto, empregando diferentes esquemas de injeção, induzimos vários graus de lesão pancreática e observamos efetivamente diferenças na lesão pancreática causada por diferentes frequências e doses sob condições técnicas idênticas induzidas por Caerulein combinada com injeções de LPS. Isso fornece informações valiosas para o uso futuro de Caerulein em modelos animais não invasivos para indução de pancreatite aguda grave.
A combinação de ceruleína e LPS resultou em níveis séricos significativamente elevados de amilase e lipase, aumento do peso pancreático e alterações histológicas, incluindo infiltração extensa de células inflamatórias, edema de células acinares pancreáticas, necrose e hemorragia, conforme demonstrado pela coloração de hematoxilina e eosina (HE). Além disso, com uma dose crescente de LPS, as alterações patológicas no pâncreas tornaram-se mais pronunciadas. No entanto, vale ressaltar que não houve diferenças perceptíveis nos escores de patologia pancreática entre os grupos PI IV e PI V, enquanto a extensão da necrose das células do tecido pancreático foi mais pronunciada no grupo PI III em comparação com o grupo PI IV. Essa observação sugere que a frequência de dosagem de ceruleína pode servir como um fator primário que contribui para a lesão pancreática, enquanto o LPS exacerba sua progressão, levando a danos inflamatórios sistêmicos18,21. HMGB-1 é uma proteína que funciona dependendo de sua localização22. O HMGB-1 extracelular atua como uma proteína envolvida nos sinais de alerta da inflamação e está intimamente associado à gravidade da pancreatite aguda 23,24,25. Neste estudo, os níveis séricos de HMGB-1 em camundongos de todos os grupos experimentais foram significativamente maiores em comparação com o grupo controle, com o grupo PI V apresentando o aumento mais significativo. Experimentos imuno-histoquímicos e de eletroforese de proteínas também confirmaram a alta expressão de HMGB-1 no tecido pancreático. Esta importante proteína pode servir como alvo terapêutico para inibir a tempestade inflamatória na pancreatite aguda grave.
Em resumo, é crucial desenvolver um modelo não invasivo, simples e de fácil execução de SAP em camundongos. Neste protocolo experimental, a indução de lesão pancreática usando Caeruleína combinada com LPS é confiável e eficaz. Ao administrar Caerulein por via intraperitoneal por dez dias consecutivos na dose de 50 μg/kg, seguida por uma única injeção intraperitoneal de 15 mg/kg de LPS, um modelo animal estável, confiável, econômico e eficiente de SAP pode ser estabelecido.

A pancreatite aguda grave é caracterizada por início rápido, progressão rápida e altas taxas de mortalidade no domínio1 da doença do sistema digestivo. Sua alta taxa de mortalidade sempre foi um foco proeminente da pesquisa clínica. Devido a mudanças imprevisíveis nas condições clínicas, heterogeneidade das manifestações da doença e disponibilidade limitada de espécimes humanos, o estabelecimento de modelos animais tornou-se cada vez mais crucial para a pesquisa de doenças.
A injeção retrógrada de taurocolato de sódio no ducto colédoco comum é comumente usada para criar um modelo de SAP2 em ratos. Ao simular a obstrução pancreatobiliar e induzir o refluxo da bile e do líquido pancreático, essa técnica de modelagem exibe uma alta taxa de sucesso na replicação de modelos animais SAP. No entanto, deve-se notar que a cirurgia invasiva tem impacto no próprio modelo animal. Além disso, este método é limitado a animais maiores, como ratos e cães, que são usados principalmente como sujeitos experimentais. Técnicas alternativas, incluindo intubação duodenal3, punção duodenal direta4 e punção direta do ducto biliar-ducto pancreático5, são frequentemente utilizadas para fins de modelagem.
Os métodos de injeção intraperitoneal e modelagem dietética oferecem vantagens não invasivas que podem ser aplicadas a animais de qualquer tamanho. O modelo de camundongo de SAP induzido pela alimentação com etionina deficiente em colina (CDE)6 apresenta algumas complicações, como hiperglicemia e hipocalcemia pouco controláveis, tornando-o inadequado para avaliar novas abordagens diagnósticas e terapêuticas. Por outro lado, a injeção intraperitoneal de Caerulein combinada com L-arginina7 representa o método mais comumente empregado para induzir pancreatite aguda em camundongos. Especificamente, a administração intraperitoneal repetida de Caeruleína - um análogo da colecistocinina - fornece uma abordagem altamente adequada para investigar vários aspectos relacionados a essa doença destrutiva, incluindo patogênese, inflamação e processos de regeneração. Devido à sua semelhança estrutural com a colecistocinina (CCK), a ceruleína estimula efetivamente a contração da vesícula biliar e a secreção enzimática pancreática, levando a um desequilíbrio na secreção enzimática seguido de subsequente autodestruição8. O lipopolissacarídeo (LPS), sendo onipresente e extensivamente estudado como uma molécula de padrão molecular associada a patógenos, pode ser combinado com Caeruleína via injeção intraperitoneal para estabelecer um modelo eficaz de SAP em camundongos. Essa combinação desencadeia e libera rapidamente um número significativo de citocinas inflamatórias, resultando em inflamação local e sistêmica excessiva. Vários estudos relataram a indução de modelos SAP em camundongos por meio da injeção intraperitoneal de Caeruleína combinada com LPS. Isso pode ser atribuído ao fato de que a injeção intraperitoneal de ceruleína pode causar edema pancreático e hemorragia em camundongos, enquanto a adição de LPS pode induzir imediatamente necrose pancreática e exacerbar a resposta inflamatória sistêmica, sepse e até falência de órgãos. Atualmente, há variação na dosagem e frequência de injeções intraperitoneais de caeruleína, bem como inconsistência na dosagem adicional de LPS. Alcançar consistência em modelos SAP de mouse é um desafio 9,10,11,12; Portanto, é necessário estabelecer um protocolo padronizado para a obtenção de um modelo ideal. Neste artigo, descrevemos um protocolo para injeção intraperitoneal em camundongos e investigamos a frequência ideal de injeção e dosagem adicional de LPS.

<table><tbody><tr><td>20 vezes; Solução de reparo de antígeno de ácido cítrico (pH 6,0)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China</td><td>G1202-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Amilase</td><td>Mindray,China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anexina V-FITC/PI</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China</td><td>&nbsp; G1511</td><td>&nbsp; diluído a 1:20</td></tr><tr><td>Anti-HMGB1 Rabbit pAB</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China</td><td>GB11103</td><td>&nbsp; diluído a 1:1800</td></tr><tr><td>Kit de detecção quantitativa de proteína BCA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China</td><td>G2026-200T</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Citômetro de Fluxo</td><td>BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, EUA</td><td>BD FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>GC305010-100g</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China</td><td></td><td>número de licença SCXY (Su) 2011- 0003</td></tr><tr><td>Ceruletide</td><td>&nbsp; MCE, Nova Jérsia, EUA</td><td>17650-98-5&nbsp;</td><td>50 &micro; g/kg</td></tr><tr><td>de gerador de imagens de quimioluminescência</td><td>Cytiva CO., LTD.; Solução de</td> reparo de antígeno de ácido cítrico dos EUA <td></td><td></td></tr><tr><td>(pó seco pH 6.0)</td> <td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1201-5 L</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>&nbsp; GC305014</td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>DAB (SA-HRP) Kit de detecção de apoptose de células de túnel</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1507-100 T</td><td></td></tr><tr><td>Dimensão EXL com sistema de química integrado LM</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield, EUA</td><td>YZB/EUA 8311-2014</td><td></td></tr><tr><td>ECL desenvolvedor</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corante de eosina (solúvel em álcool)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China</td><td>G1001-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>&nbsp; Noldus, Holanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra com etiqueta FITC</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China</td><td>GB22303</td><td>&nbsp; diluído a 1:50</td></tr><tr><td>Analisador de células sanguíneas totalmente automático</td><td>Zybio Inc. China</td><td>&nbsp; Zybio-Z3 CRP</td><td></td></tr><tr><td>GapDH</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>GB11103</td> <td>diluído a 1:1500</td></tr><tr><td>Solução de retorno de azul de hematoxilina</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1040-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Solução de diferenciação de hematoxilina</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1039-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Corante de hematoxilina</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1004-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>HMGB-1 ELISA kits</td><td>njjcbio Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENEIZADOR</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>KZ-III-F; </td><td></td>IC111150 100222</tr><tr><td>IgG de cabra anti-coelho com marcação HRP</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>GB23303</td><td>&nbsp; diluído a 1:1500</td></tr><tr><td>IL-6 ELISA kits</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>GEM0001</td><td></td></tr><tr><td>Lipase&nbsp;</td><td>Mindray,China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo&nbsp;</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>GC205009</td><td>15 mg / kg</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade de baixa temperatura</td><td>Changsha Pingfan Apparatus& Instrumento Co., Ltd., China</td><td>TGL-20M</td><td></td></tr><tr><td>Membrana que quebra o líquido</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo</td><td>Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; China</td><td>CR-601ST</td><td></td></tr><tr><td>Malha de nylon</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td>Kit de</td></tr><tr><td>detecção de apoptose de células TUNEL de uma etapa de malha 200 (método de coloração DAB)</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G1507-100T</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de inclusão de tecido de parafina</td><td>INSTRUMENTOS MÉDICOS DE PRECISÃO CO., LTD; Changzhou, China</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de secagem de tecidos patológicos</td><td>INSTRUMENTOS MÉDICOS DE PRECISÃO CO., LTD; Changzhou, China</td><td>PHY-III</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato-tamponado solução salina</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G4202-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G2008-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência positiva</td><td>Olympus Corporation, Tóquio, Japão</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Pro Calcitonina</td><td>Mindray, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>membrana de PVDF</td><td>Millipore, EUA</td><td></td><td>0,22 &micro; m</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>G2002-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Beyotime Biotechnology, China</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; Kits ELISA</td><td>Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, China</td><td>GEM0004</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria ultrassônico</td><td>DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; China</td><td>KQ-200KDE</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.,EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem Western blot</td><td>Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPÃO</td><td>Amersham ImageQuant 800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de hidromassagem</td><td>SCILOGEX; EUA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

O tratamento da pancreatite aguda grave (PAS), com altas taxas de mortalidade, representa um desafio clínico significativo. Investigar as alterações patológicas associadas à SAP usando modelos animais pode ajudar a identificar potenciais alvos terapêuticos e explorar novas abordagens de tratamento. Estudos anteriores induziram principalmente lesão pancreática por meio da injeção retrógrada do ducto biliar de taviaurocolato de sódio, mas o impacto do dano cirúrgico na qualidade do modelo animal permanece obscuro. Neste estudo, empregamos várias frequências de injeções intraperitoneais de caeruleína combinadas com diferentes doses de LPS para induzir lesão pancreática em camundongos C57BL / 6J e comparamos a extensão da lesão em cinco protocolos de injeção intraperitoneal. Em relação à indução de pancreatite aguda em camundongos, é proposto um protocolo de injeção intraperitoneal que resulta em uma taxa de mortalidade de até 80% em 5 dias. Especificamente, os camundongos receberam dez injeções intraperitoneais diárias de Caerulein (50 μg / kg), seguidas por uma injeção de LPS (15 mg / kg) uma hora após a última administração de Caerulein. Ao ajustar a frequência e a dosagem dos medicamentos injetados, pode-se manipular a gravidade da lesão pancreática de forma eficaz. Este modelo apresenta forte controlabilidade e tem um ciclo de replicação curto, tornando-o viável para conclusão por um único pesquisador sem a necessidade de equipamentos caros. Ele simula de forma conveniente e precisa as principais características da doença observadas na SAP humana, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade.

O processo de modelagem experimental de camundongos é ilustrado na Figura 1. Após 12 h do término da injeção, um gravador de vídeo de campo aberto foi usado para monitorar a distância de movimento e a duração da imobilidade de diferentes grupos experimentais de camundongos por 5 ciclos (Figura 2A). Durante os 5 ciclos, os camundongos do grupo PI V mantiveram um baixo nível de distância de movimento em 3 minutos, enquanto a taxa de imobilidade em 3 minutos aumentou a cada ciclo subsequente ( Figura 2B , C ). Além disso, foi realizada análise estatística da distância total de movimento de camundongos de diferentes grupos experimentais durante os 5 ciclos. O grupo PI V apresentou a menor distância total de movimento em comparação com os outros grupos experimentais, e a diferença foi estatisticamente significativa (p &lt; 0,001) (Figura 2D,E). Com exceção do grupo controle e do grupo PI I, os camundongos dos outros grupos experimentais exibiram crescimento negativo no peso do valor D. Dentre eles, o grupo PI V apresentou a maior mudança de peso, e a diferença na mudança de peso em relação aos demais grupos experimentais foi estatisticamente significativa (Figura 2F). Após avaliar a taxa de sobrevivência de mais 10 camundongos em cada grupo experimental, os resultados mostraram que a taxa de mortalidade dos camundongos do grupo PI V atingiu 80% no5º dia. No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa na taxa de mortalidade entre os outros quatro grupos experimentais e os camundongos do grupo controle (Figura 2G).
Usando um microscópio de alta potência, inchaço celular significativo, necrose e infiltração de células inflamatórias foram observados nos grupos PI IV e PI V de camundongos (Figura 3A, B). Usando os critérios de classificação fornecidos na Tabela Suplementar 2, a patologia pancreática de diferentes grupos experimentais de camundongos foi avaliada e observadas diferenças significativas no escore de patologia pancreática em comparação com os camundongos do grupo controle (p &lt; 0,001) (Figura 3C; Figura Suplementar 1). Além disso, em comparação com o grupo controle, os níveis séricos de amilase e lipase nos camundongos medidos foram significativamente maiores nos grupos experimentais PI II a PI V, e as diferenças foram estatisticamente significativas. Curiosamente, não houve diferença estatisticamente significativa nos camundongos do grupo PI I (Figura 3D, E). O método ELISA foi empregado para avaliar os níveis de marcadores inflamatórios14, incluindo TNF-α e IL-6, no soro de camundongos. Os achados revelaram que os níveis de TNF-α e IL-6 nos camundongos do grupo PI V foram significativamente maiores do que nos outros grupos experimentais, e as diferenças foram estatisticamente significativas (Figura 3F, G). Em comparação com o grupo controle, os níveis de PCT aumentaram em todos os quatro grupos experimentais, mas apenas a diferença no grupo PI V foi estatisticamente significativa (p &lt; 0,05) (Figura 3H).
Estado apoptótico dos tecidos pancreáticos em diferentes grupos experimentais de camundongos Ao realizar a coloração TUNEL nos tecidos pancreáticos de cada grupo de camundongos, foi observado o estado de necrose celular nos tecidos pancreáticos de diferentes grupos experimentais (Figura 4A). Os valores da escala de cinza (DO) por unidade de área de cortes de tecido pancreático e a taxa positiva de necrose celular foram analisados semiquantitativamente usando o software Image J. Os resultados mostraram que, em comparação com os outros grupos experimentais, o nível de necrose celular nos tecidos pancreáticos do grupo PI V de camundongos aumentou significativamente, e a diferença foi estatisticamente significativa (p &lt; 0,001) (Figura 4B,C). Experimentos de immunoblotting de proteínas foram realizados para avaliar os níveis de expressão da proteinase-3 específica do aspartato de cisteínil (Caspase-3), um marcador de necrose celular, nos tecidos pancreáticos de camundongos de diferentes grupos experimentais (Figura 4D). A quantificação da expressão da caspase-3 mostrou que o nível de expressão da proteína caspase-3 nos tecidos pancreáticos do grupo PI V foi significativamente aumentado, e a diferença foi estatisticamente significativa (p &lt; 0,001). Os níveis de expressão proteica foram quantificados e normalizados para o controle interno GapDH (Figura 4E). Além disso, suspensões frescas de células acinares pancreáticas foram marcadas com Anexina V-FITC/PI e analisadas por citometria de fluxo. Verificou-se que, em comparação com os outros grupos experimentais de camundongos, o grupo PI V apresentou uma taxa positiva significativamente maior de morte celular, que foi estatisticamente significativa (p &lt; 0,001) (Figura 4F,G).
O conteúdo de HMGB-1 no soro periférico e o nível de expressão de HMGB-1 no tecido pancreático A fim de investigar a relação entre a proteína HMGB-1 e a lesão pancreática, foram realizadas colorações imuno-histoquímicas e quantificação nos tecidos pancreáticos de camundongos em cada grupo experimental. Houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos experimental e controle (p &lt; 0,001) (Figura 5A,B). O ELISA foi utilizado para medir os níveis de HMGB-1 no soro de camundongos de diferentes grupos experimentais. Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo controle, os níveis séricos de HMGB-1 foram significativamente maiores em todos os grupos experimentais, com o maior nível observado no grupo PI V, e a diferença foi estatisticamente significativa (p &lt; 0,001) (Figura 5C). Além disso, a análise de Western blot detectou expressão elevada da proteína HMGB-1 nos tecidos pancreáticos de camundongos em todos os grupos experimentais, com diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo controle (p &lt; 0,001) (Figura 5D,E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma experimental. Dia 2 e Dia 3: Injeção intraperitoneal. Dia 4: O experimento de campo aberto foi iniciado após 12 h da última injeção intraperitoneal. Dia 5: Eutanasiado 36 h após a injeção intraperitoneal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig02v2.jpg"> Figura 2: Mudanças macroscópicas no modelo de camundongos PI. (A) O gráfico de trajetória de movimento em tempo real de camundongos é representado. (B) A distância total de movimento dentro de cada período de monitoramento para diferentes grupos experimentais de camundongos. (C) A porcentagem de tempo de imobilidade dentro de cada período de monitoramento para diferentes grupos experimentais de camundongos. (D, E) A distância total de movimento e a porcentagem de tempo de imobilidade durante 15 min foram analisadas para camundongos em diferentes grupos experimentais. (F) O valor D que representa o peso dos camundongos antes e depois do processo de modelagem é mostrado. (G) A sobrevivência de 10 camundongos em cada grupo foi observada nos 7 dias seguintes à injeção intraperitoneal. Os dados são expressos como médias ± EPM, n = 4. "ns" denota não significativo, *P &lt; 0,05, ****P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig03.jpg"> Figura 3: Alterações patológicas na pancreatite de camundongos entre diferentes grupos experimentais. (A) As seções histológicas coradas com H &amp; E do tecido pancreático de camundongos em diferentes grupos experimentais (seções de tecido pancreático embebidas em parafina coradas com hematoxilina e eosina, ampliações de 100 vezes e barras de escala de 200 μm e barras de escala de 400 vezes e barras de escala de 50 μm, respectivamente. Setas longas amarelas indicam ilhotas; setas longas vermelhas indicam células acinares; setas longas marrons indicam vasos sanguíneos; setas longas azuis indicam dutos). (B) Cálculo da relação entre o peso pancreático e o peso corporal em camundongos. (C) Pontuação patológica do pâncreas de camundongos. (D, E) Detecção dos níveis séricos de amilase e lipase em camundongos. (F-G) Medição ELISA dos níveis séricos de TNF-α e IL-6 em camundongos. (H) Avaliação do nível PCT. Os dados são expressos como médias ± EPM, n = 4. "ns" denota não significativo, *P &lt; 0,05, ****P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig04.jpg"> Figura 4: Apoptose do tecido pancreático em camundongos. (A) Imagens representativas da coloração TUNEL foram obtidas a partir de seções de parafina pancreática de camundongos e imagens de área ampliada. (400x, barra de escala 50 μm, amarelo acastanhado são células positivas). (B, C) Análise quantitativa do valor da escala de cinza por unidade de área de seções coradas com TUNEL de tecido pancreático de camundongos e a porcentagem de células mortas coradas positivamente. (D) O nível de expressão de Caspase-3 no tecido pancreático foi detectado por Western blot. (E) Quantificação da expressão de Caspase-3 no tecido pancreático. (F) A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a extensão da morte celular em células acinares pancreáticas de camundongos. (G) Enumeração de células mortas em estágio avançado em células acinares pancreáticas de camundongo. Os dados são expressos como médias ± EPM, n = 4. "ns" denota não significativo, *P &lt; 0,05, ****P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig05.jpg"> Figura 5: A expressão de HMGB-1 no tecido pancreático de camundongos. (A) Imagens representativas e imagens ampliadas (x400, barra de escala de 50 μm) de coloração imuno-histoquímica de HMGB-1 em cortes pancreáticos. A cor amarelo-acastanhada indica células positivas (n = 4). (B) A porcentagem de células positivas para HMGB-1 em seções de tecido pancreático (n = 24). (C) O nível de HMGB-1 no soro de camundongo (n = 4). (D, E) Um Western blot foi realizado para detectar o nível de expressão de HMGB-1 no tecido pancreático e para obter os resultados da quantificação (n = 4). Os dados são expressos como médias ± EPM, "ns" denota não significativo, *P &lt; 0,05, ****P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Lesão de múltiplos órgãos no modelo de camundongos do grupo PI V. (A) Imagens representativas de alterações histológicas nos tecidos do pâncreas, pulmão, fígado e rim coletadas dos camundongos do grupo CON e PI V foram analisadas usando coloração H &amp; E (aumento de 200x, barra de escala de 50 μm). As alterações patológicas associadas à necrose das células acinares são indicadas por setas pretas. Setas amarelas indicam alterações patológicas caracterizadas por hemorragia intersticial e edema nos alvéolos. O edema e a necrose dos hepatócitos são denotados por setas verdes. As alterações patológicas relacionadas à hemorragia glomerular são marcadas por setas vermelhas. (B) O cálculo dos escores histológicos foi realizado nos tecidos do pâncreas, pulmão, fígado e rim obtidos dos camundongos do grupo CON e do grupo PI V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/supplementary%20FIG%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Protocolo de injeção intraperitoneal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Critérios de pontuação patológica para gravidade da pancreatite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

A administração intraperitoneal de medicamentos é uma abordagem não invasiva segura e eficaz para induzir lesão pancreática. Este estudo comparou cinco protocolos distintos de injeção intraperitoneal em camundongos para induzir graus variados de lesão pancreática e estabeleceu um modelo de lesão pancreática grave para investigar as alterações patológicas e estratégias de tratamento para pancreatite aguda grave (SAP).

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The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

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Immunology and Infection

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