Name: Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprenda a isolar e criopreservar células mononucleares de sangue periférico humano com alta viabilidade a partir de sangue total. Este método garante amostras de qualidade para estudos imunológicos e análises de RNA.

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<ol><li>Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMathew%2C+J+%22Physiology%2C+Blood+Plasma%22">Physiology, Blood Plasma</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).</li>
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<li>Higdon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+in-depth+immunophenotyping+of+delay+to+peripheral+blood+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing.</a> Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+aptamer-CRISPR+nanodevice+enables+precise+profiling+of+interferon-gamma+release+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice.</a> ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).</li>
<li>Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+revealed+dysregulated+RNA-binding+protein+expression+patterns+and+functions+in+human+ankylosing+spondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis.</a> Front Med. 11, 1369341(2024).</li>
<li>Honardoost, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immune+cell+dysregulation+and+molecular+subtypes+revealed+by+single-cell-RNA-seq+of+subjects+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes.</a> Genome Med. 16, 45(2024).</li>
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<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sars-Cov-2+spike+induces+intestinal+barrier+dysfunction+through+the+interaction+between+CEACAM5+and+Galectin-9%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9.</a> Front Immunol. 15, e1303356(2024).</li>
<li>Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+alterations+and+PI3k-PKB+pathway+suppression+in+patients+with+allergic+rhinitis+undergoing+sublingual+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy.</a> Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).</li>
<li>Rucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+mitochondrial+DNA+copy+number+in+circulating+cell-free+DNA+and+extracellular+vesicles+across+cardiovascular+health+status%3A+A+prospective+case-control+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study.</a> FASEB J. 38 (10), e23672(2024).</li>
<li>Ghamrawi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffy+coat+DNA+Methylation+Profile+is+Representative+of+Methylation+Patterns+in+White+Blood+Cell+Types+in+Normal+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).</li>
<li>Johansson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+biomarker+profiles+in+autosomal+dominant+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease.</a> Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).</li>
<li>Bonaterra-Pastra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plasma+lipoprotein+composition+and+function+in+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Biomedicines. 9 (1), 72(2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).</li>
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<li>Corkum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+subsets+and+their+gene+expression+profiles+from+human+PBMC+isolated+by+Vacutainer+Cell+Preparation+Tube+%28CPT%E2%84%A2%29+and+standard+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient.</a> BMC Immunology. 16, 48(2015).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield+but+severely+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
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<li>Faass, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+heptose+metabolites+and+the+cag+pathogenicity+island+to+the+activation+of+monocytes%2Fmacrophages+by+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori.</a> Front Immunol. 12, e632154(2021).</li>
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<li>Chao, S. -H., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavopiridol+inactivates+P-TEFb+and+blocks+most+RNA+polymerase+II+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo.</a> J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &micro; L Tips</td><td>Gilson</td><td>F174501</td><td>Aproximadamente 3 pontas necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Biopioneeer</td><td>CNT-15</td><td>Para segurar Soluções 2/3 2 necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Collection 2 mL Cryovials</td><td>Globe Scientific</td><td>3012</td><td>Aproximadamente 40 crioviais necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>20 &micro; L Dicas</td><td>Gilson</td><td>F174201</td><td>Para uso na contagem de células; o volume necessário depende do método de contagem de células usado. 1 ponta é necessária por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados</td></tr><tr><td>50 mL Tubo cônico</td><td>CEM Corporation</td><td>50-187-7683</td><td>2 necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 necessário por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados</td></tr><tr><td>CD14 Anticorpo Biolegend</td><td></td><td>325621</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD16</td><td>Biolegend</td><td>360723</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD19</td><td>Biolegend</td><td>363007</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD3</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD56</td><td>Biolegend</td><td>318303</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD66b</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células</td><td>Biopioneeer</td><td>DGN258367</td><td>1 necessário por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados para serem descongelados Tubo de</td></tr><tr><td>Preparação de Células Mononucleares CPT</td><td>BD Biosciences 362753</td><td></td><td>6 tubos necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Collection Cryo Freezer Box</td><td>Southern Labware</td><td>SB2CC-81</td><td>Contém 81 tubos 1 necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Cryotube Rack</td><td>Fisherbrand</td><td>05-669-45</td><td>Armazena até 50 criogeniais</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>Aproximadamente 2,5 mL necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr> Água <tr><td>Destilada Livre de DNase/RNase</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td>Aproximadamente 2 mL necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Aproximadamente 9 mL necessários por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados</td></tr><tr><td>Tubos EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td>1 tubo necessário por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Collection Flavopiridol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3055-5MG</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>307609</td><td></td></tr><tr><td>Soro Humano Albumina</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>Aproximadamente 25 mL necessários por paciente ou condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Human Trustain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292912-1KG-K</td><td>Para uso na Impressora de Etiquetas Mr. Frosty</td></tr><tr><td></td><td>Phomemo</td><td>M110-WH</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de Mortos-Vivos</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Comporta até 18 tubos. 2 Mr. Frostys necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Pipeta Multidispense</td><td>Brandtech</td><td>705110</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Multidispense</td><td>Brandtech</td><td>705744</td><td>Aproximadamente 3 ponteiras necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Collection P1000 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P20</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td>Para uso na contagem de células; o volume necessário depende do método de contagem de células usado.</td></tr><tr><td>Etiquetas de impressora</td><td>Phomemo</td><td>PM-M110-3020</td><td>Aproximadamente 45 etiquetas necessárias por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Aproximadamente 5 etiquetas necessárias por 1 mL de PBMCs congelados não agrupados a serem descongelados</td></tr><tr><td>EDTA livre de RNase (0,5 M)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Aproximadamente 40 &micro; L necessário por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados</td></tr><tr><td>PBS livre de RNase (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>Aproximadamente 1 mL necessário por 1 mL de PBMCs congelados a serem descongelados</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>Aproximadamente 80 mL necessários por paciente ou condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Collection Pipetas de transferência</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>Aproximadamente 5 necessários por paciente/condição de tratamento para PBMC/Plasma/Buffy</td></tr><tr><td>Coat Collection Tube</td><td>Holder Endicott-Seymour</td><td>14-781-15</td><td>Suporta até 80 Tubos CPT/EDTA</td></tr></tbody></table>

isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners

Após a coleta e criopreservação de PBMC, a viabilidade de PBMCs, monócitos e linfócitos descongelados de 56 amostras únicas foi avaliada por citometria de fluxo usando reagentes listados na Tabela 4 seguindo as instruções dos fabricantes (Figura 2A-F). Foi alcançada uma viabilidade média ± DS de PBMCs, monócitos e linfócitos de 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% e 93 ± 5,6%, respectivamente (Figura 2G). A medição da viabilidade pela exclusão do Azul de Tripano produziu uma viabilidade média de 88 ± 7,5% e uma contagem de células de 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. A análise por citometria de fluxo também demonstrou que os monócitos vivos compreenderam 17 ± 5,9% e os linfócitos constituídos por 53 ± 13,0% do total de PBMCs.
Posteriormente, os monócitos foram separados de PBMCs descongelados de 59 amostras únicas por citometria de fluxo e submetidos à preparação da biblioteca e sequenciamento de RNA, conforme descrito em outro lugar24. Uma contagem média de sequências totais ± SD de 18,0 ± 16,3 milhões foi alcançada com um alinhamento de leitura de 93 ± 6,3% e 49,6 ± 1,4% de conteúdo de GC (Figura 3A-B). Uma porcentagem média de leituras mapeadas exclusivamente ± SD de 88 ± 3,6% foi encontrada com um subconjunto de 56 amostras únicas. Esses parâmetros demonstram que PBMCs altamente viáveis adequados para aplicações downstream, incluindo sequenciamento de RNA de alta qualidade, podem ser obtidos por operadores com qualquer nível de treinamento laboratorial usando este protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Densidade</td>
			<td>Citação</td>
		</tr><tr><td>Plasma</td>
			<td>1,022 g/mL a 1,026 g/mL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Plaquetas</td>
			<td>&lt;1,061 g/mL a &gt;1,070 g/mL</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>PBMCs</td>
			<td>&lt;1,077 g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Neutrófilos de baixa densidade*</td>
			<td>&lt;1,077 g/mL</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Granulócitos (neutrófilos*, basófilos e eosinófilos)</td>
			<td>&gt;1,077 g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Eritrócitos</td>
			<td>1,11 g/ml</td>
			<td>4</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Componentes do sangue total listados por ordem decrescente de densidade. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagant/Material</td>
			<td>Quantidade (por 6 tubos CPT e 1 tubo EDTA)</td>
			<td colspan="5">Ponta</td>
			<td colspan="3">Declarações de cuidado</td>
		</tr><tr><td>Tubos CPT</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="5">Etiqueta de acordo com o ID do paciente ou da amostra.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Tubo de EDTA</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">Etiqueta de acordo com o ID do paciente ou da amostra.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">Além do ID do paciente ou da amostra, rotule 1 tubo para PBMCs e 1 para resíduos.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Criogenias</td>
			<td>39</td>
			<td colspan="5">Rótulo 30 para PBMCs, 8 para plasma EDTA e 1 para buffy coat. Nem todos os criogenianos podem ser usados.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Sr. Gelado</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">Encha até a metade com isopropanol e pré-resfrie durante a noite a -20 ° C.</td>
			<td colspan="3">O isopropanol é um irritante inflamável. Mantenha longe de faíscas/chamas. Evite inalar e manuseie com luvas e cuidados.</td>
		</tr><tr><td>Flavopiridol</td>
			<td>100 μL de estoque 1000X</td>
			<td colspan="5">Para preparar o estoque de flavopiridol 1000X, suspenda 5 mg de flavopiridol em 1,14 mL de DMSO para uma concentração de 10 mM. Alíquota de 200 μL em recipientes individuais e depois congelar. Para usar, descongele alíquotas individuais e dilua 1:10 em água destilada livre de DNase / RNase e, em seguida, use como uma solução 1000X.</td>
			<td colspan="3">O flavopiridol é um irritante. Manuseie com luvas e cuidados.</td>
		</tr><tr><td>Solução 1</td>
			<td>50 mL</td>
			<td colspan="5">RPMI Médio. Para fazer 50 mL de solução estoque, use 50 mL de meio RPMI.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Solução 2</td>
			<td>15 mL</td>
			<td colspan="5">Meio RPMI + 12,5% de albumina sérica humana + 1 μM de flavopiridol. Para fazer 50 mL de solução-estoque, use 25 mL de meio RPMI + 25 mL de albumina sérica humana + 50 μL de flavopiridol 1000X.</td>
			<td colspan="3">O flavopiridol é um irritante. Manuseie com luvas e cuidados.</td>
		</tr><tr><td>Solução 3</td>
			<td>15 mL</td>
			<td colspan="5">Meio RPMI + 11,25% de albumina sérica humana + 1 μM de flavopiridol + 10% de DMSO. Para fazer 50 mL de solução estoque, use 22,5 mL de meio RPMI + 22,5 mL de HSA + 5 mL de DMSO + 50 μL de flavopiridol 1000X.</td>
			<td colspan="3">O flavopiridol é um irritante e o DMSO é tóxico e é facilmente absorvido pela pele. Manuseie com luvas e cuidados.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Lista de verificação de reagentes e materiais a serem preparados e rotulados para coleta e criopreservação de PBMCs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagant/Material</td>
			<td>Quantidade (por alíquota de 1 mL de PBMCs congelados)</td>
			<td colspan="2">Ponta</td>
			<td>Declarações de cuidado</td>
		</tr><tr><td>Solução 4</td>
			<td>10 mL</td>
			<td colspan="2">PBS + 2 mM EDTA Para fazer 50 mLs de solução estoque, use 5 mL de PBS 10X + 200 μL de EDTA 0,5M + 44,8 mL de água destilada livre de DNase / RNase</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">Além do ID do paciente ou da amostra, rotule 1 tubo para PBMCs pré-tensionados, 1 para PBMCs pós-tensionados e 1 para resíduos. Encher o tubo rotulado para PBMCs pré-corados com 9 ml de solução 4 por ml de PBMCs congelados</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">Para contagem de células; etiqueta com paciente ou ID da amostra</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Solução de 0,4% de Trypan Blue</td>
			<td>20 μL</td>
			<td colspan="2">Para contagem de células; pode ser adicionado ao tubo de 1,5 mL com antecedência no dia anterior.</td>
			<td>O azul de tripano é cancerígeno. Manuseie com luvas e cuidados.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Lista de verificação de reagentes e materiais a serem preparados e rotulados para descongelamento e contagem de PBMCs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente/Material</td>
			<td>Quantidade (por milhão de células)</td>
		</tr><tr><td>Mancha de Morto-Vivo</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Confiança Humana FcX</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD3 Anticorpo</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD19 Anticorpo</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD56 Anticorpo</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD66b Anticorpo</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo HLA-DR</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>CD14 Anticorpo</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD16</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr><tr><td>RNAsina</td>
			<td>100 unidades</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Tabela de reagentes para isolamento de monócitos de PBMCs por citometria de fluxo.
<img alt="Separação de hemocomponentes em diagrama de centrifugação com gradiente de densidade; plasma, PBMCs, camadas de revestimento leucocitário." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Componentes do sangue total separados por centrifugação em centrifugação com gradiente de densidade ou tubos de EDTA. (A) A centrifugação do sangue total em tubos de centrifugação com gradiente de densidade resulta na separação de plasma, plaquetas e PBMCs acima do meio de gradiente de densidade com multinucleados e eritrócitos abaixo do meio de gradiente de densidade. (B) A centrifugação do sangue total em tubos de EDTA resulta na separação do plasma na camada superior, eritrócitos na camada inferior e o revestimento leucocitário na interface. Criado com Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de dispersão por citometria de fluxo; PBMCs, monócitos, linfócitos; análise de viabilidade, gráfico de tipo de célula." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: A viabilidade dos PBMCs criopreservados descongelados foi avaliada por coloração de fluxo vivo / morto e citometria de fluxo. (A) Os detritos, denotados por um asterisco *, são excluídos dos PBMCs por meio de dispersão frontal e lateral. (B) Análise representativa de PBMCs inteiros (C) Os pan-monócitos são considerados HLA-DR positivos e negativos para os seguintes antígenos de superfície marcados com FITC: CD3, CD19, CD56 e CD66b. (D) Análise representativa de monócitos vivos/mortos. (E) Linfócitos controlados pelos seguintes antígenos de superfície marcados com FITC: CD3, CD19, CD56 e CD 66b. (F) Análise representativa de linfócitos vivos/mortos. (G) Porcentagem de viabilidade de cada tipo de célula quantificada a partir de 56 amostras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de análise de dados FastQC; Milhões de sequências vs alinháveis, distribuição de conteúdo GC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Qualidade de sequenciamento de RNA de monócitos classificados a partir de PBMCs criopreservados. 56 amostras únicas foram sequenciadas e uma média ± DP 18,0 ± 16,3 milhões de sequências totais foram geradas. (A) O alinhamento foi alto, com 92,5% ± 6,3% das sequências alinhadas com o genoma de referência. (B) O conteúdo de GC dessas sequências foi de 49,6 ± 1,4%. Criado com FastQC25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo Suplementar 1: Demonstração de como usar a centrífuga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo Suplementar 2: Demonstração de como operar uma pipeta multidispensadora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are commonly used in biomedical research on the immune system and its response to disease and pathogens. This ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Neste vídeo, demonstramos o isolamento de monócitos do sangue humano total por separação imunomagnética negativa. Os monócitos isolados podem ser usados para análises posteriores a jusante.

Isolamento de Monócitos de Sangue Total por Seleção Imunomagnética Negativa

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs, contendo monócitos e linfócitos de um revestimento leucocitário humano por centrifugação com gradiente de densidade. Os PBMCs isolados podem ser usados para análise posterior.

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Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o ensaio de micronúcleos em bloqueio de citocinese em amostras criopreservadas de sangue total. Este método otimizado de criopreservação de sangue total para análise de micronúcleos é uma técnica confiável para amostragem em larga escala e estudos multicêntricos e pode ser usado para outros ensaios relacionados ao sangue também.

O Ensaio do Micronúcleo em Sangue Total Criopreservado

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Isolando células mononucleares do sangue periférico humano de Buffy Coats por meio de separação de esferas imunomagnéticas de alto rendimento

Aprenda a isolar e criopreservar células mononucleares de sangue periférico humano com alta viabilidade a partir de sangue total. Este método garante amostras de qualidade para estudos imunológicos e análises de RNA.

Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

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