Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

Neste protocolo, pretendemos fornecer um tutorial passo a passo fácil de seguir sobre como coletar e armazenar células mononucleares e de sangue periférico de alta viabilidade, ou PBMCs, de sangue total. As PBMCs incluem linfócitos, células dendríticas e monócitos. Os PBMCs em massa podem ser processados para isolar tipos de células individuais e são comumente usados em uma ampla variedade de experimentos e ensaios, incluindo sequenciamento de RNA e citometria de fluxo.

Além dos PBMCs, também demonstramos como coletar plasma EDTA e todo o revestimento buffy. Antes de iniciar este protocolo, prepare os materiais e reagentes listados na Tabela 2. Observe que este protocolo foi projetado para a coleta de PBMCs de seis tubos de centrifugação de gradiente de densidade, cada um dos quais produz aproximadamente 12 milhões de células.

Dimensione de acordo. Usando a técnica padrão de flebotomia, colete sangue total em seis tubos de centrifugação com gradiente de densidade e um tubo de EDTA até ficar cheio. Centrifugue todos os tubos a 1800g por 20 minutos em temperatura ambiente.

Se necessário, os tubos coletados podem ser armazenados por até quatro horas e depois processados simultaneamente. Consulte o vídeo suplementar 1 para obter uma demonstração de como operar uma centrífuga. Após a centrifugação do tubo contendo o meio de gradiente de densidade, o plasma e as PBMCs estarão acima do meio de gradiente de densidade.

Eritrócitos e granulócitos se depositarão no fundo. Consulte a Figura 1A para obter uma visualização. Após a centrifugação, abra cuidadosamente o tubo de centrifugação do gradiente de densidade.

Use uma pipeta de transferência para remover e descartar a camada amarela translúcida contendo plasma. Não perturbe a camada nebulosa de células diretamente acima do meio gradiente de densidade. Erre ao deixar o excesso de plasma em vez de descartar os PBMCs.

Repita para todos os tubos. Com uma nova pipeta de transferência, pipetar o volume restante contendo células e plasma residual em cada tubo para cima e para baixo suavemente várias vezes acima do meio de gradiente de densidade. Após a ressuspensão, pipete o conteúdo ressuspenso do tubo em um tubo cônico de 50 mL rotulado.

Repita para todos os tubos. Encha o tubo de 50 mL até a linha de 50 mL com a solução 1 por despejo. Centrifugue o tubo de 50 ml a 300 g durante 10 minutos à temperatura ambiente.

O protocolo de coleta de plasma e buffy detalhado na Seção 2 pode ser concluído durante esse período. Após a centrifugação, o pellet contém PBMCs e o sobrenadante contém plaquetas e plasma residual. Descarte o máximo possível de sobrenadante.

Toque conforme necessário para remover gotas residuais. Despeje um tubo de 15 mL da solução 2 no tubo cônico de 50 mL contendo o pellet PBMC. Inverta suavemente o tubo para ressuspender o pellet.

Aspirar 15 ml da solução 3 utilizando uma pipeta de transferência. Adicione gota a gota ao tubo de 50 mL. A solução 3 contém DMSO, que é tóxico para as células à temperatura ambiente.

Não adicione a solução 3 até que esteja pronta para ser processada imediatamente. Inverta o tubo suavemente três vezes para misturar. Encha cada frasco criogênico pré-rotulado e pré-resfriado com 1 mL de PBMCs usando uma pipeta de distribuição múltipla.

Consulte o vídeo suplementar 2 para obter uma demonstração de como operar uma pipeta de distribuição múltipla. Coloque os frascos criogênicos dentro de um recipiente de congelamento pré-resfriado. Em seguida, mova o recipiente para um freezer negativo de 80 graus Celsius.

Mantenha os frascos criogênicos dentro do recipiente de congelamento por no mínimo 12 horas. Em seguida, transfira para uma caixa de armazenamento rotulada a 80 graus Celsius negativos. Como alternativa, transfira os frascos criogênicos congelados para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

Após a centrifugação, a camada superior consiste em plasma, a inferior contém eritrócitos e a interface serão as camadas amareladas. Consulte a Figura 1B para obter uma visualização. Usando uma nova pipeta de transferência, extraia o máximo de plasma possível sem perturbar a camada de revestimento leucocitário.

Em seguida, dispense alíquotas de 0,5 mL em frascos criogênicos pré-rotulados. Aspire a camada de revestimento leucocitário e transfira-a para o frasco para injetáveis criogênico devidamente rotulado. Observe que alguns plasma e eritrócitos podem contaminar a coleção de pelagem amarelada.

Após a coleta, armazene os frascos criogênicos em um freezer negativo de 80 graus Celsius. Como alternativa, armazene em nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Antes de iniciar o protocolo de descongelamento do PBMC, prepare os materiais e reagentes listados na Tabela 3.

Este protocolo foi projetado para o descongelamento de um tubo de 1,5 mL contendo aproximadamente 2 milhões de células. Dimensione de acordo. Observe que o número absoluto de células pode diferir significativamente entre diferentes pacientes e diferentes condições de tratamento.

Transfira PBMCs congelados do armazenamento usando gelo seco e descongele em uma incubadora de 37 graus Celsius por cerca de 4 minutos. Se desejado, uma alíquota pode ser tomada para contagem de células e medições de viabilidade, conforme detalhado na seção 4 do protocolo escrito. Após o descongelamento, adicione 1 mL da solução 4 a cada frasco para injetáveis criogênicos.

Em seguida, despeje o conteúdo em um tubo pré-rotulado de 50 mL contendo 10 mL da solução 4 para cada tubo de PBMC descongelado. Toque para remover gotas residuais. Coloque o filtro de células no tubo vazio de 50 mL e, em seguida, despeje a suspensão de células através do filtro de células.

Se necessário, bata levemente para quebrar a tensão superficial. Centrifugue cada tubo contendo as células coadas a 400g por 7 minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, despeje o sobrenadante contendo DMSO.

Toque conforme necessário para remover gotas residuais. Ressuspenda o pellet celular no meio desejado apropriado para as necessidades experimentais a jusante, como meios de cultura celular ou coquetéis de anticorpos de citometria de fluxo. Prossiga com seu experimento.

Após a coleta e criopreservação de PBMC, a viabilidade de PBMCs, monócitos e linfócitos descongelados de 56 amostras únicas foi avaliada por citometria de fluxo usando reagentes listados na Tabela 4 seguindo as instruções do fabricante mostradas nas Figuras 2A por meio da viabilidade média e desvio padrão de PBMCs, monócitos e linfócitos de 94 mais ou menos 4% 98 mais ou menos 1,1% e 93 mais ou menos 5,6% respectivamente, foi alcançado, mostrado na Figura 2G. As medidas de viabilidade por exclusão de azul de tripano produziram uma viabilidade média de 88 mais ou menos 7,5% e uma contagem de células de 2,3 vezes 10 elevado a 6 mais ou menos 1,9 vezes 10 elevado a 6. A análise por citometria de fluxo também demonstrou que os monócitos vivos compreendiam 17 mais ou menos 5,9% e os linfócitos constituíam 53 mais ou menos 13% do total de PBMCs.

Posteriormente, os monócitos foram separados de PBMCs descongelados de 59 amostras únicas por citometria de fluxo e submetidos à preparação da biblioteca e sequenciamento de RNA, conforme descrito em outro lugar. Uma contagem total de sequência média e desvio padrão de 18 mais ou menos 16,3 milhões foi alcançada com um alinhamento de 93 mais ou menos 6,3% de leitura e 49,6 mais ou menos 1,4 de conteúdo de GC, conforme mostrado nas Figuras 3A e B.A média e desvio padrão mapeados exclusivamente com porcentagem de leituras de 88 mais ou menos 3,6% foi encontrado com um subconjunto de 56 amostras únicas. Esses parâmetros demonstram que PBMCs altamente viáveis adequados para aplicações downstream, incluindo sequenciamento de RNA de alta qualidade, podem ser obtidos por operadores com qualquer nível de treinamento laboratorial usando este protocolo.

Ao realizar este protocolo, é fundamental trabalhar rapidamente para evitar a morte celular, especialmente após a adição da solução 3, que é tóxica para as células à temperatura ambiente. Além disso, as células também devem ser manuseadas com cuidado para minimizar os danos. Este protocolo fornece um método eficiente e fácil de seguir para o isolamento de PBMCs, plasma EDTA e buffy coat.

Essas células imunes podem ser usadas para uma ampla gama de experimentos e ensaios focados no papel do sistema imunológico em diferentes contextos biológicos.