Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo

O tratamento da pancreatite aguda grave é difícil devido às altas taxas de mortalidade usando modelos animais, especificamente camundongos com C57BL / 6J selecionado Estamos investigando o SAP como patológico para identificar alvos terapêuticos e desenvolver novos tratamentos, fornecendo o método polimico em uma pesquisa SAP.

Esta pesquisa descobriu alta expressão de genes HMGB1 lesionados pancreatite, sugerindo sua associação com o cálculo inflamatório da pancreatite aguda grave. Nosso protocolo envolve a ceruleína para induzir a contração da vesícula biliar e interromper o jejum em camundongos, levando a danos no tecido pancreático, bloqueando a secreção de fluido digestivo. Combinado com injeção de LPS, induzimos pancreatite grave com falência de órgãos em camundongos. Essa abordagem não é invasiva e fácil de implementar com ciclos curtos e alta repetibilidade.

[Demonstrador] Para começar, meça e registre o peso do camundongo experimental. Para injeção intraperitoneal de Caerulein, segure e segure o mouse com a barriga voltada para cima e a cabeça posicionada abaixo da cauda. Segure a seringa com a mão direita e insira a agulha na pele subcutânea no lado esquerdo da linha branca abdominal. Mova a agulha para frente aproximadamente três a cinco milímetros e insira-a na cavidade abdominal em um ângulo de 45 graus. Mantenha a agulha estacionária e injete lentamente a Caeruleína. Retire a agulha, massageie suavemente e pressione o local da injeção com um cotonete estéril para difundir totalmente o medicamento na cavidade abdominal. 12 horas após a injeção, coloque o mouse no meio da grade na caixa experimental, de costas para o experimentador. Ligue o software de rastreamento de vídeo e configure o monitoramento para quatro campos de visão simultâneos. Marque o comprimento e a largura do objeto experimental que pode se mover dentro da caixa na tela de monitoramento em tempo real. Registre a atividade do mouse por 15 minutos. As alterações macroscópicas medidas no modelo de camundongos com lesão pancreática durante os cinco ciclos demonstraram que os camundongos do Grupo 5 de Lesão Pancreática mantiveram um baixo nível de distância de movimento em três minutos, enquanto a taxa de imobilidade em três minutos aumentou a cada ciclo subsequente. O Grupo 5 apresentou a menor distância total de movimento em comparação com os outros grupos experimentais, e a diferença foi estatisticamente significativa. Com exceção do Grupo Controle e Lesão Pancreática 1, todos os grupos apresentaram crescimento ponderal negativo do valor D, sendo que o Grupo 5 Lesão Pancreática apresentou a maior alteração. A análise da taxa de sobrevida indicou uma taxa de mortalidade de 80% no Grupo 5 de Lesão Pancreática no quinto dia, ao contrário dos outros grupos que não apresentaram diferença significativa em relação ao Controle. Após 36 horas de injeção intraperitoneal de Caerulein, eutanasiar e prender o camundongo em decúbito dorsal em uma placa de espuma. Faça uma incisão mediana abdominal e vire o tubo do intestino delgado para a direita para expor o pâncreas. Desconecte o duodeno e o ducto pilórico. Localize o intestino delgado abaixo do pâncreas e, em seguida, libere totalmente o tecido pancreático ao longo do ducto intestinal. Usando uma pinça desdentada, prenda o baço e puxe suavemente para cima. Disseque nitidamente o tecido do ligamento pancreático posterior até a cabeça do pâncreas. Em seguida, desconecte o ducto biliar e os vasos sanguíneos. Remova o tecido pancreático da cavidade abdominal e seque a umidade da superfície com papel absorvente. Meça e registre o peso do tecido pancreático. Depois de preparar as seções de parafina, retire a cera dos tecidos pancreáticos duas vezes em xileno por cinco minutos cada. Trate cada seção com 100 microlitros de proteinase K e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Adicione a quantidade necessária de peróxido de hidrogênio a 3% ao tecido e incube por 20 minutos para infiltrá-lo totalmente. Cubra toda a área da amostra com 50 microlitros de tampão de equilíbrio e incube por 10 minutos. Em seguida, adicione 56 microlitros de tampão de incubação TDT a cada amostra de tecido e incube por uma hora. Lave as seções de tecido quatro vezes com PBS por cinco minutos cada antes de incubar por 30 minutos em 100 microlitros de solução de reação de estreptavidina-HRP. Para coloração DAB, adicione 50 microlitros de DAB a cada seção de tecido. Mergulhe as seções em solução de coloração de hematoxilina por três a cinco minutos antes de enxaguar com água pura. Desidratar as amostras com quatro voltas de etanol anidro fresco por cinco minutos cada. Realize um exame histológico sob um microscópio de luz branca. A coloração TUNEL nos tecidos pancreáticos de camundongos revelou um aumento na necrose celular no Grupo 5 de Lesão Pancreática, com valores de escala de cinza significativamente mais altos e taxas de necrose positivas em comparação com outros grupos. O immunoblotting de proteínas avaliou a expressão de Caspase-3, um marcador de necrose celular, e mostrou um aumento significativo nos tecidos do Grupo 5 de Lesão Pancreática. A citometria de fluxo de suspensões de células acinares pancreáticas, marcadas com um CPI de ajuste da Nexina 5, indicou uma taxa de mortalidade celular notavelmente maior no Grupo de Lesão Pancreática 5 em comparação com outros, com significância estatística.