Name: Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprenda a realizar seleção de variantes de proteínas por exibição de superfície em levedura usando citometria de fluxo. Este método permite controle preciso das condições de seleção e visualização durante o processo de triagem.

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<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando as funções das proteínas por meio de técnicas de exibição de superfície de levedura

A exibição da superfície da levedura é uma das principais tecnologias no campo da engenharia de proteínas. Ele permite a seleção de variantes de proteínas com propriedades desejadas, como afinidade ou estabilidade aprimoradas. Introduzido pela primeira vez em 19971, é uma das tecnologias de exibição mais comumente usadas além da exibição de fagos 2,3, exibição de ribossomos4 e exibição de células de mamíferos 5,6,7. A proteína de interesse (POI) é exibida na superfície das células de levedura, fundindo-a para ancorar proteínas. Uma variedade de diferentes proteínas âncora está disponível e, mais comumente, o POI é fundido ao terminal C da proteína de aglutinina de levedura Aga2p 1,8. Além disso, o POI é normalmente flanqueado por duas tags, como uma tag de hemaglutinina (HA-tag) e uma tag c-myc, que permite a detecção do nível de exibição usando anticorpos marcados com fluorescência e citometria de fluxo (Figura 1A). As campanhas típicas de seleção de leveduras envolvem uma combinação de seleções de esferas magnéticas e classificação por citometria de fluxo. As seleções de grânulos permitem o manuseio de grandes números de células e o enriquecimento de variantes de proteínas que se ligam ao antígeno alvo também com baixas afinidades, uma vez que as interações multivalentes com os grânulos carregados de antígenos levam a efeitos de avidez e, portanto, evitam a perda de variantes de baixa afinidade ( Figura 1B ). A análise e seleção de citometria de fluxo oferecem a vantagem de visualizar a ligação das variantes de POI exibidas ao antígeno marcado. Consequentemente, as populações de ligação podem ser classificadas e cultivadas, levando ao enriquecimento de variantes proteicas com características desejadas ao longo de várias rodadas de classificação. Além disso, rodadas adicionais de mutagênese aleatória podem ser realizadas para aumentar ainda mais a diversidade e, portanto, a probabilidade de encontrar mutações adicionais que contribuam para a afinidade e/ou estabilidade da proteína.
A exibição da superfície da levedura apresenta certas vantagens, como (a) maquinário de expressão eucariótica, permitindo o dobramento oxidativo de proteínas, bem como modificações pós-traducionais eucarióticas (como N-glicosilação), (b) normalização da expressão devido à detecção das duas marcas peptídicas flanqueando a proteína, (c) inspeção visual do progresso da seleção por citometria de fluxo (por exemplo, porcentagem de células de ligação e intensidade de ligação) e (d) a possibilidade de analisar mutantes proteicos individuais em levedura (por exemplo, analisando a termoestabilidade e a afinidade), apresentando uma alternativa que economiza tempo para a laboriosa expressão e purificação de proteínas9. De fato, tanto as afinidades (valores de KD) quanto as estabilidades (valores de T50) das proteínas exibidas na superfície da levedura mostraram boas correlações com os dados obtidos por métodos biofísicos e proteínas solúveis 9,10,11,12. A exibição da superfície da levedura tem sido empregada para a engenharia de uma variedade de proteínas, por exemplo, fragmentos de anticorpos 13,14,15,16, o10º domínio de fibronectina tipo III17,18, rcSso7d19,20 ou nós21. Da mesma forma, uma extensa pesquisa foi realizada para otimizar os projetos de bibliotecas de leveduras, alterando as posições aleatórias, bem como o uso de códons de aminoácidos 17,22,23. A exibição da superfície da levedura provou ser bem-sucedida para a engenharia de estabilidade 14,15,24,25, afinidade 18,26,27, atividade enzimática 28,29,30,31 e expressão de proteína32. Além disso, aplicações mais sofisticadas, como ligação condicional na presença ou ausência de uma molécula pequena, foram realizadas usando a exibição da superfície da levedura20.
Neste protocolo, descrevemos todas as etapas essenciais para uma campanha de seleção com exibição da superfície da levedura com o exemplo da biblioteca G4 (baseada no10º domínio da fibronectina tipo III, Fn3) selecionada contra o antígeno proteína de ligação ao retinol humano 4 (hRBP4) na presença da pequena molécula A112020. Essa seleção foi conduzida para produzir uma interação proteína-proteína que depende de uma pequena molécula que pode ser usada como um interruptor molecular. É importante observar que, embora abordagens alternativas sejam possíveis com a exibição da superfície da levedura, as seleções típicas de levedura geralmente visam a ligação a um antígeno alvo sem qualquer afinidade de ligação anterior. Cobrimos todas as etapas de uma campanha de seleção de leveduras, envolvendo o cultivo de uma biblioteca de leveduras, seleções de esferas, classificação por citometria de fluxo e maturação por afinidade por PCR propenso a erros (epPCR). Portanto, este protocolo complementa os protocolos anteriores de exibição da superfície da levedura33,34 e pode ser usado como base para seleções de exibição da superfície da levedura (Figura 1) com qualquer biblioteca de levedura e antígeno alvo de escolha.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Princípio da exibição da superfície da levedura e um fluxo de trabalho típico para seleções de exibição da superfície da levedura. (A) O POI é clonado em um vetor de exibição de superfície de levedura e normalmente flanqueado por uma tag HA- N-terminal e c-myc-tag. A construção é fundida à proteína de acasalamento de levedura Aga2p para exibição na superfície. A proteína representada é o aglutinante projetado "RS3" do PDB ID: 6QBA20. (B) Fluxograma ilustrando um fluxo de trabalho típico para campanhas de seleção de exibição de superfície de levedura, que combinam enriquecimento de variantes de proteínas com propriedades desejadas por seleções de esferas e classificação por citometria de fluxo, bem como epPCR para maturação de afinidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta eletrocompetente E. coli&nbsp;</td>Ágar-ágar <td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-c-myc, clone 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>Anticorpo anti-c-myc, clone 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>Anticorpo anti-HA, clone 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA, clone 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, fração de etanol frio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco levedura nitrogenada base</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico heptahidratado</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco» s solução salina tamponada com fosfato (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotin Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação 1 mm (para E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação 2 mm (para levedura)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II Kit de mutagênese aleatória</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose& nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de lítio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Kit de extração</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit de limpeza de DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td> <td># 41843</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His anticorpo, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Penta-His, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Peptona ex caseína digerida tripticamente</td> Carl <td>Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA Polimerase de Alta Fidelidade&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio monohidratado</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior de garrafa rosqueado Steritop</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura, micro-granulado</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Protein Engineering by Yeast Surface Display

A biblioteca G4 foi selecionada contra o antígeno hRBP4 ligado ao medicamento de molécula pequena A1120. A coloração das bibliotecas para classificação por citometria de fluxo foi realizada conforme descrito no Método 6, e a estratégia de gating aplicada é mostrada na Figura 2A. Um portão inicial incluía todas as células com base na morfologia celular, e o segundo portão (histograma de FSC-Width) mostrou uma estratégia de gating rigorosa que foi aplicada para selecionar células individuais e remover agregados de células. A terceira e última porta mostrou a exibição de variantes proteicas (eixo x) versus ligação ao antígeno (eixo y). As células de levedura que mostram sinais de exibição e ligação foram classificadas. É importante ressaltar que a porta de classificação foi configurada de maneira rigorosa para enriquecer os domínios de ligação com alto sinal de ligação e, portanto, alta afinidade. Essa seleção rigorosa produziu um enriquecimento da exibição de células de levedura que se ligam especificamente ao antígeno alvo durante a campanha de seleção (Figura 2B). Em rodadas posteriores de classificação por citometria de fluxo, a concentração de antígeno diminuiu 10 vezes (de 100 nM para 10 nM). Portanto, o sinal geral de ligação foi reduzido e apenas os ligantes com alta afinidade ainda eram detectáveis e classificados ( Figura 2C ).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Resultados representativos de uma seleção de exibição de superfície de levedura da biblioteca G4 baseada em Fn3 para ligação ao antígeno (hRBP4 na presença de A1120). (A) A estratégia geral de gating para classificação de bibliotecas de leveduras. A primeira porta (FSC vs. SSC) é selecionar todas as células de levedura e excluir eventos de dispersão; a segunda porta (histograma do FSC-W) visa remover agregados celulares e selecionar apenas células de levedura individuais. A terceira porta traça o nível de exibição da superfície (detecção da marca HA- ou c-myc) vs. ligação ao antígeno (aqui hRBP4 na presença de 5 μM A1120, detectado pelo anticorpo anti-His). A biblioteca foi adicionalmente corada apenas com anticorpos secundários (sem antígeno), onde nenhuma ligação ao antígeno é esperada. As células classificadas são destacadas em azul. (B) Evolução da biblioteca G4 ao longo de 3 rodadas de classificação por citometria de fluxo. O enriquecimento da população de ligação pode ser observado a cada rodada de seleção. (C) O uso de concentrações mais baixas de antígeno permite a seleção de variantes proteicas com maior afinidade pelo antígeno alvo. Após a redução da concentração de antígeno (aqui hRBP4) em 10 vezes, diferentes diagonais aparecem, indicando a presença de clones com maior (células classificadas, azul) ou menor afinidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

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