Name: Investigando interações bactérias-fungos usando colunas de rodovias fúngicas em diversos ambientes e substratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprenda a construir colunas de rodovias fúngicas para enriquecer pares bactérias-fungos de substratos ambientais diversos. Este protocolo permite investigar interações microbianas ecológicas com aplicações em microbiologia ambiental.

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<ol><li>Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+constraints+affecting+bacterial+habitats+and+activity+in+unsaturated+porous+media+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Water+Resour%22%5BJournal%5D)">Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media - A review.</a> Adv Water Resour. 30 (6), 1505-1527 (2007).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>5622-7261</td><td>Tubos de 50 mL para realizar experimentos de coluna no laboratório</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 90 mm</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>08-757-099</td><td>Placas de Petri para preparação de ágar e crescimento microbiano</td></tr><tr><td>Impressora 3D de processamento de luz digital (DLP) Asiga Freeform Pico Plus 39</td><td>Asiga Alemanha</td><td>Pico Plus 39 de forma livre</td><td>Impressora 3D utilizada para gerar lotes das colunas; outras impressoras 3D podem ser usadas</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Fisher Científico</td><td>LS40F20</td><td>Autoclave de bancada para esterilizar os componentes da coluna</td></tr><tr><td>Béquer</td><td>Fisher Científico</td><td>FB100600</td><td>Copo de 600 mL para vários usos ao longo do protocolo</td></tr><tr><td>Resina Dental LT Clear V2</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-DLCL-02</td><td>Resina alternativa para impressão 3D que foi testada</td></tr><tr><td>Resina de guia cirúrgico odontológico</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-SGAM-01</td><td>Foi usado para gerar as colunas discutidas no manuscrito; Outras resinas fotossensíveis podem ser usadas no lugar deste material</td></tr><tr><td>Tubos de DNA Low Bind de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13-698-791</td><td>Tubos utilizados para diversas preparações, incluindo extracções de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Conservante de escudo de DNA/RNA</td><td>Pesquisa Zymo</td><td>R1100-50</td><td>Conservante usado antes de extrações de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>EDGE Bioinformática</td><td>Código aberto; Desenvolvido pelo Laboratório Nacional de Los Alamos (LANL)</td><td>n/a</td><td>Plataforma de bioinformática para processamento de dados amplicon</td></tr><tr><td>Kit de rotação FastDNA para solo</td><td>MP Biomédicos LLC</td><td>116560200-CF</td><td>Opção de kit de extração de DNA para solo</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Científico</td><td>10-300</td><td>Fórceps que podem ser esterilizados</td></tr><tr><td>Formlabs BioMed Resina Transparente</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Resina alternativa para impressão 3D que foi testada</td></tr><tr><td>Impressora 3D de estereolitografia (SLA) Formlabs Form 3B+</td><td>Formlabs</td><td>Formulário 3B+</td><td>Impressora 3D alternativa</td></tr><tr><td>Resina Formlabs IBT</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-IBCL-01</td><td>Resina alternativa para impressão 3D que foi testada</td></tr><tr><td>Inoculando Loops</td><td>Fisher Científico</td><td>22-363-598</td><td>Usado para isolar/transferir micróbios</td></tr><tr><td>Ágar Extrato de Malte (MEA)</td><td>Critério</td><td>89405-654</td><td>Um tipo de mídia usado em colunas</td></tr><tr><td>Sequenciador MiSeq + kit de sequenciamento MiSeq</td><td>Iluminado</td><td>SY-410-1003</td><td>Pode usar outros sequenciadores</td></tr><tr><td>Argamassa & Pilão</td><td>Fisher Científico</td><td>FB961K; FB961A</td><td>Pode usar qualquer argamassa comum e pilão que pode ser esterilizado entre os usos</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de Preparação de Biblioteca de DNA para Illumina</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>E7805S</td><td>Kit de preparação de biblioteca para sequenciamento metagenômico</td></tr><tr><td>Kit de preparação da biblioteca de DNA Nextera XT (24 amostras)</td><td>Iluminado</td><td>FC-131-1024</td><td>Kit de preparação de biblioteca para sequenciamento de amplicon</td></tr><tr><td>BORDA NMDC</td><td>Código aberto: Desenvolvido pelo National Microbiome Data Collaborative (NMDC)</td><td>n/a</td><td>Plataforma de bioinformática para processamento de dados metagenômicos</td></tr><tr><td>Malha de nylon</td><td>Sefar</td><td>03-25/19</td><td>A malha usada como parte da construção da coluna</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td>Pode usar muitas pontas de pipeta esterilizadas diferentes para as etapas do protocolo</td></tr><tr><td>Ágar Batata Dextrose</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-14200-28</td><td>Um tipo de mídia usado em colunas</td></tr><tr><td>QIIME2</td><td>Código aberto</td><td>n/a</td><td>Software para processamento de dados amplicon</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Pergunta 32851</td><td>Usado para quantificar o DNA após extrações</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Pergunta 33238</td><td>Usado para quantificar o DNA após extrações</td></tr><tr><td>Kit Miniprep Fúngico/Bacteriano Quick-DNA</td><td>Pesquisa Zymo</td><td>D6005</td><td>Opção de kit de extração de DNA que funciona com bactérias e fungos</td></tr><tr><td>Ágar R2A</td><td>BD Difco</td><td>218263</td><td>Um tipo de mídia usado em colunas (mídia bacteriana)</td></tr><tr><td>Rack para tubos de 50 mL</td><td>Fisher Científico</td><td>03-448-11</td><td>Rack para segurar tubos de 50 mL na posição vertical</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fisher Científico</td><td>12-000-155</td><td>Tesouras de precisão fina que podem ser esterilizadas</td></tr><tr><td>Meio carboximetilcelulose de sódio</td><td>Aldrich</td><td>Rolamento 419273-100G</td><td>Um tipo de mídia usado em colunas</td></tr><tr><td>Software CAD SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>n/a</td><td>Software utilizado para dimensionar os pilares</td></tr><tr><td>Colher de espátula</td><td>Fisher Científico</td><td>S41701</td><td>Para fazer uma depressão no substrato antes de adicionar a coluna</td></tr><tr><td>Água destilada sem DNase/RNase ultrapura</td><td>Invitrogen: ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td>Água para o banho-maria do ultrassônico</td></tr><tr><td>Ultrassônico</td><td>Fisher Científico</td><td>FB-11201</td><td>Ultrassônico para limpeza das colunas</td></tr></tbody></table>

investigando interações bactérias-fungos usando colunas de rodovias fúngicas em diversos ambientes e substratos

Investigating Bacterial-Fungal Interactions using Fungal Highway Columns in Diverse Environments and Substrates

A coluna da rodovia fúngica totalmente montada tem aproximadamente 5 cm de comprimento (Figura 1). A coluna não deve ser quebrada em nenhuma área, e as tampas e o anel rosqueado devem se encaixar com facilidade e firmeza para criar microambientes dentro da coluna. A malha do filtro pode se estender além do anel rosqueado (como mostrado na Figura 1 e na Figura 2) ou pode ser aparada com tesouras esterilizadas. Os plugues de ágar devem se encaixar perfeitamente em cada extremidade da coluna. Quando colocada no substrato, a malha do filtro deve entrar em contato com o substrato e a coluna não deve ser completamente enterrada.
As colunas foram previamente testadas em esterco de cavalo9. As colunas também foram colocadas em solo a granel e rizosfera em um local de campo de pesquisa, bem como em pequenos volumes de solo em tubos de 50 mL no laboratório (Figura 3). Depois que as colunas da rodovia fúngica foram removidas do substrato e desmontadas, o crescimento microbiano foi visível nos plugues de isca e meio alvo (exemplos mostrados na Figura 4A). Bactérias e fungos foram isolados do meio alvo e isca por meio de técnicas de subcultura (Figura 4B), e os micróbios presentes nos plugues do meio foram identificados taxonomicamente usando sequenciamento de amplicon (Figura 4C, D). A Figura 4C, D mostra os resultados combinados do sequenciamento do amplicon em vários experimentos, mostrando quais micróbios foram capazes de alcançar o plugue de mídia alvo a partir de colunas adicionadas ao estercode cavalo 9. As visualizações desses dados bacterianos e fúngicos foram geradas conforme descrito na etapa 17. Os resultados também podem ser exibidos como abundâncias relativas de táxons.
Resultados abaixo do ideal foram obtidos nos casos em que as colunas foram adicionadas a ambientes de umidade extremamente baixa e os plugues de mídia foram completamente dessecados em questão de dias, levando a nenhuma recuperação de micróbios colonizados (Figura 5A). Também vimos casos em que os micróbios simplesmente não crescem a partir do plugue de mídia alvo (Figura 5B) e casos em que não recuperamos dados de sequenciamento suficientes do plugue de mídia alvo para análises significativas. Outros casos em que os fungos crescem demais nas colunas também resultaram na necessidade de refazer os experimentos (Figura 5C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig03.jpg"> 
Figura 3: Exemplos das colunas colocadas em amostras ambientais em laboratório e campo. (A) Coluna colocada dentro de um tubo de 50 mL com solo umedecido em um ambiente de laboratório. Também mostrado com uma régua para escala. (B) Coluna colocada no solo no campo. (C) Coluna colocada na rede radicular de uma planta no campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig04.jpg"> 
Figura 4: Resultados representativos de experimentos de coluna bem-sucedidos. (A) Exemplos de plugues de mídia colonizados extraídos de colunas. (B) Exemplos de isolados de fungos subcultivados a partir de meios alvo. O substrato foi solo. Sequência superior ITS Identidade NCBI BLAST da esquerda para a direita: Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii e Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Cladogramas circulares exibindo a diversidade filogenética de (C) ITS fúngico e (D) sequências bacterianas 16S recuperadas do meio alvo após vários experimentos fúngicos em rodovias usando esterco de cavalo. As seções são coloridas e rotuladas por filo, com nós finais representando gêneros únicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig05.jpg"> 
Figura 5. Resultados abaixo do ideal de experimentos de coluna. (A) Um exemplo de um tampão de mídia desidratado resultante de condições ambientais de baixa umidade. (B) Exemplo de nenhum crescimento microbiano de um tampão de mídia de coluna. (C) Exemplo de crescimento excessivo do fungo através do topo (meio alvo) da coluna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Investigando interações bactérias-fungos usando colunas de rodovias fúngicas em diversos ambientes e substratos

Bacterial-fungal interactions (BFIs) play an integral role in shaping microbial community composition, biogeochemical functions, spatial dynamics, and ...

[Narrador] Este estudo se concentra nas interações fúngicas bacterianas para entender como esses micróbios podem influenciar o comportamento uns dos outros. Este trabalho investiga bactérias que utilizam hifia fúngica para transporte. Obter informações sobre essas interações permite o estudo de microbiomas complexos em ambientes como o solo. Exames de transporte bacteriano ao longo das hifas têm sido tradicionalmente feitos em placas de Petri modificadas, mas avanços recentes na tecnologia de impressão 3D permitiram o design e a fabricação de dispositivos que podem imitar melhor as condições nativas para a interação desses micróbios. Essas colunas de rodovias fúngicas têm sido usadas com sucesso em solos, risosferas e herbívoros em ambientes em dois continentes. Esses dispositivos também podem servir como ferramentas de ensino eficazes ou ser aplicados por outros grupos de pesquisa para expandir o conhecimento coletivo sobre as interações fúngicas bacterianas. Para começar, despeje o meio esterilizado à base de broca em placas de Petri de 90 milímetros até que a broca esteja perto do topo das laterais das placas de Petri. Em seguida, coloque uma extremidade de uma coluna de rodovia fúngica em uma das placas de mídia solidificada. Levante a coluna da mídia em um movimento torcido para que a broca permaneça dentro da extremidade da coluna e crie um plugue de mídia. Adicione a tampa pequena sobre a extremidade com o plugue de mídia para manter um microambiente estéril para a mídia de destino. Vire a coluna e crie um plugue de mídia para a outra extremidade. Usando uma tesoura esterilizada, corte um pedaço circular de uma malha de náilon de autoclave com dois centímetros de diâmetro. Coloque a malha sobre a extremidade exposta da coluna. Torça o anel rosqueado na extremidade da mídia de isca da coluna enquanto prende a malha dentro das roscas. Agora, coloque uma tampa grande na parte inferior da coluna sobre a malha e a outra extremidade do anel rosqueado. Configure um microcosmo de solo de laboratório. Remova a tampa grande da parte inferior da coluna para expor o anel rosqueado e a malha. Adicione a coluna ao microcosmo do solo de forma que toda a seção inferior fique dentro do solo. Remova a coluna depois de ter estado em contato com o substrato pelo tempo desejado. Sacuda cuidadosamente qualquer excesso de substrato e recoloque a tampa grande de volta na parte inferior da coluna abaixo da malha. Coloque a coluna em um tubo de 50 mililitros para transporte. Transfira a coluna para um ambiente estéril, como um gabinete de segurança biológica. Remova a tampa grande da mídia de isca, o anel rosqueado e a malha. Em seguida, remova a versalete da extremidade da coluna que contém o meio alvo. Use uma pinça esterilizada para extrair o plugue. Transfira o plugue de mídia alvo diretamente para o centro de uma placa de Petri de 90 milímetros contendo meio helicoidal. Para extrair o DNA, primeiro congele todos os plugues helicoidais ou as peças selecionadas das colunas em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius negativos. Como alternativa, mergulhe os pedaços do plugue em um conservante contido em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro antes da extração. Corte um pedaço de um centímetro de trado contendo crescimento microbiano do alvo cultivado ou meio de isca. Para extrações de colônias bacterianas isoladas, use um laço de inoculação estéril para retirar uma colônia da placa. Gire o loop diretamente no tampão de extração de DNA disponível comercialmente. Para extrações de fungos isolados, use um almofariz e pilão para moer os pedaços de trado separadamente em nitrogênio líquido. Transfira as amostras moídas para tubos de extração. Usando um kit comercial de extração de DNA otimizado para bactérias e fungos, extraia o DNA. Em seguida, use um fluorímetro para quantificar o DNA resultante. O crescimento microbiano foi visível nos plugues de isca e de meio alvo depois que as colunas da rodovia fúngica foram removidas do substrato e desmontadas. Bactérias e fungos foram isolados do meio alvo e isca por meio de técnicas de subcultivo. Os micróbios presentes nos plugues de mídia foram identificados taxonomicamente. Nenhuma recuperação de micróbios colonizados foi encontrada quando as colunas foram adicionadas a ambientes de umidade extremamente baixa. Em alguns casos, os micróbios simplesmente não cresceram a partir do tampão de mídia alvo ou um crescimento excessivo de fungos foi visto no topo da coluna.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Schlafer, S, e Frost Kristensen, M. Monitorando o pH Extracelular em Biofilmes Cruzados do Reino usando Microscopia Confocal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o cultivo de biofilmes cruzados entre Streptococcus mutans e Candida albicans sob condições semelhantes às orais para modelar interações bactéria-fúngico, possibilitando o estudo da sinergia microbiana, adesão mediada pelo glucano e virulência acidogênica na patogênese oral.

Estabelecimento de biofilmes entre reinos bacterianos-fúngicos para estudo da patogênese oral

Fonte: Miquel Guennoc, C., et al. Novo método para análise qualitativa multiescala de biofilmes bacterianos em colônias fúngicas filamentosas usando microscopia confocal e eletrônica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura fúngica em membranas de celofane tratadas para apoiar a formação de colônias e o crescimento radial. Em seguida, mostra o cultivo e preparação das células bacterianas do solo para ensaios de interação. Por fim, ilustra como as células bacterianas...

Estabelecimento de uma Co-cultura Fúngico-Bacteriana para a Formação de Biofilmes

Este vídeo descreve um método para cultivar e analisar qualitativamente biofilmes bacterianos em hifas fúngicas usando microscopia. Os biofilmes bacterianos freqüentemente se formam em superfícies fúngicas e envolvem vários processos de interação bactéria-fungo, como cooperação metabólica, competição ou predação.

Um método de preparação de amostras para visualizar bactérias formadoras de biofilme em hifas fúngicas

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

A maioria das plantas dentro das comunidades prováveis estão interligados por fungos de micorrizas arbusculares (AM), mas mediação de interações planta por eles foi investigada principalmente pelo cultivo de plantas com versus sem fungo. Apresentamos um método para manipular redes micorrízicas comuns entre plantas micorrízicas para investigar as suas consequências para as interações planta.

Investigação das interações planta comum redes micorrízicas usando núcleos girados

Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.

Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Aprenda a construir colunas de rodovias fúngicas para enriquecer pares bactérias-fungos de substratos ambientais diversos. Este protocolo permite investigar interações microbianas ecológicas com aplicações em microbiologia ambiental.

Investigando interações bactérias-fungos usando colunas de rodovias fúngicas em diversos ambientes e substratos

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