Preparação de Suspensão de Célula Única de Células Epiteliais Tímicas de Camundongo e Coloração de Moléculas Intracelulares para Análise por Citometria de Fluxo
26 de julho de 2024
Descrevemos protocolos para a preparação de suspensão unicelular de células epiteliais tímicas de camundongo e a coloração de moléculas intracelulares para análise citométrica de fluxo.
As células T são células imunológicas que protegem nosso corpo de doenças infecciosas e câncer. O timo é um órgão que produz células T e seleciona células T em desenvolvimento de acordo com os componentes próprios do corpo. Estamos interessados em como o timo produz e seleciona células T que são protetoras para o nosso corpo e ainda tolerantes ao corpo.
Nosso laboratório tem contribuído para a análise de células epiteliais tímicas, que têm um papel fundamental na produção e seleção de células T no timo. A análise em nível de célula única de células epiteliais tímicas nos ajudou a entender melhor o mecanismo molecular do desenvolvimento e seleção de células T. As células epiteliais tímicas são altamente diversas com estruturas complexas, tornando seu isolamento desafiador.
A tecnologia atual para isolar suspensões unicelulares é limitada e precisa ser melhorada. Mesmo assim, o isolamento de células epiteliais tímicas de células únicas aumenta nossa compreensão da maquinaria molecular envolvida em seu desenvolvimento e função. Esperamos que nosso estudo contribua para a compreensão da geração e regeneração de células imunes.
Acreditamos que servirá como uma pedra angular importante para o avanço da saúde humana. Depois de colher o timo do camundongo, coloque-o em cinco mililitros de RPMI 1640 contendo 10 HEPES milimolares em um prato de plástico de 60 milímetros no gelo. Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça curva de ponta fina para remover sangue, não timo e tecidos adiposos.
Corte o timo em pedaços pequenos com uma tesoura de dissecação. Transfira os pedaços de timo para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de um miligrama por mililitro de colagenase e dispase e uma unidade por mililitro de DNase em RPMI 1640 contendo 2% de FBS. Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, misture a suspensão usando uma pipeta de transferência de plástico de três mililitros e continue incubando por aproximadamente 30 minutos ou até que os fragmentos de tecido não sejam vistos. Adicione cinco mililitros de cinco milimolares EDTA em HBSS contendo 1% de FBS. Filtre a suspensão celular através de uma malha de náilon de 60 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros.
Centrifugue a suspensão a 350G por cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão FACS. Armazene as células no gelo e determine o número das células usando um contador de células. Depois de colher o timo de um camundongo neonatal, use uma pinça curva de ponta fina para remover sangue, não timo e tecidos adiposos.
Transfira o timo para um tubo de 1,5 mililitro contendo 0,2 mililitros de RPMI 1640 contendo 10 HEPES milimolares. Usando uma pipeta de 200 microlitros, descarte o meio e, em seguida, adicione 0,5 mililitros de 0,5 miligramas por mililitro de colagenase e dispase e uma unidade por mililitro de Dnase em RPMI 1640 contendo 2% de FBS. Incube o tubo em um bloco de calor a 37 graus Celsius.
Durante a incubação, misture delicadamente usando uma pipeta de um mililitro. Após 10 minutos, adicione 0,5 mililitros de EDTA de cinco milimolares em HBSS contendo 1% de FBS. Filtre a suspensão celular através de uma malha de náilon de 60 mícrons em um novo tubo cônico de 15 mililitros.
Adicione nove mililitros de RPMI 1640 contendo 10 HEPES milimolares ao tubo. Centrifugue a suspensão da célula a 350G por cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspenda o pellet em um a três mililitros de tampão FACS. Armazene as células no gelo e determine o número das células usando um contador de células.
Para começar, adicione 16 vezes 10 à potência de 6 células de timo de camundongo neonatal ou pós-natal em um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros. Centrifugue a suspensão celular a 350G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 10 microlitros de concentração de trabalho de anticorpo monoclonal anti-receptor FC em tampão FACS.
Incube o tubo a quatro graus Celsius por cinco minutos. Adicione 40 microlitros de anticorpo monoclonal anti-CD45, anticorpo monoclonal anti-EpCAM, anticorpo monoclonal anti-Ly-51 e UEA-1 no tampão FACS. Misture o conteúdo de um tubo e incube a quatro graus Celsius por 45 minutos.
Após a incubação, adicione dois mililitros de tampão FACS. Centrifugue a suspensão celular a 350G por cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspenda o pellet em um microlitro de solução de violeta 510 Ghost Dye. Misture o conteúdo de um tubo e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Agora adicione dois mililitros de tampão FACS e centrifugue a suspensão celular antes de fixar as células com um mililitro de aldeído paraforme a 2% por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione 3,5 mililitros de PBS ao tubo. Centrifugue a suspensão celular a 700G por oito minutos a quatro graus Celsius e permeabilize as células com um mililitro de fixação intracelular e tampão de permeabilização.
Misture o conteúdo de um tubo e incube a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, centrifugue a suspensão celular e adicione um mililitro de tampão de permeabilização. Novamente, centrifugue a suspensão, antes de adicionar 100 microlitros cada uma das concentrações de trabalho do anticorpo anti-beta5t ou anticorpo anti-CCL21.
Incube por 60 minutos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro de tampão de permeabilização e centrifugue a suspensão celular a 700G por oito minutos a quatro graus Celsius. Agora adicione 100 microlitros de concentrações de trabalho de IgG anti-coelho e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.
Depois de adicionar tampão de permeabilização, centrifugue a suspensão celular. Ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão FACS e misture bem. Filtre a suspensão celular através de malha de nylon de 60 mícrons antes da análise por citometria de fluxo.
Os perfis citométricos de fluxo de células do timo digeridas por colagenase e dispase de camundongos de zero dia de idade e camundongos de duas semanas demonstraram que mais de 90% dos sinais particulados representavam células viáveis. Os sinais fluorescentes de células viáveis foram representados por CD45 e EpCAM. Durante os estágios neonatais, os cTECs foram mais frequentes do que os mTECs, mas no pós-natal, os mTECs dominaram devido à baixa eficiência de liberação de cTEC.
A fixação e permeabilização das células permitem a detecção de moléculas intracelulares dentro das TEC. A expressão de Beta5t foi detectada na maioria dos cTECs, mas não nos mTECs. CCL21 foi detectado em uma fração de mTECs, mas não em cTECs.
Em comparação, o ar foi expresso em uma subpopulação de mTECs.
Visão Geral
Este artigo descreve protocolos para o preparo de suspensões de células epiteliais timicas de camundongo em nível de única célula e sua subsequente análise por citometria de fluxo. Compreender essas células é fundamental para obter insights sobre o desenvolvimento e seleção de linfócitos T.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Citometria de Fluxo
Contexto
- Os linfócitos T são células imunes vitais que protegem contra doenças.
- O timo é responsável pela produção e seleção dos linfócitos T.
- As células epiteliais timicas desempenham um papel fundamental no desenvolvimento dos linfócitos T.
- A análise de célula única auxilia na compreensão dos mecanismos de seleção dos linfócitos T.
Objetivo do Estudo
- Analisar células epiteliais timicas em nível de única célula.
- Compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento de linfócitos T.
- Aprimorar técnicas de isolamento para diferentes células epiteliais timicas.
Métodos Utilizados
- Preparação de suspensões de células isoladas a partir de células epiteliais timicas de camundongo.
- Coloração de moléculas intracelulares.
- Análise por citometria de fluxo para exame detalhado.
- Utilização de técnicas avançadas de isolamento.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de diversos tipos de células epiteliais timicas.
- Compreensão aprimorada dos mecanismos de desenvolvimento dos linfócitos T.
- A citometria de fluxo forneceu informações sobre a expressão de moléculas intracelulares.
- Protocolos estabelecidos para pesquisas futuras em biologia dos linfócitos T.
Conclusões
- O estudo contribui para a compreensão das funções das células epiteliais timicas.
- Os protocolos podem ser aplicados a pesquisas adicionais em imunologia.
- Os conhecimentos obtidos podem levar a avanços nas terapias com linfócitos T.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preparação de suspensão de células únicas e a coloração intracelular de células epiteliais timicas (TECs) de camundongo permitem a investigação precisa dos mecanismos de desenvolvimento de linfócitos T no nível celular. Este fluxo de trabalho apoia a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para programas de descoberta com foco em imunologia, especialmente nos casos em que a seleção e a tolerância mediadas por TECs são críticas. A análise confiável por citometria de fluxo de subpopulações de TECs orienta decisões de portfólio em estágios iniciais e a continuidade translacional em estratégias de modulação imunológica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a validação funcional de moléculas expressas por TEC implicadas na seleção e tolerância de linfócitos T.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas ao distinguir as contribuições das TEC corticais e medulares na formação do repertório imunológico.
- Fornece dados quantitativos para orientar a priorização de alvos e avaliações de plausibilidade biológica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece suspensões padronizadas de células isoladas para ensaios de citometria de fluxo reprodutíveis.
- Facilita a detecção robusta de marcadores intracelulares, como beta5t e CCL21, em subpopulações definidas de células epiteliais timicas (TEC).
- Permite a escalabilidade dos ensaios e a comparabilidade entre estudos em plataformas de perfilagem de células imunes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos relevantes para doenças ao caracterizar mecanismos mediados por TEC subjacentes à tolerância imunológica.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos de modulação imunológica.
- Fornece uma base para o desenvolvimento de biomarcadores associados à função das TEC e à seleção de linfócitos T.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a análise de alta resolução de subpopulações de CTE e suas assinaturas moleculares.
- Biologia da Descoberta: Avança os testes de hipóteses sobre seleção mediada por TEC e mecanismos de tolerância de linfócitos T.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis de citometria de fluxo para expressão de marcadores de TEC.
- Análises: Fornece dados com resolução em nível de célula única para análise comparativa de subconjuntos de TEC e prevalência de marcadores.
- Pesquisa Translacional: Conecta conhecimentos mecanicistas a modelos pré-clínicos de modulação imunológica e tolerância.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo reutilizável para isolamento e análise de TEC em diversos programas de P&D em imunologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos imunológicos e reduz a ambiguidade mecanicista nas vias de seleção de linfócitos T.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento de TEC e a coloração intracelular para fluxos de trabalho de citometria de fluxo reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não ao fornecer dados robustos sobre mecanismos imunológicos mediados por TEC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de modulação imunológica com base em mecanismos celulares validados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissociação de tecidos, citometria de fluxo e protocolos de coloração intracelular.
- Exige acesso a instrumentação avançada de citometria de fluxo e software analítico.
- Necessita padronização entre equipes dos procedimentos de preparação e coloração celular para garantir comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes idades dos camundongos ou frequências de subpopulações de CTEs.
- As baixas taxas de recuperação de CTEs (1% de CTEcs, 10% de CTEms) podem limitar a produtividade e o tamanho da amostra.
