Name: Perfil do pH luminal em organoides gastrointestinais tridimensionais usando microeletrodos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a medir o pH luminal em organoides gástricos humanos usando microeletrodos para estudar a fisiologia epitelial e infecção por Helicobacter pylori. Este método oferece leituras precisas em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer à Dra. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart e Bengisu Kilic por seu trabalho anterior e assistência com os microssensores O2 ; Andy Sebrell pelo treinamento em cultura organoide e micromanipulação; Lexi Burcham pela assistência na cultura de organoides, preparação de meios, registro de dados e organização; e Dra. Susy Kohout para aconselhamento geral em eletrofisiologia. Gostaríamos de agradecer à Dra. Heidi Smith por sua assistência com imagens e reconhecer o Centro de Engenharia de Biofilme Bioimaging da Universidade Estadual de Montana, que é apoiado por financiamento do Programa de Ressonância Magnética da National Science Foundation (2018562), do MJ Murdock Charitable Trust (202016116), do Departamento de Defesa dos EUA (77369LSRIP e W911NF1910288) e do Montana Nanotechnology Facility (um membro do NNCI apoiado pelo NSF Grant ECCS-2025391).
Agradecimentos especiais a toda a equipe da Unisense que tornou este trabalho possível, especialmente ao Dr. Andrew Cerskus, Dra. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dra. Line Daugaard, Dra. Karen Maegaard e Mette Gammelgaard. O financiamento para o nosso estudo foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 GM13140801 (DB, RB) e UL1 TR002319 (KNL), e um Prêmio de Expansão de Pesquisa do Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento Econômico da Universidade Estadual de Montana (DB). A Figura 1A foi criada com o BioRender.

Este protocolo requer organoides 3D de pelo menos 200 μm de diâmetro que tenham um lúmen distinto e que estejam embutidos em uma matriz extracelular artificial (ECM, por exemplo, Matrigel). Os tecidos gástricos humanos para derivação de organoides foram obtidos com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Montana State University e consentimento informado de pacientes submetidos a endoscopia digestiva alta na Bozeman Health (protocolo # 2023-48-FCR, para DB) ou como amostras isentas de gastrectomia total do estômago inteiro ou gastrectomia vertical do National Disease Research Interchange (protocolo #DB062615-EX). As informações sobre as linhas organoides e os números de passagem usados para este estudo são fornecidas na Tabela 1, e a composição do meio está listada na Tabela 2. Consulte os protocolos publicados anteriormente para a geração e manutenção de linhas organoides gastrointestinais 6,26,27.
1. Preparação de organoides gástricos humanos para perfis de pH
<ol><li>Inicie e mantenha culturas organoides gástricas usando protocolos padrão. Mantenha organoides em placas de 24 poços em 500 μL de meio de expansão por poço (Tabela 2). A passagem estabeleceu linhas organoides a cada 5-7 dias, transferindo-se para um prato de fundo de vidro de 35 mm em preparação para experimentos de perfil de pH. NOTA: As culturas organoides para nossos experimentos são derivadas de preparações de glândulas gástricas, que são obtidas de tecido adulto, conforme descrito acima. Usamos um método de digestão do tecido colagenase para isolar essas glândulas antes de serem suspensas na MEC, conforme descrito anteriormente 25,28,29.</li>
	<li>A partir de culturas organoides em crescimento ativo nas passagens 1-15, selecione poços que contenham pelo menos 100 organoides (aproximadamente 2 milhões de células) com diâmetros entre 200 e 700 μm para transferência e expansão em placas de Petri de 3,5 mm.</li>
	<li>Ao preparar organoides para revestimento (etapas 1.4-1.8), deixe alíquotas de matriz extracelular (ECM) descongelar no gelo por pelo menos 45 min. Mantenha o ECM no gelo durante todo este protocolo para evitar a gelificação. Pré-aqueça as placas de cultura de células colocando-as em uma incubadora de CO2 a 37 °C, 5%.</li>
	<li>Remova o meio dos poços e colha as culturas organoides gástricas pipetando PBS gelado em cada gota de ECM e arranhando o gel com a ponta de uma pipeta P1000. Pipetar o PBS com os fragmentos de ECM contendo organoides para um tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugue o tubo a 200 × g a 4 °C durante 5 min. Os fragmentos de MEC que contêm os organoides serão visíveis como uma camada no fundo do tubo. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e pipete 350 μL de tripsina-EDTA a 0,25% em cada tubo, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo. Incubar os tubos em banho-maria a 37 °C durante 2-5 min.</li>
	<li>Após a incubação com tripsina-EDTA, adicione 600 μL de DMEM gelado com penicilina/estreptomicina a cada tubo e pipete vigorosamente para cima e para baixo pelo menos 40x. Centrifugar a 200 × g a 4 °C durante 5 min. Aspire o sobrenadante. Para configurar culturas para medições de pH, ressuspenda o pellet celular em ECM líquido gelado a uma proporção de 1:4 v/v de pellet organoide para ECM para reforço.</li>
	<li>Para cada amostra, colocar 40 μL de ECM líquido contendo organoides/fragmentos de organoides em uma linha horizontal fina ao longo do diâmetro de um prato com fundo de vidro de 35 mm. NOTA: Dispensar o gel na placa em uma linha em vez de uma gota redonda permite um acesso mais fácil a organoides individuais, afinando a cultura.</li>
	<li>Deixe o gel polimerizar por 15-30 min; em seguida, adicione cuidadosamente 2 mL de meio de expansão organoide à placa, pipetando ao longo da borda do poço para evitar perturbar o gel.</li>
	<li>Substitua a mídia a cada dois dias. Aguarde de 4 a 8 dias para que um mínimo de 10 organoides cresça até um diâmetro mínimo de 400 μm.</li>
	<li>Para prosseguir com um experimento de perfil de pH, certifique-se de que cada cultura contenha pelo menos 10 organoides que atendam aos seguintes critérios: >200 μm de diâmetro, aparência saudável (pouco ou nenhum material escuro visível dentro dos organoides observados com um microscópio de campo claro) e não superlotado por outros organoides.</li>
</ol>2. Desembalagem e calibração de microeletrodos
NOTA: Para permitir medições em microescala, um eletrodo de referência separado é usado além do microeletrodo do sensor de pH, em vez de usar um design integrado (e, portanto, mais volumoso). Tanto o microeletrodo de pH quanto o eletrodo de referência devem ser armazenados úmidos. Não permita a exposição ao ar por mais de 10 minutos de cada vez. Determine o tamanho apropriado da ponta para a aplicação. Aqui, usamos um microeletrodo potenciométrico de pH com diâmetro de ponta chanfrada de 25 μm.
<ol><li>Com o microeletrodo ainda em seu tubo de proteção, inspecione visualmente a ponta quanto a danos.</li>
	<li>Conecte o eletrodo de referência ao cabo do eletrodo de pH através do conector. Em seguida, conecte o microeletrodo ao amplificador e o amplificador a um PC aterrado com o software por meio de um cabo USB (Figura 1A).</li>
	<li>Encha dois tubos cônicos de 50 mL 2/3 com etanol a 70% e H2O deionizado (diH2O). Coloque o microeletrodo e o eletrodo de referência no tubo diH2O, certificando-se de que ambas as pontas pareçam submersas pelo menos 1 cm no líquido. NOTA: Copos altos também podem ser usados para esta e outras etapas semelhantes.</li>
	<li>Deixe os eletrodos se equilibrarem por ~ 10 min. NOTA: O procedimento também pode ser pausado nesta etapa e retomado posteriormente, pois os eletrodos podem ser armazenados em diH2O.</li>
	<li>Enquanto os eletrodos estão se equilibrando, abra o software (ícone vermelho) na estação de trabalho do computador. Na guia Configurações, certifique-se de que a caixa ao lado do microeletrodo esteja marcada, indicando que ele está conectado corretamente e reconhecido pelo software. Clique em Iniciar experimento no canto superior esquerdo da janela e insira o nome e o destino do arquivo desejados. Na janela Configurações de calibração e experimento do sensor , clique em Limpar todos os pontos para preparar o software para uma nova calibração.</li>
	<li>Encha dois tubos cônicos de 50 mL 2/3 com tampões de calibração de pH 4,01 e pH 9,21. Seque suavemente o tubo de proteção e o eletrodo de referência com um delicado lenço de laboratório.</li>
	<li>Começando com os eletrodos no tampão de pH 4,01, insira 4,01 como o valor de pH conhecido. Assim que a leitura de mV se estabilizar, selecione adicionar ponto. Confirme se o sinal está estável em ~380 mV. Depois que a ponta for adicionada, coloque os dois eletrodos de volta em diH2O para enxaguar e seque novamente.</li>
	<li>Repita a etapa anterior com o buffer 9.21 e clique em adicionar ponto quando o sinal estiver estável (~83 mV). Verifique se os microeletrodos respondem linearmente entre pH 4,01 e 9,21; portanto, apenas uma curva de calibração de dois pontos é necessária. Certifique-se de que a linha resultante entre esses pontos tenha uma inclinação negativa de 50-70 mV/unidade de pH. Clique em Salvar e usar calibração. NOTA: Agora você está pronto para começar a registrar as medições30.</li>
</ol>3. Perfil de pH de organoides gástricos humanos
NOTA: O protocolo a seguir é descrito para um usuário destro. CUIDADO: Desative todas as opções de economia de energia em seu PC, pois as medições contínuas serão interrompidas se o PC entrar no modo de suspensão.
<ol><li>Monte um suporte de anel com um grampo no lado esquerdo de um estereomicroscópio para segurar o eletrodo de referência. Posicione um micromanipulador preso a um suporte de laboratório pesado no lado direito do microscópio (Figura 1A).</li>
	<li>Remova cuidadosamente o microeletrodo de seu estojo de proteção, colocando-o na bancada e puxando o estojo em um movimento rápido e rápido. CUIDADO: Os microeletrodos são incrivelmente frágeis e deve-se tomar cuidado para garantir que a ponta não entre em contato com material rígido e sólido. Para obter melhores resultados, realize medições em uma bancada robusta, livre de equipamentos que possam causar vibração da bancada ou movimento indesejado dos eletrodos.</li>
	<li>Monte o microeletrodo em um micromanipulador e organize o estereoscópio e o micromanipulador de forma que o microeletrodo possa avançar em direção à placa de cultura sem atingir a objetiva ou outras partes do microscópio.</li>
	<li>Posicione a placa de cultura contendo os organoides para ter uma visualização adequada do primeiro organoide a ser perfilado (Figura 1B).</li>
	<li>Prenda levemente o eletrodo de referência ao clamp no suporte do anel à esquerda do estereoscópio. Posicione o eletrodo de referência de forma que fique no meio ao redor do ECM. Tome cuidado para garantir que isso não interrompa os organoides à medida que o estágio é movido entre as medições.</li>
	<li>Olhando diretamente para a placa de cultura (não para o microscópio), avance a ponta do microeletrodo até que esteja suficientemente submerso no meio. Na guia Registrador de dados no software, clique no botão Iniciar (triângulo único apontando para a direita) para iniciar a gravação. Certifique-se de que a caixa de seleção Calibrado esteja marcada no lado direito da tela. NOTA: Aguarde ~ 10 s para que cada leitura se estabilize antes de avançar para a próxima região.</li>
	<li>Antes de entrar no ECM, certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja visível ao microscópio e que esteja posicionada para avançar linearmente em direção ao primeiro organoide de interesse. Avance lentamente o eletrodo para dentro do gel, sem entrar em contato com nenhum organoide. Registre pelo menos três leituras de pH e calcule a média.</li>
	<li>Posicione o microeletrodo de forma que esteja preparado para avançar em direção ao primeiro organoide de interesse ao longo do eixo perpendicular à superfície. Deixe o eletrodo fazer um pequeno recuo na superfície epitelial sem penetrar (Figura 1C). NOTA: Esta etapa também fornecerá informações sobre se o organoide permanecerá no lugar ou se ele pode se mover mais livremente no ECM.</li>
	<li>Com um movimento rápido, avance o microeletrodo para dentro do organoide. Se o organoide se mover ao redor do microeletrodo ou se afastar, tente um ângulo ligeiramente diferente ou apoie-o em outro organoide ou na borda de plástico ao redor do fundo da lamínula do prato. Meça o pH luminal (três vezes individuais) de 10 organoides diferentes para cada condição experimental. Quando terminar de registrar as medições, clique no botão quadrado Parar. CUIDADO: Estime o diâmetro do organoide para decidir até onde avançar o eletrodo no lúmen do organoide, tomando cuidado para não perfurá-lo. Para maior precisão, meça o diâmetro com o software da câmera do seu microscópio, se disponível. NOTA: Se a ponta do microeletrodo ficar visivelmente revestida com detritos após uma ou várias medições, lave o microeletrodo em solução de dissociação celular, PBS, EtOH e, em seguida, diH2O antes de prosseguir.</li>
</ol>4. Perfil motorizado (opcional)
NOTA: Esta opção requer um micromanipulador montado em um estágio de motor mecânico, que é controlado por software de computador por meio de um controlador de motor31.
<ol><li>Abra o software de criação de perfil (ícone marrom) e inicie um novo experimento na guia Criação de perfil .</li>
	<li>As configurações do eixo z reconhecerão automaticamente o motor quando um aparelho do motor estiver conectado corretamente. NOTA: O movimento nas direções x e y ainda é controlado manualmente com esta configuração.</li>
	<li>Localize a guia Interação do perfil30. Antes de iniciar, certifique-se de que é possível fazer a transição rápida para olhar para a ocular do microscópio para garantir a entrada do organoide na distância desejada. Vá para Configurações de perfil e faça o seguinte:<ol><li>Indique que a distância inicial é 0 μm. CUIDADO: Se a casca epitelial for particularmente resistente a um determinado organoide, o organoide pode ser empurrado para longe ou deformado em vez de penetrado. Se for o caso, continue avançando o eletrodo, mas observe o ponto em que a entrada ocorre, pois o software não pode registrar isso automaticamente.</li>
		<li>A julgar pelo tamanho do organoide que está sendo perfilado, indique uma distância final que não seja superior a 3/4 do diâmetro estimado de um organoide. NOTA: Esta etapa específica foi projetada para evitar danos à ponta do eletrodo.</li>
		<li>Indique o tamanho desejado do passo - 100 μm, conforme mostrado na Figura 2E. Certifique-se de que o tamanho mínimo do passo corresponda ao tamanho da ponta do eletrodo (por exemplo, 25 μm para uma ponta de eletrodo de pH 25 μm 25).</li>
		<li>Indique uma posição segura para a qual o motor retornará a ponta do eletrodo entre os perfis. NOTA: Esta deve ser uma altura confortável acima da amostra (fora do organoide) onde o sensor pode ser movido com segurança para os lados nas direções x e y com o micromanipulador manual. Deixe o Ângulo do sensor em sua configuração padrão.</li>
		<li>Para permitir que o eletrodo se equilibre, indique pelo menos 3 s em Aguarde antes da(s) medida(s).</li>
		<li>Defina o (s) período(s) de medição para pelo menos 1 s. As medições durante este período serão calculadas em média. NOTA: Se estiver realizando medições em um ambiente com alto ruído elétrico, pode ser útil indicar um período mais longo.</li>
		<li>Defina o Atraso entre(s) para pelo menos 1 s.</li>
		<li>Defina o número preferencial de réplicas a serem medidas em cada profundidade.</li>
		<li>Comece a registrar as medições pressionando o botão Iniciar .</li>
	</ol></li>
</ol>5. Limpeza de eletrodos
<ol><li>Coloque o eletrodo a ser limpo de volta em seu tubo de proteção.</li>
	<li>Lave os eletrodos com diH2O após as medições.</li>
	<li>Lave os eletrodos com etanol a 70% por alguns minutos.</li>
	<li>Enxágue os eletrodos com tampão de pH 4,01.</li>
	<li>Enxágue os eletrodos mais uma vez com diH2O antes de prosseguir com as medições.</li>
</ol>6. Armazenamento de eletrodos
NOTA: Ambos os eletrodos devem ser armazenados em temperatura ambiente em um local de baixa atividade, protegido contra danos acidentais.
<ol><li>Depois de usar o microeletrodo de pH, deslize-o cuidadosamente horizontalmente de volta ao tubo de proteção (deslizando ao longo da bancada do laboratório para suporte horizontal).</li>
	<li>Segurando o microeletrodo na posição vertical (ponta apontada para cima), encha suavemente o tubo de proteção com água estéril. Conecte o tubo de proteção com a rolha que acompanha o eletrodo. Certifique-se de que todos os orifícios no tubo de proteção estejam vedados com fita isolante. Armazene em uma caixa à prova de estilhaços até o próximo uso. NOTA: Recomenda-se usar a caixa original em que os eletrodos vieram, pois ela conterá inserções protetoras projetadas para manter os eletrodos no lugar quando armazenados.</li>
	<li>Armazene o eletrodo de referência em um béquer ou cilindro graduado cheio com uma solução 3M KCl. Cobrir o copo/cilindro graduado com parafilme para evitar a evaporação da solução. NOTA: Se estiver usando um cilindro graduado, é recomendável prendê-lo à bancada do laboratório com fita adesiva para evitar movimentos acidentais.</li>
</ol>7. Injeção de vermelho de metila (opcional)
NOTA: O vermelho de metila é um corante indicador colorimétrico que pode ser usado para validar as medições de microeletrodos.
<ol><li>Preencha um capilar de vidro de 2 μL com óleo mineral estéril, carregue-o em um autoinjetor nL controlado por micromanipulador e, em seguida, encha-o com uma solução contendo 0,02% de vermelho de metila e 150 mM de HCl. NOTA: A solução deve aparecer vermelha / rosa enquanto estiver no capilar devido à acidez do HCl.</li>
	<li>Injectar organoides de pelo menos 300 μm de diâmetro com 9,2 μl da solução25.</li>
	<li>Capture imagens ou vídeos usando uma câmera adaptada ao estereomicroscópio (Figura 2G).</li>
</ol>

Medição precisa do pH luminal em organoides gástricos 3D com microeletrodos

<ol><li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+spatial+omics+dissects+organoid+biomimicry%5BTitle%5D)+AND+%22GEN+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry.</a> GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3d+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems.</a> Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Achberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+organoid+and+organ-on-a-chip+technology+to+generate+complex+multi-layer+tissue+models+in+a+human+retina-on-a-chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform.</a> Elife. 8, e46188(2019).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+JA+%22Organoids+and+Mini-organs%22">Organoids and Mini-organs</a>. Davies, J. A., Lawrence, M. L. , Academic Press. Ch. 1-2 3-40 (2018).</li>
<li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS One. 15 (4), e0231423(2020).</li>
<li>Williams, S. E., Turnberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+pH+gradient+across+mucus+adherent+to+rabbit+gastric+mucosa%3A+Evidence+for+a+%27mucus-bicarbonate%27+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier.</a> Gut. 22 (2), 94-96 (1981).</li>
<li>Schubert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gastric secretion.</a> Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).</li>
<li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+gastric+mucin+exhibits+a+pH-dependent+sol%E2%88%92gel+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+pH-dependent+errors+in+spectrophotometric+pH+measurements+of+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater.</a> Marine Chemistry. 223, 103801(2020).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+promotes+gastric+fundus+specification+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans.</a> Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).</li>
<li>Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+high+resolution+color+ratiometric+planar+optode+imaging+approach%3A+Application+to+oxygen+and+ph+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).</li>
<li>Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+nanosensors+for+ratiometric+monitoring+of+three-dimensional+oxygen+gradients+in+laboratory+and+clinical+pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).</li>
<li>Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional-printed+electrochemical+multiwell+plates+for+monitoring+food+intolerance+from+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sens%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids.</a> ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).</li>
<li>pH and reference electrode manual. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf</a> (2023).</li>
<li>Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+indigenous+nitrate+reducing+sulfide+oxidizing+activity+in+microaerophilic+wastewater+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms.</a> PLoS One. 11 (2), 0149096(2016).</li>
<li>Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-entrapped+staphylococcus+aureus+bacteria+as+models+of+biofilm+infection+exhibit+growth+in+dense+aggregates%2C+oxygen+limitation%2C+antibiotic+tolerance%2C+and+heterogeneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).</li>
<li>Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusive+boundary+layers%2C+photosynthesis%2C+and+respiration+of+the+colony-forming+plankton+algae%2C+phaeocystis+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp.</a> Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).</li>
<li>Kolpen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrous+oxide+production+in+sputum+from+cystic+fibrosis+patients+with+chronic+pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> PLoS One. 9 (1), 84353(2014).</li>
<li>Murphy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+tension+within+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids.</a> J R Soc Interface. 14 (127), 20160851(2017).</li>
<li>Sebrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gastric+spheroid+co-culture+model+reveals+chemokine-dependent+recruitment+of+human+dendritic+cells+to+the+gastric+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), e153 157-171 (2019).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3d+culturing+of+organoids+from+murine+intestinal+crypts+and+a+single+stem+cell+for+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research.</a> J Vis Exp. (194), e65219(2023).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+vitrogel%28%28r%29%29+organoid-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Sebrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+analysis+of+human+gastric+epithelial+spheroids+reveals+spontaneous+rupture%2C+rotation+and+fusion+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events.</a> Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).</li>
<li>Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf</a> (2023).</li>
<li>Microprofiling system user manual. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf</a> (2023).</li>
<li>Wolffling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egf+and+bmps+govern+differentiation+and+patterning+in+human+gastric+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands.</a> Gastroenterology. 161 (2), e616 623-636 (2021).</li>
<li>Boccellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarised+epithelial+monolayers+of+the+gastric+mucosa+reveal+insights+into+mucosal+homeostasis+and+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection.</a> Gut. 68 (3), 400-413 (2019).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li>
<li>Schumacher, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li>
<li>Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/products/ph-microelectrode/">https://unisense.com/products/ph-microelectrode/</a> (2024).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+promotes+gastric+fundus+specification+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans.</a> Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).</li>
<li>Schreiber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+ph+in+the+secreting+canaliculus+of+the+gastric+parietal+cell+and+adjacent+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures.</a> Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).</li>
<li>Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nhe8+plays+important+roles+in+gastric+mucosal+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).</li>
<li>Gawenis, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+gastric+acid+secretion+in+mice+with+a+targeted+disruption+of+the+nhe4+na%2B%2Fh%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger.</a> J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).</li>
<li>Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physics-based+model+for+maintenance+of+the+ph+gradient+in+the+gastric+mucus+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer.</a> Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).</li>
<li>Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deeper+understanding+of+intestinal+organoid+metabolism+revealed+by+combining+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28flim%29+and+extracellular+flux+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses.</a> Redox Biol. 30, 101420(2020).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).</li>
<li>Guimera, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+invasive+microsensor+specially+designed+for+simultaneous+dissolved+oxygen+and+ph+biofilm+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling.</a> Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O acesso limitado ao espaço luminal dos organoides restringiu severamente nossa compreensão da dinâmica fisiológica desse microambiente. Uma ferramenta confiável para análises funcionais da fisiologia luminal expandirá nossa capacidade de alavancar organoides como modelos in vitro para fisiologia, farmacologia e pesquisa de doenças. Os organoides são modelos fisiologicamente relevantes e altamente ajustáveis, com potencial adicional para replicar a variabilidade genética na população humana. Os métodos existentes para medição de pH dentro do lúmen organoide têm usado corantes ou nanopartículas sensíveis ao pH, métodos que muitas vezes devem ser acoplados à microscopia de fluorescência ou espectroscopia 16,17,37. O método de perfil baseado em microssensores descrito fornece uma nova rota para medir o pH intraluminal de organoides gastrointestinais com nova precisão espacial. Nosso método demonstra medição consistente e confiável do pH luminal organoide gastrointestinal, bem como evidências de um gradiente de pH. Em experimentos não publicados, confirmamos a expressão dos genes da família SLC SLC4A2 e 26A7, que são conhecidos por serem responsáveis pela secreção de bicarbonato, bem como SLC9A3, 9A4 e 9A8, que são responsáveis pela troca de prótons (Figura Suplementar S1) 38 , 39 , 40 , 41. Nossos estudos sugerem uma predominância de secreção de bicarbonato e uma falta de células parietais em nossos organoides, o que pode explicar a alcalinidade.
É importante garantir que os microeletrodos usados sejam adequados para o microperfil organoide - isso inclui selecionar o diâmetro correto da ponta. Tentamos pontas de 25 μm e 50 μm e obtivemos resultados semelhantes (Figura 2A), mas decidimos avançar com o tamanho menor da ponta de acordo com o conselho do fabricante, pois esperava-se que fosse menos invasivo e fornecesse uma resolução espacial mais alta, pois as medições são calculadas em média na área da ponta chanfrada. Como desvantagem, no entanto, pontas menores são mais frágeis. O tamanho do organoide deve ser considerado na determinação da resolução espacial desejada.
Uma etapa crítica no protocolo foi garantir a capacidade de distinguir entre o pH intraluminal organoide do pH na ECM e, posteriormente, no meio de cultura circundante. Seria de se esperar uma quantidade razoável de fluxo de metabólitos para dentro e para fora dos organoides42. Esperamos que o pH de um organoide seja influenciado por seu ambiente e descobrimos que os organoides eram consistentemente menos alcalinos do que seus arredores em seis experimentos independentes (Figura 2D). Além disso, a estabilidade é tão importante na criação de perfis quanto durante a calibração do sensor.
Espera-se que os organoides derivados de tecidos exibam um certo grau de variabilidade de doador para doador, por isso é essencial traçar o perfil de qualquer linha organoide na linha de base antes de aplicar qualquer intervenção experimental, como tratamento medicamentoso43. Nossa hipótese é que as flutuações no pH dentro de qualquer cultura organoide podem ser devidas a gradientes iônicos locais em microescala e à distribuição heterogênea do muco luminal, conforme determinado por imunofluorescência e coloração imuno-histoquímica (dados não publicados). As variações observadas no pH entre linhas e passagens de organoides individuais podem ser devidas a diferenças individuais na composição celular e na atividade secretora dos organoides. Também descobrimos que algumas linhas organoides eram inerentemente mais difíceis de penetrar do que outras. Da mesma forma, alguns podem perder sua integridade estrutural e colapsar com a entrada do eletrodo (Figura Suplementar S2 e Vídeo Suplementar S1). Isso não parece estar associado à passagem de organoides, mas foi observado mais comumente em organoides com mais de ~ 1,5 mm de diâmetro. Em estudo anterior, mostramos que o muco no interior dos organoides estava distribuído de forma heterogênea29. Devido a essa heterogeneidade, torna-se difícil determinar se (ou até que ponto) a distribuição do muco afetou uma medição.
Os microssensores são ferramentas minimamente invasivas que podem traçar o perfil da fisiologia intraluminal organoide com alta velocidade e alta resolução espacial. Esses sensores também não perturbam gradientes químicos e são minimamente sensíveis à turbulência no microambiente de interesse. O design pequeno é possível separando o eletrodo do sensor do eletrodo de referência - as sondas de pH de laboratório padrão combinam esses dois eletrodos, levando a um tamanho maior. Nanossensores ópticos de pH e O2 para medições intracelulares foram desenvolvidos pelo grupo Cash da Colorado School of Mines e tiveram sucesso na medição de metabólitos em modelos de camundongos e biofilmes. Devido à heterogeneidade no lúmen organoide, no entanto, esses sensores podem levar a resultados ininterpretáveis17. McCracken et al. analisaram o pH luminal em organoides gástricos derivados de células-tronco embrionárias injetando SNARF-5F e visualizando o corante sensível ao pH com microscopia confocal em tempo real37. Notavelmente, as medições relatadas por McCracken foram altamente semelhantes aos valores de pH obtidos em nosso estudo atual (Figura 2B, C). Nossa técnica talvez possa ser aplicada em uma arquitetura monocamada, com uma configuração mais vertical como no perfil de biofilme, embora isso possa representar um risco de danificar os eletrodos44. Estudos futuros também podem envolver medições sequenciais de pH ao longo de vários dias para avaliar as mudanças associadas ao desenvolvimento celular. Como os organoides de tamanho médio geralmente se recuperam e cicatrizam após a sondagem, um organoide poderia, teoricamente, ser sondado várias vezes, desde que a esterilidade das culturas possa ser mantida. À medida que refinamos nossa compreensão da dinâmica do pH em modelos organoides, a resolução espacial deve ser uma prioridade para o mapeamento preciso do microambiente 3D complexo e historicamente inacessível.
Em resumo, este protocolo fornece um método detalhado para medições precisas de pH com alta resolução espaço-temporal usando microeletrodos de pH montados em um micromanipulador e um estereomicroscópio. Este método foi validado com organoides humanos derivados de células-tronco adultas e é adequado para organoides epiteliais de pelo menos 200 μm de diâmetro que tenham um lúmen distinto. Prevemos que, ao selecionar microeletrodos alternativos, esse método pode ser facilmente adaptado a outros tipos de organoides e à medição de compostos alternativos, como NO ou O2.

Organoides - estruturas multicelulares em miniatura derivadas de células-tronco - revolucionaram nossa capacidade de estudar a fisiologia humana e estão começando a substituir modelos animais, mesmo em ambientes regulatórios1. Desde a descrição inicial dos organoides intestinais por Sato et al. em 2009, a tecnologia organoide tornou-se imensamente popular2. Um grande número de estudos caracterizou a composição celular e a função dos modelos organoides em grande detalhe 3,4,5,6. No entanto, o espaço luminal dessas estruturas multicelulares 3D permanece em grande parte indefinido 7,8. O lúmen é a cavidade central de organoides derivados de tecidos mucosos que é circundada pelas porções apicais de células epiteliais polarizadas. Como a secreção e absorção celular ocorrem predominantemente na superfície epitelial apical, o microambiente luminal dos organoides é controlado por esses importantes processos fisiológicos. Os modelos organoides usados atualmente demonstram variações nos padrões de sinalização celular, stemness geral, gradientes de concentração de metabólitos e condições ambientais9. Compreender a fisiologia luminal organoide é, portanto, necessário para a modelagem precisa da função e patologia dos órgãos. Infelizmente, a relativa inacessibilidade do lúmen dificulta significativamente as análises funcionais da fisiologia luminal em organoides 3D10.
A capacidade de examinar os perfis de pH é especialmente importante no estômago, que é notório por ter o gradiente de prótons mais acentuado do corpo, variando de aproximadamente 1-3 no lúmen, a quase neutro no epitélio 11,12,13. Permanece uma lacuna significativa em nossa compreensão da manutenção em microescala do gradiente de pH gástrico e a relevância dos modelos organoides na recapitulação desse ambiente dinâmico através da camada de muco gástrico. As abordagens tradicionais para a análise do pH organoide têm envolvido o uso de corantes sensíveis ao pH, que podem ser indicadores fluorescentes ou colorimétricos. McCracken et al. usaram uma injeção luminal de SNARF-5F - um indicador de pH raciométrico - em organoides para analisar uma queda no pH luminal em resposta ao tratamento com histamina. Esses corantes podem ser incorporados ao meio de cultura, permitindo o monitoramento não invasivo e em tempo real do pH. Não apenas os corantes sensíveis ao pH requerem etapas de calibração complexas que contribuem para a baixa confiabilidade e precisão das medições, mas esses corantes também tendem a operar dentro de faixas de detecção específicas que podem não ser representativas de toda a faixa de pH dentro do microambiente de interesse14,15. Pode ser considerado razoável, no entanto, usar corantes indicadores para experimentos confirmatórios. Nanossensores ópticos que usam abordagens de detecção de pH baseadas em optode fluorescente também foram desenvolvidos; no entanto, tais técnicas de detecção requerem imagens microscópicas e também são suscetíveis a fotobranqueamento, fototoxicidade e viés de imagem16,17. Além disso, Brooks et al. têm placas multipoços impressas em 3D contendo microeletrodos sobre os quais os organoides podem ser revestidos18. Essa abordagem, no entanto, não permite medições diretamente dentro do lúmen organoide.
As medições de pH baseadas em eletrodos podem obter maior precisão em comparação com outros métodos, além de fornecer monitoramento de pH em tempo real. Além disso, os eletrodos de pH montados em micromanipuladores permitem uma resolução espacial superior das medições de pH, pois a localização precisa da ponta do eletrodo pode ser controlada com precisão. Isso permite a maior flexibilidade e reprodutibilidade possíveis nas análises de modelos organoides. Os eletrodos usados aqui são microeletrodos de pH miniaturizados que operam com base na difusão de prótons através de vidro de pH seletivo que envolve um fino fio de platina. O microeletrodo é conectado a um eletrodo de referência Ag-AgCl externo e, em seguida, conectado a um milivoltímetro de alta impedância. O potencial elétrico entre as duas pontas dos eletrodos, quando submersas na mesma solução, refletirá o pH da solução19. Tais sistemas de microperfil têm sido usados na análise metabólica de biofilmes20,21, algas planctônicas22, amostras de escarro humano23 e até mesmo em esferoides de células-tronco mesenquimais24. Tanto nosso laboratório quanto Murphy et al. já usaram microeletrodos de O2 controlados por micromanipuladores para avaliar as concentrações de oxigênio nos espaços luminais dos organoides. Murphy et al. emparelharam este método com modelagem matemática para revelar um gradiente de oxigênio dentro de seus esferóides. Nosso grupo foi capaz de encontrar níveis reduzidos de oxigênio luminal em organoides gástricos derivados de tecidos em comparação com a matriz extracelular circundante25.
Aqui, fornecemos um método detalhado para o perfil manual de microeletrodos do pH luminal em organoides esféricos do trato gastrointestinal que permitirá uma compreensão fisiológica aprimorada de seu complexo microambiente luminal. Prevemos que essa técnica adicionará uma nova dimensão à exploração da fisiologia organoide por meio de medições em tempo real e de alta resolução dos níveis de pH em microescala. Além disso, o protocolo a seguir pode ser facilmente adaptado para a análise de O2, N2O, H2, NO, H2S, redox e temperatura em vários tipos de modelos organoides. O perfil fisiológico serve como uma ferramenta valiosa para otimizar as condições de cultura de organoides para melhor imitar ambientes in vivo , aumentando assim a relevância e a utilidade dos modelos organoides na pesquisa biomédica.

<table><tbody><tr><td>3 M KCl</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta sorológica oscilante-não, embalada individualmente, papel/plástico, saco, estéril</td><td>CellTreat</td><td>229091B</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipeta sorológica oscilante-não, embalada individualmente, papel/plástico, saco, estéril</td><td>CellTreat</td><td>229092B</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL - rack de espuma, estéril</td><td>CellTreat</td><td>229412</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos de 24 Poços, CellTreat Estéril</td><td></td><td>229124 Pipeta</td><td></td></tr><tr><td>Sorológica Oscilante de 25 mL, Embalada Individualmente, Papel/Plástico, Saco, Estéril</td><td>CellTreat</td><td>229093B</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 35 mm | Nº 1.5 Lamínula | Diâmetro do vidro de 20 mm | Tubo</td> de Centrífuga <td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td>50 mL Não Revestido</tr><tr><td>- Rack de Espuma, Estéril</td><td>CellTreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>BP82031GAL</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Cell Strainer, Embalado Individualmente, Esterilizado</td><td>CellTreat</td><td>229483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &micro; L Pontas de Pipeta de Baixa Retenção de Comprimento Estendido, Rack, Estéril</td><td>Solução</td><td>CellTreat 229037</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone)</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>Nuaire&nbsp;</td><td>NU-425-600</td><td>Classe II Tipo A / B3</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Fisher Biorreagentes</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de recuperação celular</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Solução de dissociação celular</td></tr><tr><td>DMEM / F-12 (DMEM avançado)</td> <td>Gibco</td><td>12-491-015</td><td></td></tr><tr><td>Modificação de Dulbecco do meio de águias (DMEM)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15017CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfato</td><td>Corning</td><td>30-234-CR</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Gentamicina</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Ácido Livre</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>HP Pavillion 2-em-1 14" Laptop Intel Core i3</td><td>HP</td><td>M03840-001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Incubadora Científica</td><td>A144C-212</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11676604</td><td></td></tr><tr><td>Câmera iPhone 12</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Grande Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicados Limpadores de Tarefa, 1-Ply</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>M 205 FA Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Matrigel 354234</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>MC-1 UniMotor Controlador</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metil vermelho</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MM33 Micromanipulador</td><td>Marzhauser Wetzlar</td><td>61-42-113-0000</td><td>Destro</td></tr><tr><td>MS-15 Estágio Motorizado</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject-II</td><td>Autoinjetor de nanolitros</td> <td>Drummond</td><td>3-000-204</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>pH Microeletrodos</td><td>Unisense</td><td>50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160</td><td>O software SensorTrace não é compatível com computadores Apple</td></tr><tr><td>Eletrodo de referência</td><td>Unisense</td><td>REF-RM-001652</td><td>O software SensorTrace não é compatível com Computadores Apple</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de câmera para smartphone</td><td>Gosky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Especificações Suporte de laboratório LS</td><td>Unisense</td><td>LS-009238</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,025%, vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>UniAmp</td><td>Unisense</td><td>11632</td><td></td></tr><tr><td>United Biosystems Inc&nbsp; RASPADORES DE CÉLULAS MINI 200/PK</td><td>Fisher</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris Bioscience</td><td>12-541-0</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Kit de Calibração do Sensor</td><td>Unisense/ Mettler Toledo</td><td>51-305-070, 51-302-069</td><td>pH 4,01 e 9,21, pacotes de 20 mL</td></tr></tbody></table>

perfil do ph luminal em organoides gastrointestinais tridimensionais usando microeletrodos

Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes

A otimização e caracterização detalhada de modelos organoides gastrointestinais requerem métodos avançados para analisar seus ambientes luminais. Este artigo apresenta um método altamente reprodutível para a medição precisa do pH dentro do lúmen de organoides gástricos humanos 3D por meio de microeletrodos controlados por micromanipuladores. Os microeletrodos de pH estão disponíveis comercialmente e consistem em pontas de vidro chanfradas de 25 μm de diâmetro. Para medições, o microeletrodo de pH é avançado no lúmen de um organoide (>200 μm) que é suspenso em Matrigel, enquanto um eletrodo de referência repousa submerso no meio circundante na placa de cultura. 
Usando esses microeletrodos para traçar o perfil de organoides derivados do corpo gástrico humano, demonstramos que o pH luminal é relativamente consistente dentro de cada poço de cultura em ~ 7,7 ± 0,037 e que medições contínuas podem ser obtidas por um mínimo de 15 min. Em alguns organoides maiores, as medições revelaram um gradiente de pH entre a superfície epitelial e o lúmen, sugerindo que as medições de pH em organoides podem ser alcançadas com alta resolução espacial. Em um estudo anterior, microeletrodos foram usados com sucesso para medir as concentrações luminais de oxigênio em organoides, demonstrando a versatilidade desse método para análises de organoides. Em resumo, este protocolo descreve uma ferramenta importante para a caracterização funcional do complexo espaço luminal dentro de organoides 3D.

A secreção de ácido é uma função crucial do estômago humano. No entanto, até que ponto a secreção ácida pode ser modelada em organoides ainda é uma questão de debate 6,32,33,34. Portanto, desenvolvemos o protocolo detalhado acima para medir com precisão a produção de ácido em organoides gástricos. Notavelmente, usamos organoides derivados de células-tronco adultas não estimuladas cultivadas em condições de expansão padrão que foram passadas várias vezes, o que levou à perda de células parietais35. Portanto, a presença de células parietais secretoras de ácido e liberação de ácido ativo não era esperada em nosso sistema modelo.
Para nossos experimentos, usamos organoides com diâmetros entre 200 μm e 1.000 μm semeados em placas com fundo de vidro. Primeiro, testamos dois tamanhos diferentes de ponta para os microeletrodos - um pH-25 com um diâmetro de ponta de 25 μm e um pH-50 com um diâmetro de ponta de 50 μm. Conforme mostrado na Figura 2A, não houve diferença significativa entre as medidas obtidas com as ponteiras menores em comparação com as maiores. Curiosamente, o pH basal nos organoides tendia a ser ligeiramente alcalino em ~ pH 8. Usando a ponta de pH-25 de 25 μm, avaliamos a variação do pH luminal dentro de diferentes dez organoides mantidos na mesma placa de cultura, com três medidas obtidas de cada organoide (Figura 2B). Dentro de uma placa, o pH luminal de organoides individuais apresentou apenas variações leves e não significativas (8,16 ± 0,12; p ≥0,0445-0,99) (Figura 2B). Também comparamos as medições de pH intraluminal em cinco linhas organoides diferentes com passagens variando de 3 a 16 (Figura 2C). Novamente, encontramos medições de pH consistentes em cada cultura, mas variabilidade significativa entre as linhas organoides. No entanto, o pH luminal geralmente permaneceu entre pH 7,3 e pH 8,2, dentro de uma ordem de magnitude, e não houve tendência aparente para o pH médio ao comparar os números de passagem precoce e tardia (Figura 2C). Em seguida, perguntamos se o pH do lúmen organoide estava diretamente relacionado ao pH do meio de expansão organoide e da matriz extracelular (MEC). A comparação entre o meio, a ECM ao redor dos organoides e o lúmen do organoide revelou diferenças significativas no pH, com o pH luminal dos organoides menor que o da ECM e o pH da ECM menor que o dos meios de expansão organoide circundantes (Figura 2D), sugerindo que o pH luminal dos organoides era fisiologicamente relevante e não diretamente determinado pelo ambiente de cultura. Em seis experimentos independentes, medimos um pH luminal médio que estava próximo do neutro em 7,13 ± 0,09.
Um micromanipulador motorizado foi utilizado para obter medidas de pH do lúmen organoide com maior resolução espacial. Essa abordagem é relevante se o pH ou outros gradientes dentro do lúmen organoide cheio de muco29 precisarem ser registrados. A Figura 2E mostra duas séries representativas de medições de pH em organoides grandes (&gt;1.000 μm de diâmetro), demonstrando o ponto de entrada em cada organoide e terminando a uma profundidade de ~ 800 μm. Como os dois organoides perfilados não tinham o mesmo diâmetro, as medidas não são imediatamente comparáveis. Independentemente disso, mostramos evidências de um ligeiro gradiente de pH de Δ0,6 entre a superfície epitelial e o lúmen organoide mais profundo (Figura 2E). Para determinar a viabilidade de realizar medições de pH nos organoides ao longo do tempo, o que permitiria medições das respostas ao tratamento em tempo real, registramos o pH intraluminal dentro de um organoide representativo por aproximadamente 20 min e descobrimos que a leitura permaneceu altamente consistente após um período inicial de adaptação (Figura 2F). Para validar as medidas de pH luminal com um método independente, usamos um corante colorimétrico sensível ao pH (vermelho de metila) que injetamos no lúmen organoide usando um autoinjetor de nanolitro montado em micromanipulador (Figura 2G). A coloração amarela do corante confirmou que o lúmen organoide tinha um pH &gt;6,2, consistente com as medidas de microeletrodos que mostraram um pH quase neutro. No geral, esses resultados representativos ilustram a viabilidade e a reprodutibilidade de medições de pH baseadas em microeletrodos em culturas organoides.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do método. (A) Diagrama esquemático da configuração do perfil. O microeletrodo na Figura 1A foi retirado do site da Unisense. 36 (B) Imagem representativa da cultura organoide pronta para perfilagem, ECM circundante e mídia circundante (barra de escala = 5 mm). (C) Exemplo de posicionamento correto do microeletrodo na preparação para sondagem de organoides (barra de escala = 500 μm). Abreviatura: ECM = matriz extracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig02.jpg"> Figura 2: Validação do perfil de microssensores em organoides gástricos humanos. (A) Comparação de medições de pH de lúmen médio usando pontas de microeletrodos de 25 μm (pH-25) e 50 μm (pH-50). Dados de 10 organoides individuais, cada um de um único experimento representativo. (B) Três medições de pH replicadas foram obtidas para 10 organoides individuais. ANOVA de uma via com comparações múltiplas (p = 0,1229). (C) as medições de pH obtidas com um eletrodo de pH-25 são consistentes dentro de cada uma das cinco linhas organoides analisadas em diferentes números de passagem; 4-10 organoides medidos por linha com base no tamanho e disponibilidade. ANOVA de uma via com comparações múltiplas (p &lt; 0,0001). (D) Medições de pH dentro de organoides gástricos e o Matrigel e meios circundantes (n = 6 experimentos independentes). Medidas obtidas pela penetração de organoides epiteliais gástricos com um pH 25. Cada ponto de dados é a média de 10 medições de pH individuais dentro de um único organoide. ANOVA de uma via (p &lt; 0,0001). (E) Perfis de pH epitelial para lúmen de dois organoides representativos usando um micromanipulador motorizado. (F) Estabilidade do pH ao longo do tempo (~ 19,8 min) em um organoide representativo. (G) Microinjeção de corante indicador de pH vermelho de metila e HCl no lúmen organoide gástrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Doador</td>
		</tr><tr><td>Figura</td>
			<td>Linha</td>
			<td>Passagem</td>
			<td>Sexo</td>
			<td>Idade</td>
			<td>Etnia</td>
		</tr><tr><td>2A</td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2B</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>44</td>
			<td>Desconhecido</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2C</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2D</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Desconhecido</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>37</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Desconhecido</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>31</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>H</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>9</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2E</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>43</td>
			<td>Desconhecido</td>
		</tr><tr><td>2º andar</td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>33</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>2G</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Meio de expansão organoide gástrico humano (L-WRN)</td>
		</tr><tr><td>L-WRN meio condicionado</td>
			<td>50%</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avançado</td>
			<td>37%</td>
		</tr><tr><td>Soro fetal bovino</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>L-glutamina</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Anfotericina B</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Buffer HEPES</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>Y-27632</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>SB-431542</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2.
Figura suplementar S1: Expressão do transportador de íons em organoides gástricos humanos. Números relativos de cópias normalizados para 18S rRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240425%20Supplemental%20Figure%201%20Revised.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S2: Organoide gástrico humano com arquitetura deformada após punção com a sonda do microssensor de pH. Barra de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo Suplementar S1: Tentativa malsucedida de criação de perfil em uma cultura de organoide gástrico. O microeletrodo de pH de 25 μm é avançado manualmente em direção ao organoide de interesse. Após uma tentativa fracassada devido a um erro de julgamento do ângulo, um ângulo diferente é tentado e é revelado que o organoide não possui a integridade estrutural para ser perfilado (a estrutura esférica não é resistente e se deforma com a penetração com o eletrodo). O usuário então redireciona para tentar um organoide diferente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O presente protocolo descreve medidas de pH em organoides gástricos derivados de tecidos humanos usando microeletrodos para caracterização espaço-temporal da fisiologia intraluminal.

Perfil do pH luminal em organoides gastrointestinais tridimensionais usando microeletrodos

The optimization and detailed characterization of gastrointestinal organoid models require advanced methods for analyzing their luminal environments. This ...

profiling-luminal-ph-three-dimensional-gastrointestinal-organoids

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotï¿½ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Os ritmos circadianos, que existem na maioria dos organismos, regulam a organização temporal dos processos biológicos. Os organoides 3D surgiram recentemente como um modelo in vitro fisiologicamente relevante. Este protocolo descreve o uso de repórteres bioluminescentes para observar ritmos circadianos em organoides, possibilitando investigações in vitro de ritmos circadianos em sistemas multicelulares.

Monitoramento de oscilações circadianas com um repórter de bioluminescência em organoides

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Apresentamos um protocolo passo a passo para imagens tridimensionais de alta resolução, sem rótulos e tridimensionais usando holotomografia de baixa coerência. Este protocolo detalha a preparação da cultura de organoides, aquisição de imagens e análise computacional de imagens, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica estrutural e respostas a medicamentos em organoides vivos.

Imagens 3D de alta resolução e sem rótulos e análise de aprendizado de máquina de organoides intestinais por meio de holotomografia de baixa coerência

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

Aprenda a medir o pH luminal em organoides gástricos humanos usando microeletrodos para estudar a fisiologia epitelial e infecção por Helicobacter pylori. Este método oferece leituras precisas em tempo real.

Perfil do pH luminal em organoides gastrointestinais tridimensionais usando microeletrodos

Explorar mais vídeos