Name: Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprenda a visualizar microdomínios de Ca²⁺ em células T primárias de murinos e humanos usando microscopia de fluorescência. Este método permite investigar vias de sinalização de cálcio em células imunes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagem de alta resolução para detecção de microdomínios de Ca2+ em células T

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alpha;-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anaconda</td><td>Anaconda</td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Biofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 &micro; m de diâmetro</td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Condessa</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4+ Kit de isolamento de células T</td><td>Célula-tronco</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Célula-tronco magnética multistand</td><td></td><td>18010</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Fura Red-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F3020</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 médio</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Git</td><td>GitHub</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td></tr><tr><td>óleo de imersão</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Soro para bezerros recém-nascidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td>Oracle</td><td>Oracle</td><td>https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptamicina</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G contas magnéticas</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 &micro; M de diâmetro</td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td>Python https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de silício (basilona)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Deconvolução de entropia dependente do tempo</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>q-biogene</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de microdomínios iniciais de ca2+ em células t primárias

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Neste protocolo, delineamos um método atualizado para obter imagens e analisar microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias de camundongos com base em trabalhos anteriores de nosso grupo 1,13. Essa abordagem foi fundamental para desvendar o envolvimento de canais CRAC, como ORAI1, STIM1 e STIM2, bem como canais de liberação intracelular de Ca2+, como RyR1, nos primeiros eventos de sinalização de Ca2+ 4.
Para fazer isso, investigamos a formação espontânea do microdomínio Ca2+ por imagem de camundongos primários não estimulados Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/- e Ryr1-/- e os comparamos com células T primárias de camundongo WT. A análise da formação do microdomínio de Ca2+ abrangeu a velocidade de início do sinal, a amplitude de Ca2+ e o número de sinais por plano confocal. Notavelmente, exceto para as células T Stim2-/-, todas as células T KO exibiram uma diminuição significativa nos sinais locais de Ca2+ e uma concentração reduzida de Ca 2+ citosólico livre basal em comparação com as células WT. Isso nos levou a concluir que a formação de microdomínios de Ca2+ está intrinsecamente ligada à interação de ORAI1, STIM1 e RyR14. Além disso, identificamos e caracterizamos com sucesso os microdomínios espontâneos de Ca2+ na membrana plasmática. Esses microdomínios de Ca2+ foram caracterizados por uma amplitude de Ca2+ de 290 nm ± 12 nm. A utilização de uma abordagem codificada por cores para sinais de Ca2+ permitiu a visualização de microdomínios de Ca2+ em toda a célula. Os resultados destacaram ainda o rápido início dos microdomínios de Ca2+, visíveis em milissegundos, e a capacidade desse método de detectar sinais de Ca2+ com uma longevidade de alguns milissegundos4. Esses microdomínios espontâneos de Ca2+ foram posteriormente identificados como microdomínios de Ca2+ dependentes de adesão (ADCM), dependentes não apenas de SOCE, mas também atuando por meio da cascata de sinalização FAK/PLC-γ/IP3 10 e envolvimento de P2X49. Além disso, esta técnica foi fundamental na confirmação das oxidases duplas 1 e 2 (DUOX1/2) como enzimas produtoras de NAADP21 e HN1L/JPT222 como uma das proteínas de ligação NAADP recém-descobertas23.
A Figura 2 mostra exemplos representativos de microdomínios de Ca2+ em células T CD4+ primárias após contato com o grânulo de WT, bem como de camundongos P2x4-/- e P2x7-/-. As células foram carregadas com os corantes Ca2+ Fluo-4 AM e Fura Red AM e fotografadas a uma taxa de aquisição de 25 ms (40 quadros / s). Para imitar a formação de sinapses de células T, as células foram estimuladas com esferas revestidas anti-CD3 / anti-CD28. A formação inicial do microdomínio Ca2+ foi analisada 1 s antes e até 15 s após o contato do cordão usando o pipeline DARTS. Após o contato com o grânulo, a célula WT mostrou rápida formação de microdomínios de Ca2+ no primeiro segundo após a estimulação no local de contato do grânulo (Figura 2A). Esses microdomínios de Ca2+ se expandiram ainda mais por toda a célula nos 15 s seguintes após o contato com o grânulo. Ao contrário da célula WT, as células P2x4-/- e P2x7-/- (Figura 2B) mostraram diminuição da formação do microdomínio Ca2+ após a estimulação do bead, bem como para o nível basal inferior de P2x4-/-a antes do contato com o bead. Esses achados representativos estão de acordo com os resultados publicados anteriormente por Brock et al.9, indicando a formação do microdomínio Ca2+ em células WT T diretamente após o contato com o bead por mais de 15 s e sinais mais baixos por quadro em células P2x4-/- e P2x7-/- . Além disso, a amplitude nas células P2x4-/-foi significativamente reduzida, estabelecendo ainda mais o papel da sinalização purinérgica nos microdomínios Ca2+ dependentes de adesão.
Além disso, este método também pode ser usado para visualizar microdomínios iniciais de Ca2+ em células T CD4+ humanas primárias (Figura 3). De acordo com as células T murinas primárias, os microdomínios iniciais de Ca2+ são evocados no local de contato do grânulo. No entanto, a resposta geral de Ca2+ parece ocorrer em uma escala de tempo diferente em comparação com as células T CD4+ murinas.
A análise dos sinais locais de Ca2+ de maneira manual não é viável, pois é bastante trabalhosa e subjetiva para o investigador individual. Portanto, desenvolvemos anteriormente um algoritmo no MATLAB Simulink usando suas caixas de ferramentas de processamento e otimização de imagens para pós-processamento13 para análise de microdomínios locais de Ca2+ .
Recentemente, desenvolvemos um novo pipeline de pós-processamento de código aberto chamado DARTS para análise de microdomínio de Ca2+ em imagens de células vivas de alta resolução usando a plataforma de software Python12. Aqui, diferentes algoritmos de deconvolução podem ser selecionados, dependendo da preferência do usuário, uma normalização da forma da célula realizada para compensar as mudanças morfológicas da forma da célula e parâmetros específicos do microscópio e da medição definidos (por exemplo, escala, taxa de quadros, tempo medido) (Figura 4).
Depois de selecionar os parâmetros para a análise do microdomínio de Ca2+ , uma segunda janela pop-up é aberta para cada medição individual para definir o contato do cordão (Figura 5). Para definir o contato do cordão, o usuário pode rolar manualmente pelo arquivo tiff usando o controle deslizante e selecionar a moldura de contato do cordão individualmente. O contato do cordão é selecionado clicando no local de contato do cordão (Figura 5, cordão e contato do cordão indicados por anel e seta amarelos), bem como na seleção da célula. Esta etapa deve ser repetida para cada célula de interesse. Por fim, o pós-processamento automatizado de imagens é aplicado e os dados dos resultados são resumidos e salvos em uma planilha.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho de preparação de lâminas para imagens. (A) Adicione e espalhe BSA e PLL na lâmina usando uma segunda lamínula de vidro. (B, C) Para construir uma câmara, cole os anéis de vedação de borracha usando graxa de silicone na lâmina. Certifique-se de que todo o anel esteja coberto com uma fina camada de graxa para ter o isolamento adequado da câmara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> Figura 2: Células representativas dos microdomínios Ca2+ dependentes do receptor de células T em uma célula T CD4+ do tipo selvagem murino primário (WT) (A), P2x4-/- ou P2x7-/-(B). As células T CD4+ foram isoladas negativamente e carregadas com Fluo-4 AM e Fura Red, conforme descrito acima. As células T foram analisadas usando o pipeline DARTS, resultando em imagens celulares comparáveis aos resultados publicados anteriormente9. (A) Célula T primária WT 1 s antes da estimulação com esferas revestidas anti-CD3 / anti-CD28 e até 15 s após a estimulação (barra de escala de 5 μm), bem como gráfico de superfície 3D de um zoom de 0 s a 0,65 s na região de contato do cordão (barra de escala de 1 μm). (B) Faixa superior: célula T primária P2x4-/- representativa 1 s antes e até 15 s após a estimulação do grânulo. Faixa inferior: célula T primária P2x7-/- representativa 1 s antes e até 15 s após a estimulação do grânulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> Figura 3: Microdomínios de Ca2+ em uma célula T humana primária representativa após estimulação com TCR. As células T CD4+ humanas primárias foram isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de revestimentos leucocitários e carregadas com Fluo-4 AM e Fura Red, conforme descrito acima. A figura mostra uma célula T humana primária 1 s antes da estimulação com esferas revestidas com anti-CD3 e até 15 s após a estimulação (barra de escala de 5 μm), bem como um gráfico de superfície 3D de um zoom de 6,25 s a 7,5 s na região de contato do grânulo (barra de escala de 1 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> Figura 4: A interface gráfica do usuário (GUI) do DARTS. A GUI é dividida em quatro áreas. Na área Entrada/Saída, você precisa fornecer informações sobre os dados brutos, incluindo o diretório de origem e a configuração da imagem (dois canais por arquivo ou canais separados), bem como o diretório de resultados. Na área Propriedades de Medição, o experimento precisa ser descrito com todas as suas informações relevantes, como escala (mícrons por pixel), taxa de quadros e intervalo de medição em relação ao ponto de partida determinado posteriormente. Em seguida, um pipeline de processamento que consiste em etapas de pós-processamento, normalização de forma e análise real (detecção de microdomínio e acúmulo de dados do alvo de dardos) pode ser montado. Por fim, as configurações podem ser salvas ou carregadas do computador. Uma vez configurada a análise, clique em Iniciar para prosseguir. Para ler mais sobre a configuração, visite https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> Figura 5: Definição manual dos contatos do cordão. Se contas forem adicionadas às células durante o experimento, o tempo de contato inicial da conta com uma célula de interesse e o local de contato devem ser definidos manualmente. Isso é feito rolando pelos quadros com o controle deslizante e encontrando uma posição (x,y) em um ponto de tempo t. Para preencher automaticamente o campo de informações de contato do cordão, o usuário clica na metade esquerda da imagem do microscópio na posição de contato do cordão. Em seguida, para associar uma célula ao contato do cordão, o usuário clica em uma posição dentro da célula que tenha um contato do cordão. A informação tem de ser confirmada selecionando ADD bead. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

imaging-initial-ca2-microdomains-in-primary-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

O protocolo descreve uma técnica para estudar a capacidade das células T policlonais humanas de primário para formar sinápticas interfaces usando bilayers do lipid planar. Usamos esta técnica para mostrar a capacidade de formação de sinapse diferencial de células T humanas primárias derivado dos gânglios linfáticos e sangue periférico.

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

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O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Aprenda a visualizar microdomínios de Ca²⁺ em células T primárias de murinos e humanos usando microscopia de fluorescência. Este método permite investigar vias de sinalização de cálcio em células imunes.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca²⁺ em células T primárias

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