Name: Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Aprenda a construir comunidades de biofilme multiespécies a partir de solo da rizosfera usando sementes de pepino. Este método padronizado avança biofertilizantes de segunda geração para aplicações agrícolas sustentáveis.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (42307173 e 42107328) e pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (2022YFD1500202 e 2022YFF1001800). P.W, Z.X projetou o estudo. P.W, B.X, Z.C, J.X e N.Z analisaram os dados e criaram as figuras. P.W escreveu o primeiro rascunho do manuscrito. Z.X., R.Z. e Q.S. revisaram o manuscrito.

Este protocolo é geralmente aplicável à microbiota do solo rizosférico de várias plantas. Aqui, o pepino é usado como exemplo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento bacteriano
<ol><li>Isolamento do solo da rizosfera<ol><li>Cultura do pepino<ol><li>Desinfete as sementes de pepino com etanol a 75% e solução de hipoclorito de sódio (NaClO) a 2% e enxágue-as em água estéril11.</li>
			<li>Germinar as sementes em condições estéreis e selecionar aquelas que atingem o estágio12 de duas folhas. Posteriormente, transplante as mudas de pepino germinadas consistentemente em vasos contendo 2 kg de terra preta. NOTA: Dois tipos de solo preto de diferentes locais no nordeste da China são usados para reduzir erros sistemáticos.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparação da suspensão do solo<ol><li>Preparar o tampão PBS-S utilizando a formulação: 6,33 g de NaH2PO4· H2O, 16,5 g de Na2HPO4·7H2O, 200 μL de Silwet L-77 e 1 L de água destilada.</li>
			<li>Quando as mudas atingirem o estágio12 de quatro folhas, inverta o vaso e isole as raízes junto com o solo da rizosfera de 2 mm de espessura usando luvas esterilizadas.</li>
			<li>Coloque as raízes em 30 mL de tampão PBS-S em um tubo de centrífuga de 50 mL. Após agitar por 20 min, filtrar a suspensão através de um filtro de células de nylon de 100 μm para remover raízes e sedimentos grandes.</li>
			<li>Transferir o filtrado para outro tubo de centrifugação de 50 ml, centrifugá-lo a 3200 x g durante 15 min à temperatura ambiente e conservá-lo temporariamente a 4 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Extração de células bacterianas do solo da rizosfera. NOTA: Esta metodologia adota o método de centrifugação diferencial13, embora o método de centrifugação com gradiente de densidade de Nycodenz14 também se aplique a esta etapa.<ol><li>Diluir a suspensão do solo com uma solução de 0,2% de Na4P2O7 para 500 mL e centrifugar a 1.000 x g por 10 min para separar inicialmente os organismos do solo.</li>
		<li>Homogeneizar novamente o precipitado, centrifugá-lo na mesma velocidade baixa por 60 s e repetir o processo três vezes. Combine os sobrenadantes, centrifugue-os a 12.000 x g por 20 min e depois descarte o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o precipitado em 50 mL de tampão PBS-S, constituindo a suspensão de células bacterianas do solo da rizosfera.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sequenciamento e identificação da microbiota do biofilme da rizosfera
<ol><li>Preparação de mídia NOTA: Os meios de caldo de soja tríptico (TSB) e glutamato de glicerol de sais mínimos (MSgg) estão disponíveis comercialmente. As formulações abaixo são apenas para referência.<ol><li>Prepare o meio TSB usando a seguinte formulação: 15 μg / mL de triptona, 5 μg / mL de peptona de soja, 5 μg / mL de NaCl, pH = 7.</li>
		<li>Prepare o meio MSgg usando a seguinte formulação: 5 mM KH2PO4, 100 mM de ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino) (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM de tiamina, 0,5% de glicerol, 0,5% de glutamato, 50 μg/mL de triptofano, 50 μg/mL de fenilalanina, pH = 7.</li>
		<li>Para preparar o meio TSB-MSgg, misture o meio TSB com o meio MSgg na proporção de 1:1 (v/v)15.</li>
	</ol></li>
	<li>Cocultura de biofilme de película<ol><li>Incubar a suspensão celular em meio TSB a 30 °C durante a noite (geralmente 12 h) para ativar a bactéria.</li>
		<li>Coloque filtros de células de nylon de 100 μm em placas de 24 poços. Incube as bactérias em meio TSB e estabeleça três repetições. Cultivar o biofilme da película durante 36 h a 30 °C. NOTA: Se o biofilme da película da última etapa não for bem cultivado, o meio TSB-MSgg é um substituto eficaz para o meio TSB.</li>
		<li>Remova o filtro que contém o biofilme da película. Adicione 2 mL de tampão PBS-S a uma nova placa de células de 24 poços, coloque o filtro de 24 poços nela para lavar o biofilme e remova as células livres. Repita o processo de lavagem três vezes.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de DNA de biofilme de película<ol><li>Extraia o genoma do biofilme usando um kit de DNA seguindo as instruções do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Sequenciamento de alto rendimento NOTA: As empresas de biotecnologia podem ajudar a concluir experimentos de sequenciamento para a maioria dos laboratórios. Se for necessária a composição microbiana na solução restante, sequencie-a nesta etapa. A etapa de sequenciamento varia de acordo com os instrumentos. Por favor, siga as instruções do fabricante. A etapa 2.4.1 é apenas para referência.<ol><li>Amplificar as regiões V3-V4 do gene 16S rRNA com base no banco de dados com sequências completas do gene 16S rRNA. Criar OTUs de espécies de acordo com o número mínimo de sequências por amostra16. Agrupe as anotações de classificação de espécies e adquira as composições das comunidades de cada amostra.</li>
		<li>Com base nos dados de sequenciamento, selecione as cinco principais cepas em termos de abundância relativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e cultura bacteriana de alto rendimento NOTA: Esta etapa é projetada de acordo com a mais recente metodologia microbiológica e bioinformática17. O método de placa revestida por diluição está disponível para isolamento bacteriano aqui, embora seja mais demorado e menos direcionado em comparação com as técnicas de alto rendimento.<ol><li>Misture o biofilme cultivado. Use diluição limitante para garantir que não mais do que 30% dos poços na placa de 24 poços apresentem crescimento bacteriano. NOTA: Para determinar a diluição mais adequada, realize experimentos preliminares usando uma ampla gama de taxas de diluição. A diluição ideal não deve conter mais do que duas bactérias cultiváveis por mililitro, representando a incubação bacteriana em menos de 30% dos poços.</li>
		<li>Amplifice o gene 16S rRNA da bactéria enquanto adiciona rótulos para os poços e placas e sequencie-os usando a plataforma Illumina17 de alto rendimento.</li>
		<li>Realizar análises de bioinformática usando software disponível comercialmente para obter informações taxonômicas de pureza e espécies para cada cultura.</li>
		<li>Cultive as cinco principais bactérias puras abundantes por cultura de linha contínua e use glicerol para preservar as bactérias a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Construção de comunidades microbianas sintéticas
<ol><li>Cultura de biofilme reconstruída NOTA: Para obter detalhes, consulte Ren et al.18. As 5 cepas correspondem a 31 combinações sintéticas, incluindo 5 consórcios de uma única espécie, 10 de duas espécies, 10 de três espécies, 5 de quatro espécies e 1 de cinco espécies.<ol><li>Incube as 5 cepas no meio TSB até que seu OD600 atinja 1 para ativá-las.</li>
		<li>Prepare várias placas de 24 poços com meio TSB e coloque filtros de células de nylon de 100 μm sobre elas. NOTA: Se o biofilme da última etapa não for bem cultivado, o meio TSB-MSgg é um substituto eficaz para o meio TSB.</li>
		<li>Incubar as 31 combinações de comunidades sintéticas no meio. Certifique-se de que o número de bactérias da inoculação seja consistente em cada poço. Configure três repetições para cada combinação.</li>
		<li>Cultivar o biofilme a 30 °C durante 36 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação do biofilme da película<ol><li>Siga o mesmo procedimento da etapa 2.2.3.</li>
		<li>Transfira o biofilme para uma nova placa de 24 poços contendo 180 μL de solução de cristal violeta e core-o por 20 min.</li>
		<li>Transfira a amostra corada para outra placa de 24 poços contendo 200 μL de etanol a 96%, elua por 30 min e meça OD590.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Quantificação do número de células da película
NOTA: Para determinar a proporção de cada espécie e a contagem de células na película e na solução restante, é necessária uma PCR quantitativa. Para obter detalhes, consulte Sun et al.16.
<ol><li>Projete primers específicos para as comunidades microbianas sintéticas selecionadas.</li>
	<li>Use Roary para realizar comparações de genoma e descobrir os genes de cópia única específicos da cepa de cada isolado. Certifique-se de que os primers sejam direcionados a esses genes.</li>
	<li>Ligue os fragmentos amplificados para plasmídeos PMD19T. Gere curvas padrão usando os plasmídeos que contêm fragmentos correspondentes como modelos.</li>
	<li>Siga as mesmas etapas mencionadas na etapa 2.2.</li>
	<li>Prepare os componentes da reação da seguinte forma: 7,2 μL de H2O, 10 μL de 2x qPCR Master mix, 0,4 μL de 10 μM de cada primer e 2 μL de DNA molde.</li>
	<li>Realize a PCR com um instrumento de PCR em tempo real nas seguintes condições: 95 °C por 10 min, 40 ciclos de 95 °C por 30 s e 60 °C por 45 s, seguidos por um segmento de curva de fusão padrão.</li>
	<li>Realizar seis repetições biológicas para cada tratamento.</li>
</ol>

Desenvolvimento de biofilmes multiespécies sinérgicos a partir do solo da rizosfera

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+community+structure+of+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Anatomy and community structure of the rhizosphere.</a> Rhizosphere. , 11-34 (1990).</li>
<li>Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome+and+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome and plant health.</a> Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-growth-promoting+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-growth-promoting rhizobacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).</li>
<li>Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+bacteria+in+the+rhizo-+and+endosphere+of+plants%3A+Their+role%2C+colonization%2C+mechanisms+involved+and+prospects+for+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.</a> Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).</li>
<li>Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocontrol+of+Bacillus+subtilis+against+infection+of+Arabidopsis+roots+by+Pseudomonas+syringae+is+facilitated+by+biofilm+formation+and+surfactin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production.</a> Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).</li>
<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-microbiome+interactions%3A+From+community+assembly+to+plant+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+velezensis+stimulates+resident+rhizosphere+Pseudomonas+stutzeri+for+plant+health+through+metabolic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions.</a> ISME J. 16, 774-787 (2021).</li>
<li>Pandhal, J., Noirel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+ecosystems+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial ecosystems for biotechnology.</a> Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).</li>
<li>Grosskopf, T., Soyer, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial communities.</a> Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).</li>
<li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana.+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+of+the+Arabidopsis+leaf+and+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.</a> Nature. 528, 364-369 (2015).</li>
<li>Bakken, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+bacteria+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of bacteria from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).</li>
<li>Yang, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+extraction+from+fresh+and+stored+soil+samples%3A+Impact+on+microbial+viability+and+community+compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions.</a> Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).</li>
<li>Ren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+multispecies+biofilm+formation+and+quantitative+PCR-based+assessment+of+individual+species+proportions%2C+useful+for+exploring+interspecific+bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions.</a> Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interactions+affect+the+biomass+of+synthetic+bacterial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities.</a> mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cultivation+and+identification+of+bacteria+from+the+plant+root+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota.</a> Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).</li>
<li>Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+biofilm+synergy+among+bacterial+soil+isolates+in+cocultures+indicates+bacterial+interspecific+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation.</a> ISME J. 9, 81-89 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).</li>
<li>Palková, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+microorganisms%3A+Laboratory+versus+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions%3A+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Seguindo o protocolo, uma série de comunidades robustas de biofilmes sintéticos multiespécies são construídas com base na microbiota no solo da rizosfera de diferentes plantas. Usando técnicas de PCR quantitativas, a composição de cada comunidade é decifrada claramente. A biomassa do biofilme indica a força de suas potenciais interações metabólicas, embora várias propriedades e mecanismos por trás da cooperação não possam ser revelados aqui19. Dado o tamanho e a complexidade das comunidades microbianas naturais, as comunidades sintéticas (SynComs) representam um sistema modelo para superar os obstáculos existentes14. Este protocolo destaca a metodologia sistemática e fundamental de construção de comunidades de biofilme sintético a partir da microbiota complexa do solo da rizosfera.
É evidente na última parte que SQR9, XL-1 e XL-2 mostram forte potencial para colonização estável na rizosfera real. Os pesquisadores podem começar a investigar as relações metabólicas e os mecanismos de co-colonização com base nessas cepas. Pesquisas subsequentes sobre inoculantes microbianos para pepino também estão acessíveis posteriormente.
Apesar das vantagens mencionadas, é importante não ignorar as desvantagens do protocolo. Devido às diferenças entre a cultura de laboratório e as condições in situ , os resultados de cada comunidade sintética podem não representar com precisão a microbiota no solo da rizosferareal 20. A confirmação por meio de inoculação adicional da rizosfera é necessária. Além disso, a reprodutibilidade desses resultados é relativamente pobre. As espécies de biofilme de película em laboratório podem ter sofrido mutações ao longo de muitas gerações em comparação com os tipos selvagens no solo, levando a algumas imprecisões incontroláveis.
Existem várias alternativas para certas etapas do protocolo. Por exemplo, na etapa 1.2, o método de centrifugação com gradiente de densidade de Nycodenz é relativamente mais eficiente para coletar amostras de células do solo13. Além disso, na etapa 2.4, o mais recente cultivo de alto rendimento e a identificação de bactérias aumentam significativamente a eficiência experimental, embora a um custo mais alto. Portanto, o método tradicional de placa revestida por diluição permanece adequado para selecionar algumas espécies. Finalmente, na etapa 3.2, a biomassa do biofilme cultivado pode ser avaliada tanto pela coloração violeta de cristal quanto pela pesagem direta em uma balança analítica.
Este protocolo vai além da mera criação de materiais experimentais básicos para pesquisa microbiana e ambiental. Identificar as comunidades de biofilme multiespécies bacterianas sintéticas mais robustas é apenas o primeiro passo para desvendar o ecossistema aberto e complexo da rizosfera. Ao se concentrar nas principais espécies de SynComs, os pesquisadores podem obter informações sobre situações reais in situ de maneira mais direcionada e rápida. Essa abordagem também pode oferecer uma nova perspectiva para explorar biofilmes em maior escala, como agregados de solo rizosférico, e para o gerenciamento preciso das comunidades microbianas da rizosfera para o crescimento e a saúde das plantas21.
Mais significativamente, esta metodologia lançará luz sobre pesquisas futuras sobre interações interespécies que governam a assembléia e a dinâmica da microbiota do solo da rizosfera. Por exemplo, ao lidar com uma comunidade complexa da rizosfera, outros métodos analíticos, como análise de rede de co-ocorrência ou modelagem metabólica em escala de genoma15 , são frequentemente combinados com essas etapas fundamentais para construir artificialmente uma comunidade representativa de biofilme. Isso inclui considerações sobre relações entre espécies.

Os biofilmes representam comunidades microbianas intrincadas afixadas em superfícies ou ligadas a interfaces. Há um amplo reconhecimento de que a maioria das bactérias encontradas em vários ambientes, como habitats naturais, ambientes clínicos e contextos industriais, perduram dentro de comunidades de biofilme1. No solo, a rizosfera - abrangendo a superfície da raiz e sua região adjacente de 2 mm de espessura - forma um nicho ecológico com maior disponibilidade de nutrientes. Bactérias específicas desenvolveram estratégias para explorar esse nicho, promovendo a proliferação microbiana e promovendo a formação de comunidades de biofilme na rizosfera2.
Os micróbios da rizosfera são considerados o 'segundo genoma' das plantas3. Os microrganismos promotores de crescimento vegetal (PGPM) se envolvem em simbiose mutualística com as plantas, proporcionando funções significativas de promoção do crescimento e biocontrole4. Por um lado, o PGPM pode fornecer nutrientes às raízes das plantas, aumentar a absorção de nutrientes, defender contra patógenos e degradar poluentes no solo da rizosfera5. Por outro lado, o PGPM utiliza exsudatos radiculares de plantas como fonte de nutrientes para crescimento e evolução, influenciando assim o solo da rizosfera e o sistema radicular por meio de seu próprio metabolismo. Vale ressaltar que o pré-requisito para todas essas funções é a colonização efetiva do PGPM na rizosfera vegetal, formando biofilmes estáveis6.
O biofilme da rizosfera afeta o processo de montagem dos micróbios da rizosfera, e as características temporais e espaciais da montagem dos micróbios da rizosfera estão intimamente relacionadas à interação do biofilme multiespécie7. Ele serve como o centro de interações planta-microbioma, fornecendo um nicho estável e controlável para que elas interajam de forma eficaz. Portanto, estudar o biofilme da rizosfera também é uma direção importante para obter informações sobre a interação entre plantas e micróbios.
No entanto, atualmente há pouca pesquisa sobre biofilmes multiespécies da rizosfera. A alta complexidade da composição do microbioma torna difícil responder a questões ecológicas fundamentais em torno das comunidades microbianas naturais8. No processo de experimentos, muitas condições, como tipo de solo, tipo de planta e o grande número de comunidades microbianas, precisam ser consideradas. Vários fatores limitam a pesquisa de biofilmes multiespécies da rizosfera.
Para investigar ainda mais as comunidades de biofilme multiespécies do solo da rizosfera, como interações sinérgicas interespécies ou alimentação cruzada de metabólitos8, é desejável construir artificialmente uma comunidade microbiana sintética simplificada, representativa, estável e tratável em condições de laboratório 9,10. Aqui, um protocolo padronizado combina várias das mais recentes técnicas microbiológicas e bioinformáticas.

<table><tbody><tr><td>0,2% Na4P2O7 solução</td><td>Sinopharm Reagent Chemical Co., Ltd.</td><td>20041418</td><td>Usado para diluir a suspensão do solo.</td></tr><tr><td>100 μ m Filtro de Célula de Nylon</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F613463-0001</td><td>Usado para filtrar a solução de cultura e separar o biofilme da película.</td></tr><tr><td>Solução de NaClO a 2%</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>L03336903</td><td>Usado para esterilizar as sementes.</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>Usado para cultivo micobiano e separação de biofilme de película.</td></tr><tr><td>Ácido sulfônico propano 3-(N-morfolino) (MOPS)</td><td>Bioolook Pesquisa Científica</td><td>2360010</td><td>Especial Usado para preparar meios MSgg.</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Pequim Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>Tubos de centrífuga de tamanho adequado para o nosso protocolo.</td></tr><tr><td>75% C2H5OH solução</td><td>Sinopharm Reagent Químico Co., Ltd.</td><td>801769680</td><td>Usado para esterilizar as sementes.</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>Universidade Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td><td>Cepas isoladas do solo da rizosfera.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>Universidade Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td><td>Cepas isoladas do solo da rizosfera.</td></tr><tr><td>Kit de DNA de bactérias</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>Usado para extrair DNA bacteriano.</td></tr><tr><td>Solo preto I</td><td>Universidade Agrícola de Nanjing</td><td>N / A</td><td>Solo preto da província de Jilin.</td></tr><tr><td>Solo Preto II</td><td>Universidade Agrícola de Nanjing</td><td>N / A</td><td>Solo preto da província de Heilongjiang.</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>Universidade Agrícola de Nanjing</td><td>N/A</td><td>Cepas isoladas do solo da rizosfera.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10035048</td><td>Usado para preparar mídia MSgg.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>Centrífuga de alta velocidade.</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd.</td><td>Q311-02</td><td>Usado para amplificação de DNA em qPCR.</td></tr><tr><td>Banco limpo</td><td>Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.</td><td>NB026143</td><td>Usado para operação asséptica.</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co., Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margem: auto; "></td><td>Usado para cultivo microbiano.</td></tr><tr><td>Corante Violeta Cristal</td><td>Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.</td><td>A600331</td><td>Usado para coloração e quantificação de biofilme de película.</td></tr><tr><td>Semente de pepino</td><td>Universidade Agrícola de Nanjing</td><td>N / A</td> <td>"Jinchun I" semente de pepino.</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>O Instituto de Genética e Biologia do Desenvolvimento da Academia Chinesa de Ciências</td><td>N / A</td><td>Usado para cultivo e identificação bacteriana do solo rizosférico de alto rendimento</td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td>Usado para preparar meios MSgg.</td></tr><tr><td>Geladeira</td><td>Hefei Midea Refrigerator Co., Ltd.</td><td>BCD-556WKPM (Q)</td> <td>Usado para preservação de tensões.</td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Bioolook Pesquisa Científica</td><td>2180020</td><td>Especial Usado para preparar mídia MSgg.</td></tr><tr>O <td>reagente químico Co. de Glycerol Sinopharm, Ltd</td><td>10010618</td><td>usado para preparar meios MSgg.</td><td></td></tr><tr><td>Cesta de plantio hidropônico</td><td>Yulv Furniture Store</td><td>6526262626</td><td>Usado para hidroponia de pepino.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10017618</td><td>Usado para preparar mídia MSgg.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>7791186</td><td>Usado para preparar mídia MSgg.</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd.</td><td>10400101</td><td>Usado para preparar mídia MSgg.</td></tr><tr><td>Msgg Médio</td><td>Xangai Bioesn Biotechnology Co., Ltd.</td><td>BES20791KB</td><td>Meio de cultura de biofilme de película.</td></tr><tr><td>Na2HPO4· 7H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9390-100G</td><td>Usado para preparar mídia TSB.</td></tr><tr><td>NaCI</td><td>Chinasun Produtos Especiais co., Ltd.</td><td>HS0416</td><td>Usado para preparar mídia TSB.</td></tr><tr><td>NaH2PO4· H2O</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>S9638-25G</td><td>Usado para preparar mídia TSB.</td></tr><tr><td>PBS-S Buffer</td><td>Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>Tampão básico para tecidos vivos.</td></tr><tr><td>Fenilalanina</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>Usado para preparar meios MSgg.</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>Usado para inoculação de cepas.</td></tr><tr><td>PMD19T Plasmídeo</td><td>Takara Biomedical Technology (Pequim) Co., Ltd.</td><td>D102A</td><td>Usado para gerar curvas padrão qPCR.</td></tr><tr><td>Pote</td><td>Sinopharm Reagente Químico Co., Ltd.</td><td>YHHWS2401</td><td>Usado para cultura de solo de pepino.</td></tr><tr><td>Primer para qPCR</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Usado para amplificação de DNA em qPCR.</td></tr><tr><td>Instrumento de PCR em tempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td><td>4484073</td><td>Usado para realizar qPCR em biofilme de película selecionado.</td></tr><tr><td>Roary</td><td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td><td>N / A</td><td>Usado para projetar primers de qPCR</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd</td><td>ZQTY-50S</td><td>Usado para mistura de solução e cultivo microbiano.</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cytiva Bio-tecnologia (Hangzhou) Co., Ltd.</td><td>SL77080596</td><td>Usado para preparar mídia TSB.</td></tr><tr><td>Peptona de soja</td><td>Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd</td><td>HB8275</td><td>Usado para preparar meios TSB.</td></tr><tr><td>Instrumento Co. da análise de Shanghai Yidian</td> do <td>espectrophotometer</td>, Ltd.<td>76713100010</td><td>Usado para a quantificação violeta do cristal do biofilme da película.</td></tr><tr><td>Água estéril</td><td>Sinopharm Reagente Químico Co., Ltd.</td><td>SW150302</td><td>Usado para lavar o biofilme da película.</td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo esterilizadas</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>223016852LLZA</td><td>Usado para operações experimentais básicas.</td></tr><tr><td>Modelo de DNA</td><td>Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Usado para amplificação de DNA em qPCR.</td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Bioolook Pesquisa Científica</td><td>2180020</td><td>Especial Usado para preparar meios MSgg.</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Usado para preparar meios TSB.</td></tr><tr><td>Triptofano</td><td>Bioolook Pesquisa Científica</td><td>2190020</td><td>Especial Usado para preparar meios MSgg.</td></tr><tr><td>TSB Médio</td><td>Guangdong Huankai Microbial Sci. &amp; Tech. Co., Ltd.</td><td>024048</td><td>Meio bacteriano de amplo espectro.</td></tr><tr><td>TSB-Msgg Meidium</td><td>Nanjing Agricultural University</td><td>N/A</td><td>Meio misto para cultura de biofilme de película com aplicabilidade mais ampla.</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>C0310520123</td><td>Usado para preparar mídia MSgg.</td></tr></tbody></table>

uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

O biofilme multiespécie é um estilo de vida natural e dominante de bactérias na natureza, inclusive no solo da rizosfera, embora a compreensão atual seja limitada. Aqui, fornecemos uma abordagem para estabelecer rapidamente comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies. O primeiro passo é extrair células do solo da rizosfera usando o método de centrifugação diferencial. Posteriormente, essas células do solo são inoculadas no meio de cultura para formar biofilme de película. Após 36 h de incubação, a composição bacteriana do biofilme e a solução abaixo são determinadas usando o método de sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA. Enquanto isso, o isolamento bacteriano de alto rendimento do biofilme da película é realizado usando o método de diluição limitante. Em seguida, os 5 principais táxons bacterianos são selecionados com a maior abundância nos dados de sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA (amostras de biofilme da película) para uso posterior na construção de comunidades de biofilme multiespécies. Todas as combinações dos 5 táxons bacterianos foram rapidamente estabelecidas usando uma placa de 24 poços, selecionada para a maior capacidade de formação de biofilme pelo ensaio de coloração violeta de cristal e quantificada por qPCR. Finalmente, as comunidades de biofilme multiespécies bacterianas sintéticas mais robustas foram obtidas através dos métodos acima. Esta metodologia fornece orientação informativa para a realização de pesquisas sobre biofilme multiespécies da rizosfera e identificação de comunidades representativas para o estudo dos princípios que regem as interações entre essas espécies.

Seguindo o procedimento mencionado, são observados gradientes significativos na capacidade de formação de biofilme da microbiota do solo da rizosfera do pepino (Figura 1). O sequenciamento do amplicon do biofilme confirmou a espécie na película (Figura 2). Com base no mapeamento de calor dos dados de sequenciamento, foram selecionadas as cinco principais espécies bacterianas cuja abundância na película é maior do que na solução restante (Figura 3). Aqui, um grupo típico de comunidades sintéticas foi tomado como exemplo. A coloração com cristal violeta e a PCR quantitativa visualizam diretamente as diferenças na biomassa da película e a abundância relativa de cada espécie nas comunidades. O aumento da biomassa de cocultura indica o sucesso da construção de comunidades sinérgicas de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera (Figura 4 e Figura 5).
Os resultados mostram que Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 e Burkholderia cenocepacia XL-2 podem formar consórcios sinérgicos proeminentes, com a comunidade mais robusta consistindo de todas as três espécies. Prevê-se que eles exibam forte sinergismo na formação de biofilme. Também é digno de nota que o XL-1 serve como um 'dedicador'. Promove a formação de biofilme de XL-2 e SQR9, apesar de seu baixo crescimento e abundância mínima nos consórcios (Figura 5). Embora vários biofilmes de cocultura multiespécies representem um fenótipo sinérgico, algumas espécies, como Chryseobacterium sp., estão sempre negativamente relacionadas a outras cepas, reduzindo a biomassa do biofilme sintético (Figura 2). Embora esse fenômeno não esteja relacionado ao alvo deste protocolo, pode valer a pena uma investigação mais aprofundada no futuro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg"> Figura 1: Formação de biofilme de diferentes comunidades sintéticas (SynComs). Aqui, as amostras estão em placas padrão de 24 poços. As fotografias são capturadas sem qualquer ampliação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg"> Figura 2: Composição bacteriana na película e na solução. Os gráficos são baseados nos dados de sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA, mencionados na etapa 2.3 do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg"> Figura 3: Mapa de calor da capacidade de formação de biofilme na película e na solução. O vermelho representa a abundância no biofilme, que é maior que a solução, e o azul representa o oposto. O gênero não apresentou diferença não são mostrados. As espécies das 5 principais abundâncias estão marcadas à esquerda. BB: biofilme preto; BS: Solução preta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg"> Figura 4: Quantificação da biomassa de biofilme de comunidades sintéticas na Figura 1. Os dados são da quantificação do cristal violeta com OD = 590 nm. Os dados apresentados são a média ± DP, n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg"> Figura 5: Número de células e abundância relativa de espécies de comunidades sintéticas na Figura 1. Os dados são de PCR quantitativo. Os dados apresentados são a média ± DP, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um procedimento rápido e padronizado para estabelecer comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies de vários solos da rizosfera é apresentado aqui. É um protocolo único projetado para sondar e simular a complexa microbiota do solo da rizosfera.

Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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