Name: Zebra II como um novo sistema para registrar sinais eletrofisiológicos em peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprenda a registrar ECG multicanal prolongado em peixe-zebra usando o sistema Zebra II. Este método permite até uma hora de aquisição de sinais eletrofisiológicos para triagem de fármacos e estudos cardíacos.

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Somos gratos pelo apoio do NIH SBIR Fase II #R44OD024874 para HC e MPHL Os autores também gostariam de agradecer o apoio financeiro fornecido pelo Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) no México por meio da bolsa intitulada Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.

Aderir estritamente às diretrizes éticas garante o bem-estar e o manuseio adequado do peixe-zebra envolvido em nossos experimentos. Todas as atividades experimentais foram conduzidas de acordo com os padrões estabelecidos pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Os experimentos e descobertas detalhados aqui foram executados com a aprovação da IACUC sob o protocolo autorizado AUP-21-066.
1. Preparação e armazenamento de soluções-mãe
CUIDADO: Prepare a solução estoque de tricaína em uma hotte, usando equipamento de proteção individual (EPI) adequado.
<ol>
	<li>Meça 400 mg de pó de tricaína e dissolva-o em 97,9 mL de água deionizada (DI). Coloque um agitador magnético no recipiente e misture gradualmente a solução.</li>
	<li>Ajuste o pH adicionando incrementalmente menos de 17 mL de solução de NaOH. Continue adicionando gotas de NaOH até que o pH atinja uma faixa de 6,8.-7,2.</li>
	<li>Determinar a concentração final da solução de tricaína, levando em conta o NaOH adicionado necessário para ajustar o pH e armazenar. 
	NOTA: A solução de tricaína é sensível à luz e deve ser armazenada em um recipiente de cor âmbar a 4 ° C quando não estiver em uso.</li>
	<li>Meça 258,13 mg de amiodarona e dissolva-o em 1 L de água DI. Insira um agitador magnético no recipiente e mexa por alguns minutos até que a solução esteja completamente dissolvida e livre de qualquer pó. Armazene a solução dentro de uma geladeira a 4°C quando não estiver em uso. 
	NOTA: A amiodarona deve ser preparada dentro de uma hotte e armazenada dentro de um frigorífico a 4 °C. Use sempre o EPI adequado.</li>
</ol>
2. Piscicultura
<ol>
	<li>Mantenha os peixes em tanques individuais ligados a um sistema de circulação de água, mantendo a temperatura entre 28-29°C.</li>
	<li>Garanta o monitoramento contínuo da qualidade da água e siga um ciclo dia-noite de 14 h / 10 h.</li>
	<li>Divida os 40 peixes em quatro grupos, cada um composto por 10 peixes, e abrigue-os em tanques separados.</li>
</ol>
3. Configurando o dispositivo
NOTA: O procedimento descrito na etapa 3.2 deve ser executado para cada câmara do dispositivo (Figura 1). Embora cada câmara possa ser configurada de forma diferente, para consistência no experimento, é aconselhável manter configurações uniformes em todas as câmaras.
<ol>
	<li>Conecte o dispositivo a uma fonte de alimentação e inicie a operação pressionando o botão vermelho localizado no painel frontal.</li>
	<li>Navegue pela tela sensível ao toque do dispositivo para escolher a câmara a ser configurada.
	<ol>
		<li>Ajuste a configuração do filtro passa-baixo para 0.1 Hz e a configuração do filtro passa-alto para 500 Hz. Ajuste a configuração de ganho para 10,000.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Levante a tampa frontal para acessar as quatro câmaras. Antes de iniciar o experimento, mergulhe a esponja de cada câmara (esponja de celulose padrão) em solução de tricaína e, em seguida, esprema o excesso de líquido.</li>
	<li>Gire o conjunto de quatro eletrodos para garantir que a esponja esteja acessível antes de introduzir o peixe.</li>
</ol>
4. Tratamento com amiodarona
NOTA: Utilize a água dos tanques de peixes (água dos peixes) para preparar soluções diluídas de amiodarona e tricaína. As etapas 4.3 e 4.4 devem ser repetidas para cada grupo separado na etapa 2.3 para cada solução preparada na etapa 4.1.
<ol>
	<li>Siga as etapas descritas abaixo para diluir a solução estoque de amiodarona.
	<ol>
		<li>Diluir 8,75 ml de solução-mãe em 41,25 ml de água de peixe para atingir uma concentração de 70 μM.</li>
		<li>Diluir 12,5 ml de solução-mãe em 37,5 ml de água de peixe para atingir uma concentração de 100 μM.</li>
		<li>Diluir 25 ml de solução-mãe em 25 ml de água de peixe para atingir uma concentração de 200 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare a solução anestésica diluindo 4 mL de solução estoque de tricaína em 100 mL de água de peixe, resultando em uma concentração de tricaína de 0,16 mg / mL</li>
	<li>Mergulhe cada peixe individualmente na solução de amiodarona preparada por 5 min. Use temporizadores para monitorar com precisão a duração da imersão.</li>
	<li>Transfira o peixe para uma solução de tricaína por 2-3 min para anestesia. Certifique-se de que o tratamento não cause a morte do peixe. Se um peixe apresentar um comportamento anormal, como perda de cor ou redução significativa no movimento branquial, remova-o da solução imediatamente e coloque-o de volta na água limpa do peixe.</li>
</ol>
5. Coleta de dados de ECG
NOTA: Siga imediatamente estas instruções após concluir a etapa 4.4. Repita o processo para cada câmara antes de selar o dispositivo. As câmaras são projetadas para acomodar peixes que variam de 4 a 10 mm de largura e 25 a 50 mm de comprimento.
<ol>
	<li>Retire o peixe da solução de tricaína e coloque-o na esponja, certificando-se de que o lado ventral esteja voltado para cima.</li>
	<li>Posicione o feixe de eletrodos em forma de losango sobre a área do peito do peixe para capturar sinais de ECG de quatro pontos diferentes simultaneamente (Figura 2A,B). Certifique-se de ajustar cada eletrodo com cuidado para que cada pino entre em contato com a pele do peixe.
	<ol>
		<li>Gire cada eletrodo, abaixando o pino até que ele entre em contato com a parte inferior do peixe. Se o pino estiver muito alto, gire o parafuso correspondente no sentido horário para abaixá-lo até que toque no peixe.</li>
		<li>Execute o ajuste descrito acima para os eletrodos em todas as câmaras.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Feche a tampa das câmaras assim que todos os feixes de eletrodos estiverem posicionados corretamente sobre os peixes nas câmaras operacionais.</li>
	<li>Marque cada câmara para gravação selecionando-a na tela sensível ao toque e, em seguida, inicie a gravação clicando no botão Gravar na tela.</li>
	<li>Clique no botão Parar após 2 minutos e, em seguida, clique no botão Salvar nas janelas de prompt que aparecem na tela após a parada. Salve as informações em um disco ou na nuvem, dependendo das necessidades específicas de pesquisa.</li>
</ol>
6. Solução de problemas do sistema de posicionamento da matriz de quatro eletrodos
NOTA: Ocasionalmente, um ou vários eletrodos podem falhar em capturar um sinal claro de ECG, necessitando de reposicionamento. Use as etapas a seguir para solucionar problemas do feixe de eletrodos quando necessário.
<ol>
	<li>Pressione o botão Parar na interface do dispositivo para interromper o processo de gravação e identificar o canal ou canais com sinais inconsistentes.</li>
	<li>Levante a tampa frontal para acessar as câmaras dos eletrodos. Identifique quais câmaras e eletrodos específicos estão causando problemas.</li>
	<li>Gire o parafuso superior no sentido horário para ajustar a proximidade do eletrodo com o peixe. Esta ação abaixará o eletrodo para mais perto do peixe.</li>
	<li>Repita a etapa 6.3 conforme necessário. Se apenas aproximar-se não resolver o problema, gire o eletrodo para um ponto diferente no peixe até que um sinal satisfatório seja alcançado.</li>
</ol>
7. Extraindo e analisando dados
NOTA: Toda a análise básica de dados apresentada neste artigo usa a técnica Wavelet21 para reduzir vários tipos de ruído e desvio padrão dos batimentos sinusais normais (SDNN) para calcular a variância batimento a batimento da FC em segmentos de um minuto.
<ol>
	<li>Depois que os dados forem salvos no disco ou na nuvem, recupere-os para análise ou envie-os diretamente para um servidor em nuvem para processamento posterior.</li>
	<li>Navegue até os dados salvos clicando no botão Procurar na tela e selecione os conjuntos de dados a serem usados.</li>
	<li>Selecione o botão Extrair nas opções na tela e conecte uma unidade USB à parte traseira do dispositivo para extrair os dados.</li>
	<li>Siga as instruções do dispositivo para salvar os conjuntos de dados selecionados na unidade externa para recuperação e análise subsequentes.</li>
</ol>

Zebra II: Advanced ECG System for Multichannel Zebrafish Cardiovascular Studies

<ol><li>Tsao, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2022+update%3A+A+report+from+the+American+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2022 update: A report from the American heart association.</a> Circulation. 145 (8), e153-e639 (2022).</li>
<li>Zulkifly, H., Lip, G. Y. H., Lane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of atrial fibrillation.</a> Int J Clin Pract. 72 (3), e13070(2018).</li>
<li>Ferreira, C., Providência, R., Ferreira, M. J., Gonçalves, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+and+non-cardiovascular+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Arq+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation and non-cardiovascular diseases: A systematic review.</a> Arq Bras Cardiol. 105 (5), 519-526 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Ding, L., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation%3A+mechanism+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation: mechanism and clinical management.</a> Chin Med J. 136 (22), 2668-2676 (2023).</li>
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<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Koopman, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+grime+mutant+uncovers+an+evolutionarily+conserved+role+for+Tmem161b+in+the+control+of+cardiac+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish grime mutant uncovers an evolutionarily conserved role for Tmem161b in the control of cardiac rhythm.</a> Proc Natl Acad Sci. 118 (9), e2018220118(2021).</li>
<li>Genge, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGenge%2C+CE+%22Reviews+of+Physiology%2C+Biochemistry+and+Pharmacology%22">Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology</a>. , Springer International Publishing. (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-electrocardiograms+to+study+post-ventricular+amputation+of+Zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Engg%22%5BJournal%5D)">Micro-electrocardiograms to study post-ventricular amputation of Zebrafish heart.</a> Ann Biomed Engg. 37 (5), 890-901 (2009).</li>
<li>Lin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+and+economic+in+vivo+electrocardiogram+platform+for+cardiovascular+drug+assay+and+electrophysiology+research+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish.</a> Sci Rep. 8 (1), 15986(2018).</li>
<li>Chaudhari, G. H., Chennubhotla, K. S., Chatti, K., Kulkarni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+adult+zebrafish+ECG+method+for+assessment+of+drug-induced+QTc+prolongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of the adult zebrafish ECG method for assessment of drug-induced QTc prolongation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 67 (2), 115-120 (2013).</li>
<li>Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+surface+ECG+recording+in+adult+zebrafish+reveals+that+the+value+of+this+model+exceeds+our+expectation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation.</a> Sci Rep. 6, 25073(2016).</li>
<li>Stoyek, M. R., Rog-Zielinska, E. A., Quinn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+electrical+function+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in electrical function of the zebrafish heart.</a> Prog Biophys Mol Biol. 138, 91-104 (2018).</li>
<li>Cao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wearable+multi-channel+microelectrode+membranes+for+elucidating+electrophysiological+phenotypes+of+injured+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Integ+Biol%22%5BJournal%5D)">Wearable multi-channel microelectrode membranes for elucidating electrophysiological phenotypes of injured myocardium.</a> Integ Biol. 6 (8), 789-795 (2014).</li>
<li>Lenning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+analysis+of+zebrafish+electrocardiogram+with+anomaly+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and analysis of zebrafish electrocardiogram with anomaly detection.</a> Sensors. 18 (1), 61(2018).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+microelectrode+arrays+to+interface+epicardial+electrical+signals+with+intracardial+calcium+transients+in+zebrafish+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdev%22%5BJournal%5D)">Flexible microelectrode arrays to interface epicardial electrical signals with intracardial calcium transients in zebrafish hearts.</a> Biomed Microdev. 14 (2), 357-366 (2012).</li>
<li>Cho, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+animal+model+in+epilepsy+studies+with+multichannel+EEG+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an animal model in epilepsy studies with multichannel EEG recordings.</a> Sci Rep. 7 (1), 3099(2017).</li>
<li>Continuous electrocardiogram monitoring in Zebrafish with prolonged mild anesthesia. Le, T., et al. 42nd Ann Int Conf IEEE Engg Med Biol Soc, , 2610-2613 (2020).</li>
<li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+wireless+ECG+system+for+prolonged+monitoring+of+multiple+zebrafish+for+heart+disease+and+drug+screening+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A novel wireless ECG system for prolonged monitoring of multiple zebrafish for heart disease and drug screening studies.</a> Biosensors Bioelectron. 197, 113808(2022).</li>
<li>Kouzehgar, K., Eslamian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2+-+Application+of+experimental+data+and+soft+computing+techniques+in+determining+the+outflow+and+breach+characteristics+in+embankments+and+landslide+dams%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+Hydroinfo%22%5BJournal%5D)">Chapter 2 - Application of experimental data and soft computing techniques in determining the outflow and breach characteristics in embankments and landslide dams.</a> Handbook Hydroinfo. 3, 11-31 (2023).</li>
<li>Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+of+adult+zebrafish+electrocardiogram+and+assessment+of+drug-induced+QT+prolongation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (1), H269-H273 (2006).</li>
</ol>

Hung Cao e Michael Lau são os fundadores da Sensoriis, Inc. O sistema Zebra II da Sensoriis foi desenvolvido com o apoio do NIH, #R44OD024874 de concessão da Fase II do SBIR. A Universidade da Califórnia, Irvine, revisou e aprovou o relacionamento de Hung Cao com a Sensoriis, Inc. de acordo com suas políticas de conflito de interesses. Os demais autores declaram não haver conflito de interesses.

As etapas atuais foram modificadas e aprimoradas de acordo com esta nova versão do dispositivo de um estudo anterior feito por nossa equipe20. Aqui, um design assistido por computador (CAD) rotulado do dispositivo também está incluído.
Conforme destacado no guia de solução de problemas do protocolo, o dispositivo exige que o usuário execute certas etapas críticas com diligência e precisão, pois essas etapas afetam crucialmente a qualidade do sinal de ECG. Consistente com os achados de nosso estudo anterior20, o posicionamento dos eletrodos desempenha um papel significativo na aquisição de leituras de ECG claras e de alta qualidade de amostras de peixe-zebra. Devido a este método expandir o número de eletrodos de trabalho de um para quatro e introduzir graus adicionais de liberdade, ele exige etapas suplementares de solução de problemas e colocação refinada do eletrodo sobre a área ventral do peixe para obter os melhores resultados.
As vantagens e novos recursos do dispositivo residem na medição estendida para experimentos de várias etapas, limitados a estudos de uma hora, triagem de alto rendimento com vários peixes-zebra (quatro estudos simultâneos), configuração de experimentos altamente controláveis, registros adicionais de eletrofisiologia por amostra (até quatro) e análise automatizada baseada em nuvem e armazenamento de dados. A partir disso, gostaríamos de enfatizar que a principal questão a ser abordada é o tempo necessário para realizar a triagem de drogas e estudos cardíacos em peixe-zebra, pois os métodos tradicionais requerem uma triagem um a um e vários ensaios para coletar informações suficientes22. Isso também oferece uma nova maneira de usar matrizes multicanais para registrar o ECG de maneira mais simples em comparação com aquelas que usam matrizes de microeletrodos (MEA) ou placas de circuito impresso flexíveis (FPCB)18 , o que exigiu etapas extras na fabricação dos eletrodos mencionados, além do procedimento necessário para anexá-los ao peixe, em comparação com o método proposto, que também depende do contato com a superfície, mas de forma menos invasiva.
As limitações do sistema não são diferentes daquelas apresentadas nos métodos tradicionais19,20, mas são menos intensivas, pois uma matriz multicanal é usada para diminuir o número de tentativas de gravação necessárias para o estudo. Essas limitações dependem do posicionamento do eletrodo, pois recomenda-se seguir o posicionamento proposto apresentado na Figura 2B. Também precisa ficar claro que o usuário não pode esperar ter gravações perfeitas durante o primeiro teste nos quatro canais, pois as diferenças anatômicas dos peixes e o pré-processamento da amostra (descalcificação, procedimentos de peito aberto, etc.) afetarão diretamente a qualidade e o sucesso dos testes.

As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte em todo o mundo. De acordo com o Relatório de Atualização da AHA de 2024, cerca de 2552 pessoas morrem todos os dias de DCV nos EUA, e o custo médio direto e indireto da DCV foi estimado em US$ 378,0 bilhões em 2017-20181. A fibrilação atrial (FA) é uma das arritmias cardíacas mais comuns nos EUA2 e está associada a um prognóstico desfavorável, aumentando o risco de acidente vascular cerebral e morte em cenários de DCV e doenças não cardiovasculares, levando a um risco aumentado de desfechos adversos3. Esse tipo de arritmia se distingue por sua atividade elétrica rápida e irregular nos átrios, o que geralmente resulta em um ritmo ventricular rápido e irregular4. Além disso, dados os eventos recentes do COVID-19, houve um aumento no número de estudos e evidências que mostram um aumento do aparecimento de arritmia em relação ao COVID-19, principalmente para bradicardia sinusal5. No lado oposto da FA, a bradicardia sinusal apresenta ritmo cardíaco diminuído e mais lento, com frequência cardíaca inferior a 60 batimentos por minuto (bpm). Esse diagnóstico requer um eletrocardiograma (ECG) mostrando um ritmo sinusal normal a uma frequência inferior a 60 bpm.
O peixe-zebra, Danio rerio, provou ser um modelo ideal para estudos cardiovasculares e de desenvolvimento de medicamentos devido à sua homologia com humanos em morfologia, fisiologia e genética6,7. Apesar de ter apenas duas câmaras discerníveis em comparação com o coração de quatro câmaras em humanos, o peixe-zebra possui uma estrutura contrátil semelhante com um sistema de condução análogo8,9. Portanto, o modelo de peixe-zebra é adequado para pesquisar arritmias cardíacas e explorar a associação entre vias genéticas relacionadas e características eletrofisiológicas por meio da análise de ECG. Em relação ao design do sensor para registro de ECG em peixe-zebra, eletrodos de agulha convencionais são comumente usados10. Outros estudos apresentaram alternativas para agulhas convencionais projetando um tipo diferente de agulha feita de diferentes materiais11, estes incorporaram materiais como filamento de tungstênio, aço inoxidável e fio de prata para avaliar a qualidade dos dados registrados. Juntamente com o kit de ECG portátil, eles procuraram estabelecer uma plataforma universal para laboratórios de pesquisa e educacionais.
O sistema de agulhas também foi implantado em outros estudos11,12,13,14 para a realização de pesquisas sobre efeitos biológicos e/ou induzidos por drogas, nos quais apresentou resultados encorajadores. No entanto, para obter sinais ideais, foi necessário inserir cuidadosamente as agulhas na derme do peixe-zebra. Esse procedimento invasivo pode causar lesões no coração do peixe devido à nitidez das agulhas, podendo alterar a morfologia do sinal13. Além disso, colocar com precisão o eletrodo no coração pequeno sem causar danos para garantir uma captura clara do ECG apresenta uma curva de aprendizado significativa. Consequentemente, vários sistemas de sonda substitutos foram introduzidos, como matrizes de microeletrodos (MEA) e sensores impressos em 3D. Tanto nossa equipe quanto outros pesquisadores utilizaram com sucesso o MEA para aquisição de dados, obtendo dados que oferecem uma boa relação sinal-ruído (SNR) junto com alta resolução espacial e temporal15,16,17. Por exemplo, introduzimos um MEA que envolve o coração do peixe, permitindo a captura de sinais de ECG específicos do local15,16. Em contraste, outra equipe desenvolveu um tipo diferente de MEA baseado em uma placa de circuito impresso flexível (FPCB) feita de filme de poliimida com o objetivo de registrar vários eletroencefalogramas (EEGs) para pesquisa de epilepsia18. Embora os MEAs permitam o registro de vários sinais, eles são limitados pela capacidade de avaliar apenas um peixe por vez devido ao número restrito de canais de eletrodos. Em resposta a essa limitação, apresentamos recentemente um sistema avançado capaz de gravações simultâneas de ECG de vários fish19. Este sistema emprega dois eletrodos, cada um com 125 μm de espessura e feitos de poliimida, com eletrodos pulverizados a ouro posicionados na parte inferior de seu invólucro para facilitar a aquisição de dados. No entanto, a inclusão de uma bomba de circulação de água introduziu ruído, afetando a qualidade da relação sinal-ruído (SNR) dos sinais de ECG. Além disso, foi necessário o uso de ferramentas de coleta de dados volumosas e caras, que exigiam uma conexão com fio a um computador. No mercado, sistemas como o iWORX oferecem portabilidade aprimorada por meio de um amplificador compacto, mas enfrentam problemas não resolvidos: (i) seu tempo de gravação é muito curto (3-5 min) para experimentos que precisam de durações mais longas, como aqueles que envolvem efeitos agudos de drogas; (ii) a necessidade de anestesiar os animais, o que pode estressá-los e distorcer os dados eletrofisiológicos cardíacos inatos; (iii) medições manuais e sequenciais dificultam a pesquisa com um grande número de peixes; e (iv) a necessidade de processamento de dados de ECG off-line e trabalhoso. É importante ressaltar que ainda não surgiram sistemas de alto rendimento que incorporem microeletrônica para analisar fenótipos mutantes. Portanto, a criação de sistemas de alto rendimento que permitem o registro estendido de ECG é crucial para descobrir ligações entre fenótipos arrítmicos e genótipos mutantes, identificando vários fenótipos arrítmicos associados a genótipos mutantes únicos e testando a eficácia de medicamentos cardíacos usando o modelo de peixe-zebra. Consequentemente, introduzimos, em 2022, o protótipo inovador do sistema Zebra II. Este novo sistema está equipado para realizar gravações de ECG estendidas de vários peixes ao mesmo tempo. Para conseguir isso, foi criado um sistema eletrônico interno, utilizando a tecnologia Internet das Coisas (IoT) para transmissão de dados sem fio e permitindo a análise de dados por meio de um aplicativo móvel. A inclusão da tecnologia IoT não apenas reforçou a flexibilidade e a portabilidade do sistema, mas também facilitou colaborações remotas para pesquisas sobre modelos de peixe-zebra. Em um estudo anterior, validamos a eficácia do sistema por meio de testes extensivos, mostrando sua capacidade de 1) adquirir dados de ECG simultaneamente de quatro peixes; 2) realizar registros contínuos de ECG por até 1 h, o que excede significativamente a capacidade dos sistemas existentes que captam apenas alguns minutos; 3) minimizar os efeitos de confusão da anestesia, empregando uma concentração reduzida de 50% de tricaína. Além disso, o sistema demonstrou uma forte capacidade de longas gravações de ECG em vários experimentos, como aqueles envolvendo bloqueio sinoatrial (SA) induzido por sódio, alterações na frequência cardíaca induzidas pela temperatura e arritmias induzidas por drogas em peixes mutantes Tg (SCN5A-D1275N) e selvagens sob condições experimentais controladas. A adoção pelo sistema de múltiplos canais de eletrodos para registro estendido de ECG permite ainda a execução de ensaios clínicos randomizados, permitindo que dois peixes por grupo experimental sejam estudados em condições idênticas20. Neste artigo, apresentamos a versão atualizada do sistema, com um eletrodo de 4 pontos. Esse aprimoramento permite que os usuários capturem leituras de ECG de vários locais no peixe, reduzindo significativamente a chance de obter sinais de ECG de baixa qualidade. Além disso, esta iteração se baseia e refina a maioria das funcionalidades descritas em pesquisas anteriores19. Este sistema de ECG evoluído mostra-se muito promissor para abordar as limitações existentes, facilitando substancialmente a análise de fenótipos arrítmicos e a triagem de drogas em peixe-zebra. A adição inovadora do eletrodo de 4 pontos foi rigorosamente testada por meio de um breve estudo sobre arritmia induzida por drogas em peixes-zebra do tipo selvagem, validando ainda mais sua eficácia.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de amiodarona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1164-1G</td><td>Amiodarona em pó</td></tr><tr><td>Medidor de pH/mV de bancada</td><td>Sper Scientific</td><td>10500308</td><td></td></tr><tr><td>Etileno3-Aminobenzoato, Sal de ácido metanossulfônico, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC118002500</td><td>Pó de tricaína</td></tr><tr><td>Isotemp Agitador de placa quente</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88854200</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Zebra II</td><td>Sensoriis</td><td>N / A</td><td>Sistema de Gravação de ECG de Peixe-Zebra Comercial</td></tr><tr><td>Sistema de ECG de Peixe-Zebra</td><td>iWorx</td><td>ZS-200</td><td>Sistema de Gravação de ECG de Peixe-Zebra Comercial</td></tr></tbody></table>

zebra ii como um novo sistema para registrar sinais eletrofisiológicos em peixe-zebra

Zebra II as A Novel System to Record Electrophysiological Signals in Zebrafish

O peixe-zebra e suas linhagens mutantes têm sido amplamente utilizados em investigações biomédicas, estudos cardiovasculares e triagem de drogas. No presente estudo, a versão comercial do novo sistema, Zebra II, é apresentada. O protocolo demonstra a aquisição e análise de eletrocardiograma (ECG) de vários peixes-zebra em ambientes de trabalho controláveis. O dispositivo é composto por um sistema de perfusão externo e independente, um eletrodo de 4 pontos, sensores de temperatura e um sistema eletrônico embarcado. Em estudos anteriores, o protótipo do dispositivo foi validado contra o sistema iWORX estabelecido por meio de vários testes, demonstrando qualidade de dados e resposta de ECG semelhantes a intervenções medicamentosas. Em seguida, o estudo se aprofundou no exame do impacto das drogas anestésicas e das flutuações de temperatura no ECG do peixe-zebra, necessitando de avaliação instantânea dos dados. Graças à capacidade do aparelho de administração consistente de anestésicos e medicamentos, foi possível estender a coleta de dados de ECG em até 1 h, marcadamente mais longa do que a duração de 5 min suportada pelos sistemas atuais. Este artigo apresenta uma análise automatizada pioneira, baseada em nuvem, utilizando dados de quatro peixes-zebra, oferecendo um método eficiente para conduzir experimentos combinados e reduzindo significativamente o tempo e o esforço. O sistema mostrou-se eficaz na captura e análise de ECG, especialmente na detecção de arritmias induzidas por drogas em peixes-zebra do tipo selvagem. Além disso, a capacidade de coletar dados em vários canais facilitou a execução de ensaios clínicos randomizados com modelos de peixe-zebra. O sistema de ECG desenvolvido supera as limitações existentes, mostrando o potencial de acelerar muito a descoberta de medicamentos e pesquisas cardiovasculares envolvendo peixes-zebra.

A capacidade de registrar simultaneamente sinais de ECG de múltiplos peixes distingue significativamente este dispositivo, oferecendo uma vantagem considerável na redução do tempo necessário para pesquisas com medicamentos ou estudos cardíacos em peixes-zebra ou outras espécies semelhantes (Figura 1). O registro de sinais de ECG precisos pode ser desafiador devido às variações anatômicas entre os peixes, especialmente no que diz respeito ao posicionamento dos eletrodos. Tradicionalmente, obter um sinal de ECG claro envolve posicionar o eletrodo ativo sobre o coração, a fim de evitar a captação de batimentos mecânicos ou artefatos de movimento, com o eletrodo de referência colocado na região do abdômen inferior. No entanto, identificar com precisão a localização exata do coração pode ser difícil devido à sua profundidade nos tecidos ou à superfície irregular do peixe. Às vezes, é necessário posicionar os eletrodos com micromanipuladores para uma colocação precisa, o que pode exigir várias tentativas antes de se obter um sinal de qualidade.
Para superar esses desafios, o sistema introduz uma abordagem inovadora utilizando uma configuração com quatro eletrodos, em vez dos eletrodos de trabalho convencionais individuais. Cada eletrodo opera de forma independente, permitindo ajustes em três dimensões: para cima e para baixo (arfagem), inclinação para frente e para trás (arqueamento) e rotação em torno do eixo vertical (rolamento). Essa flexibilidade mostra-se particularmente útil ao trabalhar com peixes de diferentes formas, pois permite o posicionamento preciso dos eletrodos para captar o sinal ótimo de ECG ou investigar como as leituras de ECG variam com diferentes pontos de contato no peixe.
Esse recurso não apenas aumenta a eficiência dos estudos cardíacos e farmacológicos, mas também amplia as possibilidades para técnicas de ECG e até mesmo de registro de ECG. Considerando que esses métodos ainda não foram padronizados e frequentemente são personalizados para acomodar as condições específicas do sujeito experimental, esse dispositivo abre novas perspectivas para a pesquisa, oferecendo métodos de coleta de dados mais adaptáveis e confiáveis (Figura 2).
Uma das características distintivas deste sistema é a sua capacidade de avaliar até quatro medicamentos diferentes simultaneamente em quatro peixes separados ou investigar os efeitos de até quatro doses diferentes de um único medicamento em quatro peixes distintos. A montagem experimental pode variar desde uma exposição aguda breve até sessões mais longas que abrangem 1 h, envolvendo dosagens variáveis do medicamento ou alterações em condições ambientais, como temperatura e anestesia. Neste estudo, realizamos um experimento breve para demonstrar a eficácia do método, destacando particularmente a funcionalidade do arranjo com quatro eletrodos. Testamos três doses variáveis de amiodarona, um fármaco antiarrítmico de classe III conhecido por induzir bradicardia e prolongar o intervalo QT em peixes-zebra, durante um período de exposição de 5 min, semelhante a um estudo anterior20 que utilizou o primeiro protótipo deste dispositivo.
Conforme pesquisas anteriores, os peixes apresentaram tanto um intervalo QTc prolongado quanto uma redução na frequência cardíaca em comparação com o grupo controle não tratado. Apesar do tempo breve de exposição, mais curto do que em muitos estudos comparáveis que se estendem até 1 h, foi possível observar alterações significativas nos sinais do ECG e nos parâmetros cardíacos (Figura 3).
Como o tratamento com amiodarona provocou modificações observáveis no ECG, que aumentaram com a elevação da dose, é ilustrado na Figura 3A,B. Notavelmente, o intervalo QTc prolongou-se com cada aumento sucessivo de dose em relação ao grupo controle, que exibia um intervalo QTc de 330 ms. Nos grupos tratados, os intervalos QTc foram medidos em 365 ms com 70 µM de amiodarona, 480 ms com 100 µM e 546 ms com 200 µM. Correspondentemente, observou-se uma diminuição notável da frequência cardíaca em resposta às diferentes doses de amiodarona e aos intervalos QTc prolongados. A frequência cardíaca diminuiu significativamente de uma média de 120 ±5 BPM no grupo controle para 105 ±10 BPM com 70 µM de amiodarona, 90 ±5 BPM com 100 µM e 84 ±5 BPM com 200 µM (Figura 3C,D).
Com base nesses resultados, podemos concluir que a técnica recém-proposta demonstra qualidade comparável à de estudos anteriores17,18, empregando uma abordagem com dois eletrodos (um eletrodo de trabalho e um eletrodo de referência). Coletamos com sucesso dados de quatro eletrodos de trabalho, selecionando o mais adequado para análise e, em seguida, relatando os parâmetros cardíacos esperados. Os critérios de seleção estão de acordo com os métodos anteriores, enfatizando a necessidade de visualizar claramente o complexo PQRST e de apresentar baixo ruído de linha de base no sinal do ECG. Isso permite o cálculo dos intervalos QT e QTc e facilita a identificação de diferenças evidentes. Além disso, a metodologia passou por validação adicional por meio de testes realizados por mais três pesquisadores do nosso grupo que não participaram do desenvolvimento do dispositivo atual. Eles implementaram inicialmente a metodologia preliminar sugerida pelos projetistas e, posteriormente, propuseram modificações com base em seus comentários, levando ao aprimoramento da abordagem aqui apresentada. Esse processo iterativo de aperfeiçoamento foi fundamental para melhorar o dispositivo, aproveitando as percepções de pesquisadores externos para torná-lo mais fácil de usar e eficaz para aplicações futuras.
Este breve estudo sobre a resposta a medicamentos destaca a eficiência do dispositivo não apenas em registrar simultaneamente ECGs de quatro peixes distintos sob diferentes condições, mas também em captar múltiplos sinais (quatro) de ECG por peixe. Essa capacidade multifatorial reduz significativamente o tempo e o esforço necessários para o posicionamento dos eletrodos e minimiza a probabilidade de erros humanos ao fornecer uma seleção de sinais. Essa opção permite escolher o sinal mais preciso ou agregar dados de múltiplos sinais, conforme o objetivo do estudo. Contudo, é importante esclarecer que o uso da configuração com quatro eletrodos não garante automaticamente que todos os quatro sinais sejam limpos e de alta qualidade. O objetivo principal da introdução desse recurso inovador é mitigar erros humanos e economizar tempo, permitindo quatro gravações simultâneas em vez de gravações sequenciais, o que é mais eficiente e menos estressante para os peixes, considerando sua tolerância limitada ao tempo fora da água e sob anestesia.
<img alt="Diagrama da configuração de eletrofisiologia com o sistema Zebra II, suporte de 4 eletrodos e matriz de múltiplos eletrodos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Sistema Zebra II. (A) Vista isométrica do dispositivo Zebra II (modelo SolidWorks) com componentes identificados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama da configuração de eletrodos múltiplos e resultados de monitoramento cardíaco em peixe; dados dos canais 1-4 mostrados." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Posicionamento dos eletrodos em Peixe-zebra. (A) Graus de liberdade do suporte de eletrodos de quatro pontos (imagem conceitual). (B) Posicionamento dos eletrodos no peito do peixe. (C) Sinal de ECG do suporte de eletrodos de quatro pontos (Canais 1-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de eletrocardiograma, intervalo QTc, análise de ECG sob dosagem de amiodarona, gráficos de frequência cardíaca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67066/67066fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Efeitos da exposição aguda à amiodarona (sinais de ECG). (A) Dados representativos de ECG obtidos do sistema e suas alterações nos parâmetros de ECG devido a diferentes concentrações de amiodarona. (B) Alteração no ECG provocada pela exposição à amiodarona. (C) Gráfico de barras descrevendo a discrepância na FC. (D) Gráfico de barras descrevendo a discrepância no intervalo QTc nos dados de ECG com diferentes concentrações de amiodarona. *p&lt;0,05 (análise de variância unidirecional com teste de Tukey). As barras de erro indicam o desvio padrão. Esta figura foi modificada de20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67066/67066fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

O estudo apresenta o Zebra II, um sistema avançado para aquisição e análise prolongada de ECG em peixe-zebra. Este sistema possui um sistema de perfusão independente e eletrodos de múltiplos pontos para o manuseio de vários peixes em ambientes controlados. Os efeitos agudos da amiodarona foram avaliados e analisados com o peixe-zebra do tipo selvagem.

Zebra II como um novo sistema para registrar sinais eletrofisiológicos em peixe-zebra

Zebrafish and their mutant lines have been extensively used in biomedical investigations, cardiovascular studies, and drug screening. In the current ...

Nosso grupo de pesquisa na UC Irvine desenvolve novas ferramentas para fornecer avaliação eletrofisiológica em peixe-zebra com melhor desempenho e maior duração. Nosso sistema tem sido usado para estudar genes cardíacos e realizar triagem de drogas usando peixe-zebra. Os desafios atuais nos experimentos eletrofisiológicos com peixe-zebra dependem de tempos de gravação curtos, que podem ser inferiores a cinco minutos.Isso estende a duração do experimento, o que restringe o tamanho da amostra e afeta a duração do experimento. Nossa técnica permite a gravação de ECG multicanal por até uma hora e é expansível para EEG, enquanto outras são limitadas a um canal em cinco minutos. Bem, acho que é como utilizar os dados ópticos cardíacos do peixe-zebra, correlacionando a eletrocardiografia, para estudar a patologia cardíaca e a anormalidade do desenvolvimento, especialmente no contexto do desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos.Penso em como alavancar nossa experiência que desenvolvemos em sensoriamento óptico, elétrico e químico, juntamente com inteligência artificial, no uso do peixe-zebra como um modelo animal econômico para desenvolver medicamentos em estágio pré-clínico para medicina cardiovascular, neurologia, neuropsicologia e medicina da dor. Para começar, divida igualmente 40 peixes em quatro grupos e abrigue-os em tanques separados. Conecte o dispositivo Zebra2 a uma fonte de alimentação e inicie a operação com o botão vermelho localizado no painel frontal.Navegue pela tela sensível ao toque do dispositivo para escolher a câmara a ser configurada. Ajuste a configuração do filtro baixo para 0.1 hertz e a configuração do filtro passa-alta para 500 hertz e defina o ganho para 10.000. Levante a tampa frontal para acessar as quatro câmaras antes de iniciar o experimento.Mergulhe a esponja de cada câmara em solução de tricaína e esprema o excesso de líquido. Gire o conjunto de quatro eletrodos para garantir que a esponja esteja acessível antes de introduzir o peixe. Para o tratamento, dissolva 258,13 miligramas de amiodarona em um litro de água deionizada.Insira um agitador magnético no recipiente e mexa até que a solução esteja completamente dissolvida e límpida. Diluir a solução-mãe de amiodarona Para preparar 70, 100 e 200 soluções de trabalho micromolares em água de peixe. Mergulhe o peixe individualmente na respectiva solução de amiodarona por exatamente cinco minutos.Para começar, trate os peixes com concentrações adequadas de amiodarona. Depois de anestesiar o peixe, coloque-o na esponja com o lado ventral para cima. Posicione o feixe de eletrodos predefinido em forma de losango sobre a área do peito do peixe para capturar sinais de quatro pontos diferentes simultaneamente.Em seguida, gire cada eletrodo, abaixando o pino até que ele entre em contato com a parte inferior do peixe. Se o pino estiver muito alto, gire o parafuso correspondente no sentido horário para abaixá-lo até que toque no peixe. Feche as tampas das câmaras assim que todos os feixes de eletrodos estiverem posicionados corretamente sobre os peixes nas câmaras operacionais.Para marcar cada câmara para gravação, selecione-a na tela sensível ao toque e inicie a gravação com o botão Gravar na tela. Após dois minutos, clique no botão Parar e, em seguida, clique em Salvar na janela de prompt que aparece. Dependendo de suas necessidades específicas de pesquisa, salve as informações em um disco ou na nuvem.Para começar, inicie a aquisição por eletrocardiograma ou ECG dos peixes tratados com amiodarona. Para solução de problemas, pressione o botão Parar na interface do dispositivo para interromper o processo de gravação e identificar os canais com sinais inconsistentes. Levante a tampa frontal para acessar as câmaras dos eletrodos e identificar a câmara e os eletrodos específicos que estão causando o problema.Gire o parafuso superior no sentido horário para ajustar a proximidade do eletrodo com o peixe, abaixando o eletrodo para mais perto do peixe. Se apenas aproximar-se não resolver o problema, gire o eletrodo para um ponto diferente no peixe até que um sinal satisfatório seja alcançado. O grupo controle exibiu uma frequência cardíaca consistente de cerca de 120 batimentos por minuto e um intervalo QTc de 330 milissegundos, mostrando padrões normais de ECG.O tratamento com amiodarona resultou em um aumento dependente da dose no intervalo QTc, estendendo-se de 365 milissegundos a 70 micromolares para 546 milissegundos a 200 micromolares e uma diminuição correspondente na frequência cardíaca de cerca de 105 batimentos por minuto a 70 micromolares para 84 batimentos por minuto a 200 micromolares.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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