Name: Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a desenvolver um ensaio de triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus usando cepas com duplo repórter. Este método automatizado acelera a descoberta de novos tratamentos para infecções resistentes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ensaio de triagem de alto rendimento para Mycobacterium abscessus usando repórteres duplos

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
<li>Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoan%2C+TL+%22Annual+reports+in+medicinal+chemistry%22">Annual reports in medicinal chemistry</a>. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Advanced+assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening+and+analysis+in+Assay+guidance+manual%22">Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
<li>Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epirubicin%3A+Is+it+like+doxorubicin+in+breast+cancer%3F+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review.</a> Breast. 21 (2), 142-149 (2012).</li>
<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
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<li>Kwok, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton+selectively+targets+breast+cancer+cells+through+inhibition+of+forkhead+box+m1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression.</a> Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Mycobacterium abscessus (Mab) é um patógeno oportunista responsável por infecções pulmonares, especialmente em pessoas com fibrose cística e outras doenças pulmonares. As infecções causadas por Mab são notoriamente difíceis de tratar devido à requintada resistência intrínseca aos medicamentos, comparável à tuberculose multirresistente1. Os medicamentos disponíveis são amplamente ineficazes devido ao envelope celular micobacteriano altamente impermeável e a um genoma que codifica várias enzimas que desativam os antibióticos2. Assim, o tratamento inclui a combinação de vários medicamentos levando meses a anos. Esse regime desafiador de múltiplas drogas, combinado com a baixa adesão do paciente, resulta em uma taxa média de cura de 30% a 50%3. Além disso, a prevalência de infecções pulmonares causadas por micobactérias não tuberculosas aumentou nas últimas décadas, incluindo as causadas por Mab 1,4. Consequentemente, a comunidade científica está correndo para desenvolver novos compostos para tratar infecções por Mab.
Uma das estratégias perseguidas com esse objetivo é o reaproveitamento de medicamentos - o processo de identificação de novas oportunidades terapêuticas para medicamentos existentes. Isso contorna o maior desafio que acompanha o pipeline de descoberta e desenvolvimento de um novo medicamento - o tempo5. Esse conceito simples aproveita os perfis farmacocinéticos e de segurança já estabelecidos de vários medicamentos para reduzir os custos de desenvolvimento e encurtar o prazo necessário para levar um medicamento da bancada à beira do leito6. Assim, bibliotecas que combinam centenas a milhares de tais compostos foram compiladas, permitindo que os pesquisadores testem rapidamente a possibilidade de redirecionar medicamentos contra seu patógeno de interesse.
A maioria dos estudos sobre o desenvolvimento de medicamentos contra o Mab é baseada em um ensaio padrão-ouro, mas tradicional, que avalia a atividade in vitro de um composto contra micobactérias - contagem de unidades formadoras de colônias7. Apesar de sua precisão, esse procedimento é extremamente demorado, tornando-se rapidamente inviável quando alguém pretende testar bibliotecas contendo milhares de compostos. Para esse fim, as triagens de alto rendimento (HTS) foram integradas ao desenvolvimento de medicamentos - ensaios robustos que aproveitam a robótica e os dispositivos de manuseio de líquidos, permitindo que milhares de compostos sejam rapidamente rastreados em paralelo8. Isso normalmente é feito testando uma única concentração inicialmente, usando placas de microtitulação de formatos de 96, 384, 1536 ou 3456 poços, atuando como ponto de partida para identificar acertos e otimizá-los ainda mais no pipeline para serem usados clinicamente.
Os ensaios baseados em repórteres fornecem uma vantagem significativa para a robustez do HTS devido à sua simplicidade e sensibilidade em comparação com outros ensaios baseados em corantes e absorbâncias 7,9. No entanto, até onde sabemos, apenas alguns estudos otimizaram uma triagem de alto rendimento contra o Mab9.
Recentemente, nosso laboratório desenvolveu cepas repórter duplas capazes de emitir concomitantemente luminescência e fluorescência10. Mab operon_mScarlet é uma dessas variedades. É autoluminescente devido à expressão do operon LuxABCDE , que inclui uma luciferase bacteriana (pela expressão dos genes luxAB ) e um substrato aldeído de cadeia longa (pela expressão dos genes luxCDE ). Por outro lado, a leitura fluorescente é obtida através da expressão de uma proteína fluorescente vermelha recentemente desenvolvida, a mScarlet, que supera as proteínas eGFP e mCherry mais comumente usadas, fornecendo um sinal mais potente11. O uso dessa cepa nos permite avaliar a viabilidade bacteriana em cultura líquida, medindo o sinal luminescente em um leitor de microplacas sem adicionar reagentes ou realizar etapas adicionais. Em termos de detecção, a fluorescência intrínseca permite a visualização microscópica em células vivas ou fixas sem o uso de corantes ou anticorpos. Ter uma única cepa com ambas as leituras fornece aos pesquisadores uma vantagem significativa ao usá-la em ensaios HTS - a variabilidade reduzida entre ensaios com leituras diferentes, pois não há necessidade de trocar cepas com base na natureza do ensaio.
Assim, este trabalho desenvolveu um ensaio de alto rendimento contra Mab usando uma cepa repórter dupla projetada internamente (Figura 1). Isso permitiu uma avaliação rápida da atividade in vitro de 1280 medicamentos destinados ao reaproveitamento usando uma biblioteca comercial (ver Tabela de Materiais). Em primeiro lugar, as atividades foram avaliadas em ensaio de cultura em caldo usando luminescência e, em segundo lugar, usando macrófagos infectados com Mab aproveitando o sinal fluorescente, emulando melhor o processo de infecção visto in vivo12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> Figura 1: Resumo gráfico do protocolo estabelecido. O principal participante nesta triagem é uma cepa micobacteriana repórter dupla desenvolvida internamente , que é usada em todos os experimentos. Em primeiro lugar, usando um dispensador de reagentes e bactérias planctônicas, uma triagem inicial é realizada testando os compostos em uma única concentração. Os acertos identificados continuam para o ensaio de validação, onde três concentrações diferentes são testadas. Ambos os experimentos são feitos usando a leitura luminescente. Os acertos validados continuam para o ensaio de infecção, onde três concentrações diferentes também são testadas, e macrófagos derivados da medula óssea são infectados no MOI 1. Um sistema de imagem de alto conteúdo adquire o sinal fluorescente bacteriano e o software de análise é usado para avaliar a carga intracelular por meio da fórmula Mycoload. O número de compostos diminui à medida que a complexidade do ensaio aumenta. Criado com BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr>Solução <td>de fixação</td>de <td>formalina tamponada neutra a 10%</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td></tr><tr><td>384 poços polipropileno preto de fundo redondo microplaca não tratada</td><td>Microplacas Corning</td><td>3658</td><td>White podem ser usadas; poliestireno pode ser usado</td></tr><tr><td>50 TS Arruela</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana de vedação Breathe-Easy</td> Célula <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>:: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>robô de manuseio de equipamentos</td></tr><tr><td>Claritromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>Dissolvido em DMSO até a concentração desejada</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>Diluir em meio de crescimento líquido até a concentração desejada</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Software de análise</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2</subIncubadora >, 165 L</td><td>Incubadora de células</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>JANUS com braço de 4 pontas e braço MDT</td><td>Revvity</td><td></td><td>manipulador de líquidos</td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Incubadora Termaks</td><td></td><td>com agitação</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp; Dispensador de Reagente Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix Plus</td><td>Sistema de imagem</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>Necessário para microscópios de alto conteúdo</td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salino (PBS) 1x</td><td>solução de lavagem</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Prestwick Bibliotecas químicas&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Biblioteca química comercial destinada ao reaproveitamento de medicamentos</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura celular:</td><td></td><td></td><td>Quando necessário, adicione 10% do suplemento</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td>NA Meio</td><td>condicionado da linhagem celular L929 que libera fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF); suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td><forte>Solução de lavagem de infecções</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água apiriogênica</td><td></td><td></td><td>Vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada Hank's 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Diluir para 1x com água appirogênica</td></tr><tr><td><forte>Solução permeabilizante</forte></td><td></td><td></td><td>PBS com 0,1% Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Outros fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração</forte></td><td></td><td></td><td>PBS com DAPI (500 ng/mL) e HCS Far Red (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Far Red&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td><forte>Meio de crescimento líquido</forte></td><td></td><td></td><td>Quando necessário, adicione 10% de suplemento</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Caldo</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0,05% de concentração final. Outros fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Liquid growth medium suplemento:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumina de soro bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Avaliação fatorial Z' A Figura 2 mostra os dados de um dos dois experimentos realizados para calcular o fator Z'. O controle positivo foi claritromicina a 4 μg/mL. Ambos os experimentos produziram fatores Z 'de 0,64 e 0,62, o que significa que as condições e a leitura usadas para este ensaio podem ser aplicadas ao ensaio de triagem que se seguiu (Z '&gt; 0,5). No entanto, o fator Z' foi calculado para todos os experimentos restantes (ensaio de infecção) para controlar o desempenho de cada experimento.
Como prova de conceito do ensaio HTS projetado, uma biblioteca de compostos destinados ao reaproveitamento de medicamentos foi testada. É composto por 1280 moléculas diversas e pequenas, 95% das quais são medicamentos aprovados pela FDA e EMA. Essas moléculas oferecem alta diversidade química e farmacológica.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> Figura 2: Resultados da avaliação fatorial Z'. Mab a 2,5 x 105 UFC/mL foi incubado com e sem claritromicina a 4 μg/mL por 48 h a 37 °C. Após o período de incubação, a luminescência foi medida para avaliar a viabilidade micobacteriana. O gráfico mostra os valores individuais de luminescência de micobactérias viáveis tratadas e não tratadas em um experimento independente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Triagem de acertos na biblioteca Todos os compostos foram testados a 6,66 μM contra Mab. Devido ao tamanho da biblioteca, os compostos foram divididos em quatro diferentes placas de microtitulação de 384 poços (Figura 3A-D). Os resultados foram normalizados tanto para o solvente quanto para o efeito de borda verificado.
Neste ensaio de triagem, trinta e três acertos foram identificados, trinta dos quais diminuíram significativamente a emissão de luminescência, reduzindo a viabilidade micobacteriana (Figura 3). Curiosamente, três compostos levaram a uma maior emissão de luminescência, possivelmente relacionada ao aumento do metabolismo ou proliferação bacteriana (Figura 3). Todos os 33 acertos foram levados para o ensaio de validação, incluindo os três compostos que aumentaram a luminescência, para testar se esse perfil seria mantido.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> Figura 3: Resultados da triagem da biblioteca. (A-D) Mab a 2,5 x 105 UFCs/mL foi incubado com 1280 compostos a 6,66 μM por 48 h a 37 °C. Após a incubação, a luminescência foi medida para avaliar a viabilidade micobacteriana. Os gráficos mostram a RLU de um experimento independente, apresentada como unidades arbitrárias após a normalização do solvente e do efeito de borda. O AVG RLU e seu DP correspondente foram calculados para cada placa para determinar um limite (em cinza; AVG ± 3SD). Os símbolos redondos representam um composto testado. Em azul, qualquer composto fora desse limite é considerado um acerto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ensaio de validação de acertos As concentrações usadas para este ensaio foram 13,3 μM, 6,66 μM e 3,3 μM. Cada composto foi testado em duplicata para aumentar a robustez.
É importante ressaltar que os compostos 30, 31 e 32, anteriormente associados a maior RLU (Figura 3A,C), mantiveram esse perfil, com mais de 200% de viabilidade micobacteriana alcançada em poços tratados com o composto 32 (Figura 4).
Os compostos 20 e 33 foram considerados inativos, pois a viabilidade micobacteriana é próxima de 100% em todas as concentrações testadas (Figura 4).
Os compostos 9 e 21 apresentaram inatividade semelhante nas duas concentrações mais baixas; no entanto, ao contrário do 20, eles permanecem ativos no máximo, 13,3 μM, com o composto 21 exibindo maior potência (Figura 4).
O composto 3 também apresenta inatividade na concentração mais baixa e uma perda de atividade em 6,66 μM, embora menor que o composto 21 (Figura 4). Apenas na menor concentração, os compostos 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 e 28 apresentaram menor potencial terapêutico. No entanto, 2, 10 e 28 ainda levam a &lt;50% da viabilidade micobacteriana.
Globalmente, os quatorze compostos restantes foram ativos em todas as concentrações testadas.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> Figura 4: Resultados do ensaio de validação de acerto. Mab a 2,5 x 105 UFC/mL foi incubado com cada hit previamente identificado a 13,3 μM, 6,66 μM e 3,3 μM (1,3%, 0,7% e 0,3% de DMSO, respectivamente) por 48 h a 37 °C. Após o período de incubação, a luminescência foi medida para avaliar a viabilidade micobacteriana. O gráfico mostra as porcentagens de micobactérias viáveis tratadas em relação às micobactérias não tratadas de um experimento independente, com cada composto testado em duplicata. Os símbolos redondos representam as duplicatas de cada composto. As barras representam a média dessas duplicatas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ensaio de infecção Dos trinta e três compostos testados, vinte e oito foram selecionados para o ensaio de infecção (Figura 4). Os compostos 7, 8, 9, 20 e 33 não foram selecionados para este ensaio. Enquanto 9, 20 e 33 foram deixados de fora por inatividade quando validados (Figura 4), os dois primeiros foram deixados de fora por motivos técnicos. No entanto, esses compostos foram identificados como rifampicina e linezolida, antibióticos já utilizados para tratar infecções por Mab12. Todos os compostos testados no ensaio de infecção foram identificados e estão listados na Tabela 1. A atividade antimicrobiana dos compostos contra macrófagos infectados com Mab foi avaliada usando a fluorescência intrínseca da bactéria como leitura.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Nome</td>
			<td>Composto</td>
			<td>Nome</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Sulfatiazol</td>
			<td>18</td>
			<td>Cefuroxima</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Ciprofloxacina</td>
			<td>19</td>
			<td>Rifaximina</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Cefotaxima</td>
			<td>21</td>
			<td>Cefdinir</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Daunorrubicina</td>
			<td>22</td>
			<td>Claritromicina</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Doxorrubicina</td>
			<td>23</td>
			<td>Besifloxacina</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>24</td>
			<td>Levofloxacina</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>Amicacina</td>
			<td>25</td>
			<td>Rifabutina</td>
		</tr><tr><td>11</td>
			<td>Moxalactama</td>
			<td>26</td>
			<td>Gatifloxacina</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>Sulfametizol</td>
			<td>27</td>
			<td>Epirrubicina</td>
		</tr><tr><td>13</td>
			<td>Sulfamenometoxina</td>
			<td>28</td>
			<td>Pamoato de pirvinio</td>
		</tr><tr><td>14</td>
			<td>Cefoxitina</td>
			<td>29</td>
			<td>Moxifloxacina</td>
		</tr><tr><td>15</td>
			<td>Novobiocina</td>
			<td>30</td>
			<td>Troleandomicina</td>
		</tr><tr><td>16</td>
			<td>Cefmetazol</td>
			<td>31</td>
			<td>Lincomycin</td>
		</tr><tr><td>17</td>
			<td>Roxitromicina</td>
			<td>32</td>
			<td>Espiramicina</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista dos compostos testados no ensaio de infecção. Os compostos validados na etapa 4 foram testados no ensaio de infecção (etapa 5).
A toxicidade dos compostos para macrófagos infectados com Mab foi o primeiro parâmetro avaliado. O limite estabelecido para considerar um composto como tóxico ou não tóxico foi de 85% de macrófagos viáveis (Figura 5). Dos vinte e oito compostos testados, 4, 5, 6, 27 e 28 foram considerados tóxicos. (Figura 5). Assim, esses cinco compostos foram excluídos da seguinte avaliação da atividade intramacrofágica.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> Figura 5: Toxicidade de hits para macrófagos infectados com Mab. BMMs de camundongos BALB/c foram infectados com Mab (MOI=1) e incubados com cada hit previamente identificado a 13,3 μM, 6,66 μM e 3,3 μM (1,3%, 0,7% e 0,3% de DMSO, respectivamente) por 48 h a 37 °C com 7% de CO2. As células foram visualizadas em um microscópio de fluorescência de triagem de alto conteúdo, usando o número de núcleos (corados com DAPI) para medir a viabilidade celular. O gráfico mostra as porcentagens de macrófagos infectados tratados viáveis em relação aos macrófagos infectados viáveis não tratados de dois experimentos independentes. Os símbolos redondos representam a viabilidade da célula para cada ensaio. As barras representam a média de dois experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para inferir a atividade intramacrofágica dos vinte e três compostos restantes contra o Mab intracelular (Figura 6), a fórmula Mycoload (explicada anteriormente na etapa 6) foi usada para obter a porcentagem de viabilidade micobacteriana normalizada para macrófagos infectados não tratados. A maioria dos compostos perdeu seu potencial terapêutico contra micobactérias internalizadas (Figura 6) em comparação com o ensaio de validação de acertos (Figura 4), pois o número de acertos reduziu de vinte e cinco para seis na concentração mais alta testada. Surpreendentemente, todos os três compostos que aumentaram a viabilidade do Mab planctônico em comparação com bactérias não tratadas (30, 31 e 32; Figura 3 e Figura 4) apresentaram atividade antimicobacteriana contra Mab intracelular, com os compostos 30 e 32 apresentando diferença estatisticamente significativa quando comparados ao DMSO, mesmo a 3,3 μM no caso do composto 32 (Figura 6). As micobactérias tratadas com os compostos 11 e 23 apresentaram viabilidade &lt;50% a 13,3 μM; no entanto, isso não foi significativamente diferente do controle DMSO (Figura 6). Os compostos 21, 26 e 29 foram potentes o suficiente a 13,3 μM para justificar uma diferença estatística significativa, sendo 29 o mais ativo (Figura 6). Por fim, os compostos 17, 22 e 25 foram extremamente potentes em todas as concentrações testadas contra micobactérias internalizadas. Estes foram identificados como roxitromicina, claritromicina e rifabutina, respectivamente (Tabela 1). Dos três compostos, a claritromicina foi a mais ativa contra o Mab, com viabilidade micobacteriana nunca ultrapassando 10%, apresentando um valor de p &lt;0,0001 em todas as concentrações testadas em comparação com o DMSO (Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> Figura 6: Atividade intramacrofágica de Hits contra macrófagos infectados com Mab. BMMs de camundongos BALB/c foram infectados com Mab (MOI=1) e incubados com cada acerto previamente identificado a 13,3, 6,66 e 3,3 μM (1,3, 0,7 e 0,3% de DMSO, respectivamente) por 48 h a 37 °C com 7% de CO2. As células foram visualizadas em um microscópio de fluorescência de triagem de alto conteúdo e o sinal fluorescente foi usado para calcular o Mycoload (consulte a etapa 6). O gráfico mostra as porcentagens de Mycoload encontradas em macrófagos infectados tratados em relação a macrófagos infectados não tratados em dois experimentos independentes. A estatística foi realizada por meio de ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Dunnet; *, p &lt; 0,05; **, p &lt; 0,01; , p &lt; 0,001; , p &lt; 0,0001 em comparação com o DMSO (controle de solventes). Os asteriscos seguem o mesmo código de cores para cada concentração que a legenda do gráfico. Os símbolos redondos representam o Mycoload para cada ensaio. As barras representam a média de dois experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Exemplo de um layout de placa de 384 poços usado na avaliação do fator Z'. White - poços em branco (apenas meio de crescimento líquido); amarelo - controle positivo (bactérias tratadas com antibiótico); vermelho - controle negativo (bactérias não tratadas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Exemplo de um layout de placa de 384 poços usado na triagem da biblioteca. White - poços em branco (apenas meio de crescimento líquido); verde - controle de solventes; vermelho - controle negativo (bactérias não tratadas); azul - compostos a serem rastreados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Exemplo de um layout de placa de 384 poços usado para validação de acerto. White - poços em branco (apenas meio de crescimento líquido); verde - controle de solventes (em duplicatas); vermelho - controle negativo (bactérias não tratadas); azul - compostos a serem rastreados (em duplicatas). As cores desbotadas representam diluições seriais 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 4: Exemplo de um layout de placa de 96 poços usado para um ensaio de infecção. Branco - poços em branco (água para evitar a evaporação); vermelho - controle negativo (macrófagos não tratados); amarelo - controle positivo (macrófagos tratados com antibiótico); verde - controle de solventes; azul - compostos a serem testados. As cores desbotadas representam diluições seriais 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 5: Protocolo de análise de imagem. Um protocolo detalhado de análise de imagens é utilizado neste trabalho, que pode ser adaptado para software de código aberto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

assay-development-for-high-throughput-drug-screening-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Um ensaio para avaliar a eficácia do medicamento contra um modelo de infecção por Mycobacterium tuberculosis

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

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Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

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Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

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