Name: Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina em camundongos usando software de IA. Este método acelera a pesquisa sobre glaucoma com precisão e eficiência.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imunocoloração e contagem baseada em IA de RGCs em retina de montagem total de camundongos

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 e vezes; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594-conjugado com IgG Anti-Coelho para Cabras&nbsp; (H + L)</td><td>Anticorpo anti-BRN3A ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>[EPR23257-285]</td><td>Software Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>AutoCount</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>Disco em nuvem</td><td>Link</td><td></td> do Google Drive <td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;</td></tr><tr><td>Disco em nuvem</td><td>Baidu link</td><td>Código de extração: g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>Marcador</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Normal de Burro</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Macklin</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Este protocolo detalha a metodologia para imunocoloração de montagem total de retinas de camundongos, garantindo uma preparação meticulosa do tecido, incubação precisa de anticorpos e contagem automatizada confiável de células. O procedimento facilita a marcação e quantificação robustas de células ganglionares da retina (RGCs), permitindo uma avaliação precisa de populações celulares em vários contextos experimentais. O método foi usado para contar RGCs em camundongos do tipo selvagem e modelados para glaucoma, produzindo resultados consistentes. Um resultado representativo mostra que o número de RGCs em um camundongo adulto normal aos 2 meses de idade é de aproximadamente 45.000 (Figura 6).
Para avaliar se o software de IA pode quantificar com precisão os RGCs marcados com BRN3a em modelos normais e de doenças, geramos um modelo de glaucomade glaucoma 7 induzido por N-metil-D-aspartato (NMDA). A retina de montagem total deste modelo foi imunomarcada com anti-BRN3A, e os RGCs foram quantificados usando o software de contagem automática. O resultado indicou uma coloração de fundo relativamente alta (Figura 7). No entanto, o software foi capaz de identificar com precisão quase todos os RGCs. Um total de 15.231 RGCs foram identificados nesta retina, em comparação com aproximadamente 45.000-50.000 RGCs em uma retina normal de camundongo, indicando degeneração grave. Assim, o software de IA também pode ser usado com eficácia para contar RGCs em retinas com qualidade de coloração menos ideal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático para preparação do RGC. (A) O globo ocular é removido e colocado em 1x PBS. (B) O globo ocular é fixado em 4% de PFA no gelo por 3 h. (C) Remoção da córnea. (D) Extração da lente. (E) A ocular é dividida em 4 abas usando uma tesoura. (F) A esclera é removida e os detritos são removidos suavemente da superfície da retina com uma escova macia. (G) A retina é imunomarcada com anti-BRN3A. (H) Os sinais fluorescentes são fotografados usando um microscópio confocal. (I) Contagem automática de RGCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> Figura 2: Isolamento da retina de camundongo de montagem total. (A) O camundongo é sacrificado por luxação cervical. (B) O mouse é colocado em uma superfície plana. (C) O globo ocular é cuidadosamente removido com uma tesoura. (D) O globo ocular é colocado suavemente em 1x PBS. (E) O globo ocular é fixado com uma pinça na borda da córnea. (F) Uma pequena incisão é feita na borda da córnea com uma agulha. (G) A estrutura em forma de tigela é removida após a remoção da córnea. (H) A lente é cuidadosamente removida com uma pinça. (I) Uma pequena incisão é feita ao longo da borda da córnea em direção ao nervo óptico na esclera, evitando danos à retina. (J) A esclera é aberta ao longo da incisão com uma pinça. (K) A retina é achatada e limpa com um pincel. (L) A retina é achatada e rapidamente fixada com metanol gelado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> Figura 3: Imunocoloração da retina de camundongo de montagem inteira. (A) Após a lavagem com 1x PBS, a retina é bloqueada com um tampão de bloqueio. (B) A retina é incubada com um anticorpo primário a 4 °C durante a noite. (C) A retina é lavada com 1x PBS três vezes. (D) A retina é incubada com um anticorpo secundário por 2 h à temperatura ambiente. (E) A retina é montada em uma lâmina de vidro com RGCs voltados para cima. (F) As imagens são adquiridas usando um microscópio confocal a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> Figura 4: Instalação de software de contagem automática. (A) A etapa 1 envolve a atualização do caminho do arquivo para o diretório "yolov5_cpu". (B) A interface gráfica é iniciada. (C) Verificação da presença do arquivo de modelo no diretório raiz da unidade C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> Figura 5: Operação do software de contagem RGC automatizado. (A) O software de contagem é aberto. (B) O botão ABRIR IMAGEM é clicado para importar a imagem. (C) O botão RUN é clicado para iniciar a contagem automática. (D) As células contadas são marcadas com uma caixa quadrada vermelha e o número da célula é exibido no canto superior direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> Figura 6: Contagem automatizada de RGCs de camundongos. O painel superior (à esquerda) mostra resultados representativos de retina de montagem plana imunomarcada com anti-BRN3A; o painel superior (à direita) mostra a contagem automatizada de RGCs com software desenvolvido anteriormente. Barra de escala: 100 μm. As inserções dos painéis superiores são ampliadas e mostradas no painel inferior, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> Figura 7: Contagem de RGC em um modelo de glaucoma de camundongo induzido por NMDA. Painel esquerdo: Visão geral da retina de montagem inteira, mostrando RGCs reconhecidos pelo software de IA. Painel direito: Visão ampliada de uma área parcial da retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

whole-mount-immunostaining-automatic-counting-mouse-retinal-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células ganglionares primárias da retina (RGCs) murinas usando citometria de fluxo. Este método permite o estudo futuro dos RGCs, com o objetivo de entender melhor o grande declínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

Isolando células ganglionares da retina murina usando classificação de células ativadas por fluorescência

Fonte: Lani-Louzada, R., et al. Cauterização de círculo completo do plexo vascular límbico para glaucoma induzido cirurgicamente em roedores. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra a quantificação de células ganglionares da retina de retinas de ratos quimicamente fixadas submetidas à cauterização de círculo completo do plexo vascular límbico. O processo inclui permeabilização, coloração de anticorpos e contracoloração nuclear, seguida de visualização sob um microscópio de epifluorescência...

Quantificação de células ganglionares da retina após hipertensão ocular induzida por cauterização 

Fonte: Wang, Z., et al. Imagem in vivo de dois fótons transpupilares da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de retina in vivo usando microscopia de dois fótons. Os camundongos anestesiados são preparados para a imagem prendendo suas cabeças, aplicando lubrificante ocular e colocando uma lamínula sobre o olho. As células ganglionares da retina (RGCs) que expressam proteínas fluorescentes são visualizadas pela primeira vez usando...

Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Este manuscrito apresenta um protocolo para a preparação histológica de lâminas de globos oculares de roedores. Com o método proposto, a retina interna pode ser facilmente visualizada e avaliada ao microscópio óptico. O procedimento é apresentado para os globos oculares de camundongos e ratos.

Preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina em camundongos usando software de IA. Este método acelera a pesquisa sobre glaucoma com precisão e eficiência.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

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