Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura
29 de novembro de 2024
Este protocolo descreve as etapas essenciais para a realização de campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura para enriquecer as variantes de proteína que se ligam a um antígeno de interesse.
No meu laboratório, estamos projetando terapias celulares de próxima geração, combinando engenharia de proteínas com engenharia celular. Então, projetamos componentes de proteínas para obter novas funções ou melhorar as existentes e, em seguida, incorporamos essas proteínas nulas na terapêutica celular. Desenvolvemos ainda mais a exibição de superfície de uso para aplicações especializadas, incluindo engenharia de estabilidade de proteínas, engenharia de interruptores de proteínas reguladas por moléculas pequenas e direcionamento específico de confirmações de receptores ativados associados ao câncer.
A vantagem da exibição da superfície da levedura em comparação com outras tecnologias de exibição, como exibição de fagos ou ribossomos, é a visualização da citometria de fluxo da biblioteca durante o processo de classificação e o controle preciso das condições de seleção, como concentração de antígeno e rigor da porta de classificação. Para começar, prepare as esferas para a primeira seleção de contas ressuspendendo 10 microlitros de esferas magnéticas de aglutinante de biotina em 990 microlitros de PBSA. Para lavar, coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos com a tampa aberta.
Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda as esferas lavadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro em um mililitro de PBSA com 6,7 a 33 picomoles de antígeno biotinilado. Após a incubação, coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos com a tampa aberta, remova o sobrenadante e lave as esferas carregadas de antígeno com um mililitro de PBSA.
Assim que as contas assentarem, remova o PBSA. Em seguida, ressuspenda os grânulos carregados de antígeno em 50 microlitros de PBSA. Prepare as células, grânulos de antígeno e uma solução de grânulos de urso para seleções negativas.
Após a lavagem, ressuspenda os grânulos de antígeno em 50 microlitros de PBSA e ressuspenda os grânulos de urso em 150 microlitros de PBSA. Para a primeira seleção negativa, adicione 50 microlitros de contas nuas lavadas a 950 microlitros de células lavadas em PBSA e incube a mistura por 1,5 horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, coloque os tubos contendo as suspensões de células de contas de urso em um rack magnético com a tampa aberta.
Pipete qualquer líquido da tampa para o tubo e aguarde dois minutos. Em seguida, transfira as células não ligadas para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 50 microlitros de contas de urso lavadas. Após três rodadas de seleção negativa, adicione 50 microlitros de solução de grânulo carregada de antígeno às células.
Incube por duas horas a quatro graus Celsius. Agora coloque as células que contêm as esferas carregadas de antígeno em um rack magnético com a tampa aberta. Pipete qualquer líquido que esteja na tampa para dentro do tubo.
Aguarde dois minutos antes de descartar as células não ligadas. Execute todas as etapas restantes conforme descrito para a primeira seleção do grânulo de antígeno. Após três seleções negativas e uma positiva, ressuspender as células rapidamente em um mililitro de SDCAA e transferir para um frasco agitador contendo um volume maior de SDCAA.
Após a indução noturna da expressão superficial de proteínas em SGCAA em bibliotecas de leveduras, granular células suficientes para cobrir 10 vezes a diversidade e descartar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em PBSA e transfira-o para tubos de microcentrífuga. Use 30 milhões de células para coloração em cada tubo.
Prepare quantos tubos forem necessários com base na diversidade, incluindo um tubo de controle sem o antígeno. Em seguida, centrifugue os tubos a 2000 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBSA contendo o antígeno e incube por uma hora a quatro graus Celsius.
Depois de realizar a centrifugação mais uma vez, remova o PBSA do pellet. Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de PBSA frio contendo anticorpos para coloração de exibição e detecção de antígeno. Incube por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Após a incubação, centrifugue as células a 2000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Adicione um mililitro de PBSA ao pellet e repita a centrifugação. Em seguida, remova a maior parte do sobrenadante, deixando apenas 20 a 30 microlitros para evitar que o pellet seque.
Ressuspenda o pellet em PBSA frio antes de classificar. Agora classifique as células diretamente em SDCAA, um meio. Após a classificação, transferir as células para um frasco agitador contendo um volume maior de meio SDCAA e incubar a 30 graus Celsius com agitação a 180 RPM.
Visão Geral
Este protocolo descreve os passos essenciais para conduzir campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura para enriquecer variantes de proteínas que se ligam a um antígeno de interesse. O método permite um controle preciso das condições de seleção e visualização por citometria de fluxo durante o processo de triagem.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de Proteínas
- Engenharia Celular
- Desenvolvimento Terapêutico
Fundo
- A exibição de superfície de levedura é uma ferramenta poderosa para engenharia de proteínas.
- Permite a visualização de bibliotecas durante a triagem.
- Permite o controle sobre a concentração de antígenos e a severidade da triagem.
- Usado para aplicações como engenharia de estabilidade de proteínas e terapias direcionadas.
Propósito do Estudo
- Enriquecer variantes de proteínas que se ligam a antígenos específicos.
- Melhorar a eficiência das terapias celulares.
- Desenvolver novos interruptores de proteínas regulados por pequenas moléculas.
Métodos Utilizados
- Preparação de contas magnéticas de ligação à biotina.
- Seleção negativa usando contas e células lavadas.
- Seleção positiva com contas carregadas de antígeno.
- Triagem citometria de fluxo de células enriquecidas.
Principais Resultados
- Enriquecimento bem-sucedido de variantes de proteínas que se ligam a antígenos.
- Demonstrou controle sobre as condições de seleção.
- Recuperação eficiente de variantes de proteínas desejadas para estudos adicionais.
Conclusões
- A exibição de superfície de levedura é eficaz para a seleção de variantes de proteínas.
- Fornece uma plataforma robusta para o desenvolvimento de terapias de próxima geração.
- Facilita avanços na engenharia de proteínas e aplicações terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Yeast surface display enables rapid, high-fidelity engineering of protein variants with improved or novel binding properties, directly supporting early-stage therapeutic discovery. The method's integration of phenotype-genotype linkage and flow cytometric selection enhances predictive confidence in target validation and lead identification. This platform is broadly accessible and scalable, positioning it as a reusable capability for protein engineering pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting protein variants with desired binding profiles.
- Supports biological de-risking through precise control of selection stringency and antigen concentration.
- Facilitates functional target validation by linking protein phenotype to genotype for downstream analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by enriching high-affinity binders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast-displayed protein libraries for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and enhances reproducibility via flow cytometric visualization and sorting.
- Enables quantitative assessment of binding affinity and specificity for reliable compound evaluation.
- Supports scalable enrichment and reuse of engineered protein variants across campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered proteins with disease-relevant targets for translational continuity.
- Provides a robust platform for preclinical validation of protein-based therapeutics.
- Reduces mechanistic ambiguity by enabling selection for stability and functional activity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative enrichment data.
Pipeline & Workflow Integration
Yeast surface display fits at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical validation, enabling iterative optimization of protein therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by selecting for functional protein variants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for affinity and specificity assessment.
- Analytics: Provides flow cytometric and sequencing data to compare variant performance across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by generating candidates with validated binding properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to diverse protein engineering objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein engineering.
- Operational Value: Standardizes and streamlines selection workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and flow cytometry for optimal execution.
- Needs access to flow cytometric instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of selection and sorting protocols.
- Adaptable to various protein targets and model systems with protocol adjustments.
- Dependent on library diversity and antigen availability for campaign success.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:52
Yeast Surface Display Selection Using Magnetic Beads
1:57
Second Bead Selection Round with 3 Negative and 1 Positive Selection
3:43
Flow Cytometric Sorting for Yeast Surface Display Selection of the Fn3-Based G4 Library for Binding to the Antigen
