Name: Monitorando a abertura da barreira hematoencefálica em ratos com um sistema de ultrassom focalizado pré-clínico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 32 s
Description: Aprenda a monitorar a abertura da barreira hematoencefálica em ratos utilizando ultrassom focalizado e ressonância magnética. Este protocolo permite controle preciso da infusão de microbolhas e entrega de agentes de contraste.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi parcialmente apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) Grant K99DE032397, UCSF Department Seed Grant (No. 7504831), UCSF RAP grant (PI: Kazim Narsinh, MD) e a Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, GA 3535/1-1).

Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, São Francisco (UCSF). Ratos machos da raça Sprague-Dawley (200-250 g) foram utilizados neste estudo. Os ratos foram alojados e cuidados de acordo com as Diretrizes de Uso e Cuidados com Animais do Escritório do National Institutes of Health em camundongos e ratos. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos animais
NOTA: Para os procedimentos internos, os animais foram transportados para a sala de preparo e os procedimentos foram conduzidos da seguinte forma:
<ol>
	<li>Coloque os ratos individualmente em uma câmara de Lucite e exponha o isoflurano (2%-3%) misturado com oxigênio extraído de um tanque de oxigênio medicinal até que fiquem inconscientes (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). 
	NOTA: A anestesia com isoflurano permite a implementação de um protocolo de ressonância magnética de longo prazo.</li>
	<li>Remova os ratos da câmara e raspe os pelos das áreas anterior e posterior do pescoço usando um creme depilatório.</li>
	<li>Aplique pomada lubrificante nos olhos.</li>
	<li>Coloque o nariz no cone do nariz para manter a anestesia com respiração espontânea (vaporizador de isoflurano entre 2%-2,5%, medidor de fluxo de oxigênio para 1-1,5 L/min).</li>
	<li>Coloque o rato anestesiado em uma mesa cirúrgica aquecida e confirme com uma pitada no dedo do pé. 
	NOTA: O protocolo de RM incluiu sequências com contraste, como imagem de eco gradiente ponderada em T1 e imagem de spin eco ponderada em T2. Essas sequências foram conduzidas antes e depois da injeção de agentes de contraste à base de gadolínio (GAD) para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Isso envolve a administração de agentes de contraste GAD enquanto o rato está em um scanner de ressonância magnética7. Para facilitar esse processo, foi utilizado um tubo de cateter que se estende do cateter canulado no rato. A extensão incluiu um conector de cateter e tubo de polietileno medindo 30 cm. Para garantir a permeabilidade e evitar vazamentos, o tubo de extensão foi lavado com glicerol heparinizado (250 UI de heparina/1 mL de glicerol).</li>
</ol>
2. Sistema de ultrassom focalizado guiado por estereotáxica
NOTA: Os animais foram transferidos e colocados em uma mesa em um sistema FUS estereotáxico. O nariz do rato foi colocado no cone do nariz para manter a anestesia. O sistema FUS compreende um gerador de funções, um amplificador de RF e um osciloscópio. Antes de configurar o transdutor, garantimos a conexão adequada de todos os dispositivos com o sistema. A configuração do transdutor foi concluída usando as seguintes etapas:
<ol>
	<li>Coloque um ponteiro afiado na posição do Bregma no crânio e salve a posição. A posição de Bregma pode ser identificada apontando a localização de 9,0 mm anterior a Lambda na linha média8. O Lambda pode ser encontrado no centro da linha entre tímpanos bilaterais9.</li>
	<li>Coloque gel de ultrassom na cabeça do rato, na bolsa de acoplamento de água e no transdutor (frequência de 1 MHz). Certifique-se de que não haja bolhas de ar entre a pele do rato, a bolsa de acoplamento de água e o transdutor.</li>
	<li>Conecte um cabo BNC coaxial do transdutor à entrada do módulo do sistema FUS.</li>
	<li>Em um computador de controle) Clique em carregar para imagens de ratos pré-registradas; Vários pontos focais e pressão acústica são escolhidos.</li>
	<li>Em um computador de controle) Clique no teste de movimento no módulo de tratamento para garantir que o transdutor possa mudar entre os pontos dentro de um período de ruptura.</li>
	<li>Configure os parâmetros de sonicação descritos na etapa 3.</li>
</ol>
3. Infusão e sonicação de microbolhas
<ol>
	<li>Ative o microbubble. 
	NOTA: A microbolha utilizada neste estudo foi caracterizada por um diâmetro de 1,7 μm e uma concentração de 0,2 × 109 partículas por mililitro10. O frasco de microbolhas foi ativado com base nas instruções de prescrição fornecidas pelo fornecedor e em um relatório publicado anteriormente11.
	<ol>
		<li>Prepare uma seringa de 5 mL com uma ponta luer lock e preenchida com 5 mL de injeção de cloreto de sódio a 0,9% sem aditivos.</li>
		<li>Remova a tampa verde e conecte a seringa ao pino dispensador ventilado (consulte a Tabela de Materiais) aparafusando-a no sentido horário.</li>
		<li>Remova a proteção do pino e coloque-a no centro da rolha de borracha do frasco. Pressione com firmeza até que o espigão esteja totalmente inserido na rolha.</li>
		<li>Esvazie toda a seringa de 5 ml no frasco para injetáveis empurrando a haste do êmbolo.</li>
		<li>Agite o frasco vigorosamente durante 20 s para misturar todo o conteúdo. Um líquido leitoso branco consistente mostrará que as microesferas lipídicas de hexafluoreto de enxofre se formaram.</li>
		<li>Para obter a dose necessária, inverta a seringa e retire lentamente o volume pretendido da suspensão para uma seringa de 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Use uma bomba de infusão. 
	NOTA: A abordagem de infusão12 foi usada para administrar microbolhas a ratos usando uma bomba de seringa. Uma seringa contendo microbolhas foi conectada a um conector de cateter inserido no rato. As microbolhas foram transferidas através de tubos de polietileno e a vazão da bomba de infusão foi ajustada para 0,66 mL/min. Esta taxa de perfusão permite a injeção de 2 ml de microbolhas de uma seringa de 3 ml durante 3 min. A infusão começou antes da sonicação por 1 min e continuou durante todo o período de sonicação de 2 min.</li>
	<li>Execute sonication. 
	NOTA: Neste estudo, os pulsos FUS foram escolhidos com os seguintes parâmetros: (1) Região alvo: hipocampo esquerdo; (2) Número de manchas: 6 para cobrir o hipocampo no cérebro; (3) Comprimento da explosão: 10 ms; (4) Período de explosão: 1200 ms; (5) Pressão acústica: 0,65 MPa; (6) «Modo de disparo contínuo» no menu do modo de sonicação do sistema FUS; (7) Tempo de sonicação: 120 s.</li>
</ol>
4. Procedimento de ressonância magnética usando um scanner pré-clínico 3T
<ol>
	<li>Após a sonicação, transferir os animais para uma mesa num scanner pré-clínico 3T sem criogénio.</li>
	<li>Posicione os ratos na posição de bruços. Mantenha a temperatura da almofada de aquecimento no scanner e monitore a frequência respiratória usando um sensor pneumático de travesseiro. Realize o protocolo de ressonância magnética para testar vários tipos de imagens de ressonância magnética (Tabela 1).</li>
	<li>Inclua outras técnicas de imagem quantitativa, como imagem ponderada em difusão (DWI), mapeamento T2*, mapeamento T1 e ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE), além de ressonância magnética com contraste, para demonstrar sua praticidade potencial para diversos estudos de imagem. Consulte a Tabela 1 para os protocolos de ressonância magnética usados neste estudo.</li>
	<li>Injete agentes de contraste de ressonância magnética baseados em GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) após a sequência de eco gradiente de RM ponderada em T1 e adquira imagens pós-TAG. 
	NOTA: Para um rato de 200 g, injetamos 200 μL do agente de contraste de ressonância magnética e seguimos com uma solução salina de 200 μL para lavar o tubo.</li>
</ol>
5. Exame macroscópico do cérebro de rato
NOTA: Após a ressonância magnética, 2 mL de solução de azul de Evans (2% diluída com solução salina tamponada com fosfato) foram injetados e o rato foi deixado em repouso por pelo menos 30 minutos para permitir que a solução se espalhasse e circulasse por todo o corpo. Posteriormente, os ratos foram sacrificados com uma overdose de isoflurano (5%) para exame macroscópico do cérebro (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Para confirmar a eutanásia, foi necessário socar o dedo do pé e o animal foi observado quanto à cessação da respiração por pelo menos 1 min. O procedimento de perfusão foi realizado, seguido de um exame do cérebro do rato. O procedimento de perfusão é resumido da seguinte forma:
<ol>
	<li>Realize uma toracotomia usando uma tesoura cirúrgica para expor os órgãos do tórax e visualizar a região cardíaca.</li>
	<li>Incisar (~5 mm) o átrio direito.</li>
	<li>Introduza solução salina no ventrículo esquerdo para fins de perfusão.</li>
	<li>Abra o osso do crânio com uma tesoura cirúrgica para desvendar e apresentar o cérebro. 
	NOTA: A perfusão adequada deve resultar em uma aparência uniformemente brilhante do cérebro, enquanto as áreas azuis persistentes indicam vazamento de albumina associado à BHE, conforme detectado pelo azul de Evans.</li>
</ol>

Enhancing Drug Delivery to the Brain: MRI-Guided Ultrasound Techniques in Rats

<ol><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+focused+ultrasound+in+the+brain%3A+from+thermoablation+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery.</a> Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).</li>
<li>Mungur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+focused+ultrasound+technique+in+glioblastoma+multiforme+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).</li>
<li>Boado, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+brain+uptake+of+a+genetically+engineered+bifunctional+fusion+antibody+targeting+the+mouse+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor.</a> Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).</li>
<li>Hendricks, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+delivery+methods+bypassing+the+blood-brain+and+blood-tumor+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Focus%22%5BJournal%5D)">Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers.</a> Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+MR+imaging-guided+focal+opening+of+the+blood-brain+barrier+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits.</a> Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+reversible+blood-brain+barrier+disruption+by+non-invasive+focused+ultrasound+at+frequencies+suitable+for+trans-skull+sonications%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications.</a> NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive%2C+targeted+creation+of+neuromyelitis+optica+pathology+in+AQP4-IgG+seropositive+rats+by+pulsed+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).</li>
<li>Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+do+you+measure+the+Bregma+for+rodent+stereotaxic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22IBRO+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery.</a> IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).</li>
<li>Kotopoulis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SonoVue+vs.+Sonazoid+vs.+Optison%3A+Which+bubble+is+best+for+low-intensity+sonoporation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).</li>
<li>Bracco Diagnostics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22LUMASON+%28sulfur+hexafluoride+lipid-type+A+microspheres%29+for+injectable+suspension%2C+for+intravenous+use+or+intravesical+use%22">LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use</a>. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).</li>
<li>Lapin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+opening+of+the+blood+brain+barrier+using+focused+ultrasound+with+constant+intravenous+infusion+of+microbubble+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent.</a> Sci Rep. 10, 16546(2020).</li>
<li>Vlachos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+dependence+study+of+the+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+at+distinct+pressures+and+microbubble+diameters+using+DCE-MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI.</a> Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-ultrasound+cranial+imaging+method+to+establish+the+relationship+between+cranial+FUS+incidence+angle+and+transcranial+attenuation+in+non-human+primates+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D.</a> Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).</li>
<li>Plaksin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+analysis+predicts+nanoparticle+concentration+delivered+to+the+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+and+monitoring+focused+ultrasound+mediated+blood-brain+barrier+opening+in+rats+using+power+Doppler+imaging+and+passive+acoustic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping.</a> Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes a declarar.

Um protocolo e procedimento animal usando um modelo de cateterismo da veia jugular em ratos para estudos de abertura da BHE foram desenvolvidos. Embora existam vários protocolos pré-clínicos, este protocolo incorpora um sistema FUS disponível comercialmente e um modelo de rato, minimizando os procedimentos de preparação animal e, assim, garantindo a reprodutibilidade experimental.
Neste protocolo, a seleção das microbolhas foi baseada em sua estabilidade e armazenamento em temperatura ambiente. Outras microbolhas comerciais podem ser consideradas como alternativas. Kotopoulis et al. investigaram e compararam vários tipos de microbolhas para sonoporação de baixa intensidade de câncer de pâncreas10. Com base nos resultados in vitro , a microbolha selecionada neste estudo foi considerada a formulação ideal em intensidades mais baixas, enquanto outras microbolhas foram mais eficazes em intensidades mais altas. No entanto, as microbolhas mais adequadas para abrir o BBB em um modelo de rato permanecem obscuras. Vlachos et al.13 investigaram os efeitos da pressão acústica e do tamanho das microbolhas sobre o volume de abertura da BHE e danos teciduais, como ruptura vascular e edema. O protocolo sugerido incentiva estudos futuros para investigar e identificar os parâmetros de microbolhas e sonicação mais adequados para uso em um modelo de rato.
Neste estudo, o sistema FUS pré-clínico foi selecionado devido às suas capacidades rápidas e precisas para segmentação multiponto. O sistema é programado para atravessar automaticamente pontos focais predefinidos, um recurso que facilita a sonicação regional direcionada à área do tecido alvo. Como alternativa, transdutores de ultrassom focalizado (FUS) estabelecidos, como os oferecidos pela Sonic Concepts e ExAblate Neuro (ver Tabela de Materiais), podem ser empregados para abrir a barreira hematoencefálica14,15. Notavelmente, o transdutor ExAblate Neuro foi projetado para ser compatível com imagens de RM, fornecendo orientação e monitoramento em tempo real do processo de tratamento. No futuro, esses transdutores podem ser integrados ao protocolo desenvolvido.
O protocolo de ressonância magnética proposto incorpora várias sequências de ressonância magnética para demonstrar sua praticidade potencial para diversos estudos de imagem. Recomenda-se a realização de sequências de gradiente eco ponderadas em T1 pré e pós-contraste e as sequências de spin eco ponderadas em T2 para capturar alterações na intensidade do sinal induzidas por agentes de contraste de ressonância magnética decorrentes do vazamento de BHE. Os usuários têm a opção de incluir mapeamento DWI, DCE e T2* em seu protocolo de imagem. Como alternativa ao uso de um scanner de ressonância magnética, Singh et al.16 introduziram métodos usando ultrassom Doppler para localização focal e mapeamento acústico passivo para detectar a cavitação de microbolhas, que está correlacionada com regiões abertas por BHE. Portanto, este protocolo é promissor para implementação em um sistema de ultrassom, apresentando uma alternativa potencial.
Neste estudo, foi empregada a abordagem de infusão12 , que se refere à infusão durante a sonicação. Como essa abordagem fornece continuamente microbolhas ao cérebro, pode resultar em uma abertura mais estável e consistente da BHE em comparação com a infusão em bolus. Lapin et al.12 investigaram a comparação entre as abordagens de infusão e bolus para abertura consistente da BHE, descobrindo que uma taxa de 7,2 μL de microbolhas Definity/kg/min ou abaixo poderia abrir a BHE sem lesão em vários níveis de pressão. No entanto, essa abordagem pode ter uma limitação potencial na manutenção da concentração de microbolhas dentro da seringa ao longo do tempo. As microbolhas podem tender a flutuar e agregar-se na parte superior da seringa, possivelmente causando uma diminuição na dose de microbolhas. Alternativamente, a injeção em bolus de microbolhas pode ser conduzida no seio retroorbital. Estudos futuros usando o protocolo proposto devem explorar comparações com diferentes métodos e tipos de infusão de microbolhas para otimizar a abertura da BHE em um modelo de rato.
A limitação deste estudo é a ausência de validação histoquímica para danos macroscópicos, como resultados de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) ou cristal violeta. No entanto, o protocolo proposto pode ser utilizado para otimizar os parâmetros de sonicação e ressonância magnética para evitar danos macroscópicos no cérebro. Além disso, procedimentos para análise histopatológica podem ser incorporados em estudos futuros para lidar com essa limitação.

A BBB regula o movimento de íons, moléculas e células entre os vasos sanguíneos e os tecidos cerebrais1. Essa função permite a manutenção da função neuronal e da saúde, evitando a entrega de agentes macromoleculares terapêuticos aos tecidos cerebrais. A permeabilidade limitada da BHE pode resultar na diminuição da eficácia e eficácia dos tratamentos para tumores cerebrais e doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e doença de Alzheimer2. Assim, várias abordagens, como entrega aprimorada por convecção, injeções intracranianas diretas, interrupção osmótica e design aprimorado de medicamentos, foram investigadas para contornar o BBB para entrega controlada de agentes terapêuticos3,4,5.
No entanto, essas abordagens têm limitações intrínsecas, como invasividade, risco de infecção, risco de hemorragia, heterogeneidade e rápido efluxo de drogas. O ultrassom focalizado pulsado (FUS) de baixa intensidade com injeção de microbolhas é uma técnica não invasiva promissora que permite a interrupção localizada e reversível da BHE. Os efeitos mecânicos do ultrassom acoplado a microbolhas podem alterar transitoriamente a permeabilidade da BHE (ou seja, abertura da BHE)6,7. Para avanços adicionais nas aplicações de tratamento utilizando a abertura BBB, experimentos in vivo com pequenos animais são essenciais.
Neste estudo, introduzimos protocolos de ressonância magnética e procedimentos em animais para monitorar a abertura da BHE em um modelo de rato. O protocolo incluiu um modelo de rato com cateter de veia jugular canulado por uma organização comercial (ver Tabela de Materiais). Um modelo de cateterismo da veia jugular em ratos tem os benefícios potenciais da administração rápida de medicamentos, testes de monitoramento hemodinâmico e cateterismo estável. A abertura da BHE foi realizada usando um sistema FUS pré-clínico. Projetado especificamente para abertura BBB em modelos de pequenos animais, como ratos e camundongos, este sistema incorpora componentes essenciais, como um sistema de bancada, computador de controle, transdutor, desgaseificador de água e acessórios que o acompanham. O uso deste sistema FUS pré-clínico guiado por estereotáxica não apenas aumenta a precisão, mas também agiliza os procedimentos em animais e os protocolos de ressonância magnética, contribuindo para a reprodutibilidade e simplicidade do protocolo experimental geral.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mL, Cloreto de Sódio 0,9%</td><td>Hospira, Inc</td><td>00409-7101-67</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha romba, tecnologias</td> de <td>infusão de 21 G SAI</td><td>B21-50</td><td></td>Conector de</tr><tr>cateter, infusão de<td>21 G</td><td>SAI technologies</td><td>CC-25-25</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio de cateter</td><td>Tecnologias de infusão SAI</td><td>Sku # HGS-10</td><td>(500 &micro;/mL) Glicerol</td></tr><tr><td>Evans</td><td>Blue Sigma aldrich</td><td>E2129-10g</td><td></td></tr><tr><td>ExAblate Neuro</td><td>Insightec Inc., Israel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gadavist</td><td>Bayer</td><td>2068062</td><td></td></tr><tr><td>GE&nbsp; Vaporizador de isoflurano&nbsp;</td>Bomba de Seringa <td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPS-12RS</td><td>Inovenso</td><td>IPS-12</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano USP</td><td>Vet um</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Microbbuble Lumason</td><td>Bracco Diagnostics Inc</td><td>SKJ709700</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Sprague-Dawley Machos (200&ndash; 250 g)&nbsp;</td><td>Agulha Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 18 G</td><td>BD Precisionglide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Mediatech</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>BD Intramédico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pré-clínico 3T livre de criogênio Scanner Bruker Biospin&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Biospec3T</td><td></td></tr><tr><td>Rato com cateterismo de veia jugular</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RK-50&nbsp; transdutor de ultrassom focalizado</td><td>FUS Instruments</td><td>Tx-50-1000-0</td><td></td></tr><tr><td>RK-50 sistema de ultrassom focalizado de bancada</td><td>FUS Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Concepts</td><td>Sonic Concepts Inc., WA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pino de dispensação ventilado&nbsp;</td><td>B Braun</td><td>4550560</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorando a abertura da barreira hematoencefálica em ratos com um sistema de ultrassom focalizado pré-clínico

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

O cérebro tem uma barreira sanguínea semipermeável altamente seletiva, denominada barreira hematoencefálica (BHE), que impede a entrega de agentes macromoleculares terapêuticos ao cérebro. A integração do ultrassom focalizado pulsado de baixa intensidade (FUS) guiado por RM com pré-injeção de microbolhas é uma técnica promissora para a modulação não invasiva e não tóxica da BHE. A ressonância magnética pode oferecer contraste superior de tecidos moles e várias avaliações quantitativas, como permeabilidade vascular, perfusão e distribuição espaço-temporal dos agentes de contraste de ressonância magnética. Notavelmente, as técnicas de ressonância magnética com contraste com agentes de contraste à base de gadolínio demonstraram ser o padrão-ouro para detectar aberturas de BHE. Este estudo descreve uma metodologia abrangente envolvendo protocolos de ressonância magnética e procedimentos em animais para monitorar a abertura da BHE em um modelo de rato. O modelo de rato oferece o benefício adicional da utilização do cateter da veia jugular, o que facilita a administração rápida de medicamentos. Um transdutor FUS pré-clínico guiado por estereotáxica facilita o refinamento e a simplificação de procedimentos em animais e protocolos de ressonância magnética. Os métodos resultantes são caracterizados pela reprodutibilidade e simplicidade, eliminando a necessidade de conhecimento cirúrgico especializado. Esta pesquisa se esforça para contribuir para a otimização de procedimentos pré-clínicos com modelos de ratos e incentivar novas investigações sobre a modulação da BHE para melhorar as intervenções terapêuticas em distúrbios neurológicos.

Este estudo apresenta um protocolo pré-clínico para monitorar a abertura da BHE em um modelo de rato utilizando um sistema FUS comercial. O sistema FUS foi montado sobre uma bancada ou um carrinho grande (Figura 1). Os ratos foram anestesiados com isoflurano misturado com oxigênio por meio de um cone nasal no suporte com o porta-transdutor. Um hidrofone ressonante em 500 kHz para detecção de cavitação acústica foi inserido no transdutor FUS com frequência ressonante de 1,0 MHz.
Conforme mostrado na Figura 2, o sistema FUS inclui configurações de sonicação e a capacidade de ajustar posições-alvo. Um "teste de movimento" deve ser realizado para garantir que o transdutor possa se deslocar entre pontos dentro de um período de rajada.
Quando a BHE é aberta, moléculas de GAD e azul de Evans atravessam a BHE. A imagem de ressonância magnética ponderada em T1 capturou as alterações induzidas pelo GAD na intensidade do sinal de RM (Figura 3A). Após o procedimento de perfusão, o tecido corado com azul de Evans foi diretamente visível (Figura 3B).
Foram realizados experimentos com três ratos para demonstrar a reprodutibilidade da abertura da BHE. Figura 4A mostra as imagens de eco de gradiente ponderadas em T1 após a sonicação e a administração de GAD. Um aumento significativo na intensidade do sinal de RM foi observado no alvo ao longo dos três experimentos. As imagens de RM dinâmica com contraste indicaram que a alteração mais significativa na intensidade do sinal ocorreu entre 7 e 8 minutos após a injeção em bólus do agente de contraste para RM (Figura 4B). As sequências de eco de gradiente ponderadas em T1 e eco de spin ponderadas em T2 mostraram claramente uma região de abertura da BHE, enquanto nenhuma alteração significativa foi observada no mapa de T1 antes da administração de GAD (Figura 4C).
Os protocolos com animais e de RM propostos neste estudo demonstram a viabilidade de realizar estudos de imagem por RM utilizando um modelo com ratos submetidos à cateterização da veia jugular. A imagem de perfusão por RM e/ou a imagem de tensor de difusão podem ser integradas ao protocolo para investigar um novo biomarcador de RM para detectar a abertura da BHE.
<img alt="Configuração experimental para imagem por ultrassom; inclui transdutor de 1 MHz, osciloscópio, suporte para rato e mais." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Sistema pré-clínico de USF de bancada e posicionamento do rato. (A) Sistema pré-clínico de USF de bancada. (B) Posicionamento do rato dentro do sistema. (C) Transdutor de 1 MHz e hidrofone, com o hidrofone posicionado no centro do transdutor de USF. (D) Posicionamento do transdutor e do recipiente de acoplamento com água na cabeça do rato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Exibição dos parâmetros de sonicação e localização de pontos por RMI para análise do direcionamento por ultrassom focalizado." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Interface do usuário do software do sistema de USF pré-clínico. A interface do usuário do software do sistema de USF pré-clínico permite a modificação das configurações de sonicação e das posições-alvo. Antes de iniciar a sonicação, o "teste de movimento" deve ser realizado para garantir que o transdutor consiga se deslocar entre os pontos dentro de um período de rajada. Esta função mede o tempo de movimentação do transdutor entre os pontos, sem realizar a sonicação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Cortes coronais e axiais do cérebro com amostras reais de R1 e R2 para análise comparativa de anatomia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Imagens ponderadas em T1 pós-GAD e regiões cerebrais após abertura da BHE. (A) Imagem ponderada em T1 pós-GAD e (B) fotografia do cérebro de rato após abertura da BHE. As marcações R1 e R2 em (A) correspondem às regiões mostradas em (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Ressonância magnética com contraste dinâmico; imagem do cérebro de rato; intensidade do sinal; ponderado em T1, T2, mapeamento de T1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imagens de ressonância magnética após sonicação e injeção de GAD. (A) Imagens de ressonância magnética ponderadas em T1 de três ratos após sonicação e injeção de GAD. (B) Ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE-MRI) do Rato nº 3, ilustrando alterações dependentes do tempo na intensidade do sinal. O agente de contraste para ressonância magnética baseado em GAD foi injetado no ponto temporal indicado pela seta vermelha. (C) Imagens ponderadas em T1, ponderadas em T2 e mapas de T1 do Rato nº 3, adquiridas antes da injeção do agente de contraste GAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>DWI 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Mapa T1 Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>DCE Cor 2D (Bolus 1)</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mapa R2*</td>
			<td></td>
			<td>FLASH pré</td>
			<td>RARE pré</td>
			<td></td>
			<td>FLASH pós</td>
			<td>RARE pós</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequência</td>
			<td>EPI</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TR</td>
			<td>2100 ms</td>
			<td>500 ms</td>
			<td>2400, 1600, 1100, 800, 450, 300 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>2000 ms</td>
			<td>39.3 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>1500 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>22.1 ms</td>
			<td>12 ecos;</td>
			<td>10,29 ms</td>
			<td>5,1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
			<td>2,9 ms</td>
			<td>5,1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 - 47 ms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Espessura</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campo de visão</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matriz</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
			<td>128</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA (graus)</td>
			<td>90</td>
			<td>60</td>
			<td>90/180</td>
			<td>20</td>
			<td>90/180</td>
			<td>12</td>
			<td>20</td>
			<td>45/180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Número de cortes</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo de aquisição</td>
			<td>4 min 12 s</td>
			<td>3 min 12 s</td>
			<td>10 min 38 s</td>
			<td>2 min 9 s</td>
			<td>1 min 52 s</td>
			<td>8 min 23 s</td>
			<td>3 min 52 s</td>
			<td>1 min 24 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opções</td>
			<td>Segmento 12, 3 direções, b = 0, 54, 180, 522 s/mm2</td>
			<td>Número de médias = 2, intervalo entre ecos = 4 ms</td>
			<td>Intervalo entre ecos 10,3 ms, fator RARA 2</td>
			<td></td>
			<td>Fator RARE 10, médias 4</td>
			<td>200 µL de agente (Gadavist, 1 mmol/kg)</td>
			<td></td>
			<td>Fator RARE 10, médias 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>para rato de 200 g, 1 min pré, 7 min pós, injetar 200 µL/min, 200 µL de solução salina de lavagem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protocolo pré-clínico de RNM no aparelho de RNM 3T.

Este estudo descreve um protocolo combinado de ressonância magnética (RM) e ultrassom focalizado pulsado de baixa intensidade (FUS), utilizando ratos vivos com cateterismo da veia jugular para monitorar a abertura da barreira hematoencefálica (BHE).

Monitorando a abertura da barreira hematoencefálica em ratos com um sistema de ultrassom focalizado pré-clínico

The brain has a highly selective semipermeable blood barrier, termed the blood-brain barrier (BBB), which prevents the delivery of therapeutic ...

monitoring-blood-brain-barrier-opening-rats-with-preclinical-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microbolhas mediada ruptura ultra-som focalizado da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​é uma técnica promissora para não-invasivo de entrega de drogas alvo no...

Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

Este vídeo descreve um método de interrupção temporária da barreira hematoencefálica (BHE) criando aberturas transitórias usando ultrassom focalizado mediado por microbolhas (FUS). Essas aberturas transitórias de BHE local podem eventualmente ser usadas para fornecer moléculas de drogas de tamanho maior diretamente no parênquima cerebral.

Abertura da barreira hematoencefálica mediada por microbolhas baseada em ultrassom de foco: uma técnica para criar aberturas transitórias localizadas na barreira hematoencefálica de camundongos por sonoporação

Ultrassom focado com agentes de microbolhas pode abrir a barreira cerebral sanguínea de forma focal e transitória. Esta técnica tem sido usada para fornecer uma ampla gama de agentes através da barreira cerebral do sangue. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a entrega localizada ao cérebro de roedores com ou sem orientação de ressonância magnética.

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

A barreira hemencefálica (BBB) pode ser temporariamente interrompida com ultrassom focado (ME) mediado por microbolhas. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para abertura BBB de alto rendimento in vivo usando um sistema de FUS modular acessível para especialistas em não-ultrassom.

Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

Este protocolo delineia as etapas necessárias para a entrega gênica através da abertura da barreira hematoencefálica (BHE) por ultrassom focado, avaliação da expressão gênica resultante e mensuração da atividade neuromoduladora de receptores quimiogenéticos por meio de testes histológicos.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Este protocolo descreve os procedimentos cirúrgicos e técnicos que permitem imagens de fluorescência multifotona em tempo real do cérebro de roedores durante tratamentos de ultrassom e microbolhas focados para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica.

Microscopia Multifotol Intravital em Tempo Real para visualizar tratamentos focados de ultrassom e microbolhas para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica

Uma técnica é descrita para amplamente abertura da barreira sangue-cérebro no ratinho usando microbolhas e ultra-som. Usando esta técnica, o manganês pode ser administrada para o cérebro do rato. Porque o manganês é um agente de contraste para IRM que se acumula nos neurónios despolarizadas, esta abordagem permite imagiologia de actividade neuronal.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica altamente reprodutível para avaliação na vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

Aprenda a monitorar a abertura da barreira hematoencefálica em ratos utilizando ultrassom focalizado e ressonância magnética. Este protocolo permite controle preciso da infusão de microbolhas e entrega de agentes de contraste.

Monitorando a abertura da barreira hematoencefálica em ratos com um sistema de ultrassom focalizado pré-clínico

Explorar mais vídeos