Name: Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprenda a avaliar a citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando um bioensaio ADCC. Este método rápido permite resultados em um dia para pesquisa em imunoterapia oncológica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Células de câncer de tireoide como efetores em um bioensaio ADCC para imunoterapia contra o câncer

<ol><li>Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity%3A+a+strategy+for+improving+antibody-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antib+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy.</a> Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).</li>
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<li>Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Diluir 10x em PBS para fazer 0,05% de Tripsina</td></tr><tr><td>1x Tris Buffer Salino (TBS)</td><td>1ª BASE</td><td>BUF-3030-1X1L</td><td>Para lavagem de membrana em western blotting</td></tr><tr><td>1,5 M Tris Buffer, pH 8,8</td><td>1ª BASE</td><td>BUF-1419-1L-pH8.8</td><td>Para preparação de gel SDS</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td>Para preparação de amostras de western blotting</td></tr><tr><td>30% de solução de acrilamida/Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610158</td><td>Para preparação de gel SDS</td></tr><tr><td>4x Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610747</td><td>Para preparação de amostras de</td></tr><tr><td>microplaca de poliestireno branco de 96 poços de western blotting com fundo plano transparente</td><td>Corning</td><td>Incorporated 3610</td><td>Para ensaio ADCC</td></tr><tr><td>Células efetoras de bioensaio ADCC (0,65 mL)</td><td>Promega</td><td>G7011</td><td>Inclui no kit principal de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 1 frasco</td></tr><tr><td>Kit de núcleo de bioensaio repórter ADCC</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Mencionado como kit de bioensaio ADCC para ensaio ADCC neste experimento</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>Para preparação de gel SDS</td></tr><tr><td>Bevacizumabe (anticorpo anti-VEGF humanizado)</td><td>MVASI-Use</td><td></td> <td>como anticorpo de controle negativo no ensaio</td></tr> <tr><td>ADCCBHT-101</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC279</td><td>Linha celular de câncer de tireoide papilar anaplásico humano&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de ensaio de luciferase Bio-Glo</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x substrato</td></tr> de <tr><td>ensaio de luciferase Bio-Glo de 10 mL (liofilizado)</td><td>Promega</td><td>G7941</td><td>Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 1 frasco</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>GenFollower</td><td>GD00235</td><td>Para remover a célula do frasco de cultura</td></tr><tr><td>Cetuximab (anticorpo anti-EGFR quimérico)</td><td>ERBITUX-Uso</td><td></td> <td>como anticorpo terapêutico no ensaio ADCC</td></tr><tr><td>Substrato de HRP quimioluminescente</td><td>Merck Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td>Para detecção de proteínas em western blotting</td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td>Para preparação de gel SDS</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Suplemento de meios de cultura</td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>de imagem iBright CL1500Thermo Scientific</td><td>2462621100038</td> Para detecção de proteínas em L-glutamina <td>western blotting</td></tr><tr><td>, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Suplemento de meio de cultura Soro</td></tr><tr><td>de baixa IgG</td><td>Promega</td><td>G7110</td><td>Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Megafuge</td><td>8R Thermo Scientific</td><td>42876589</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Anticorpos monoclonais anti-EGFR de camundongo</td><td>BD Biosciences</td><td>610016</td><td>Anticorpo primário em western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpos monoclonais anti-VEGFR de camundongo</td><td>BD Biosciences</td><td>571194</td><td>Anticorpo primário em</td></tr><tr><td>tampão de dissociação celular não enzimática</td> de western blotting <td>Sigma Aldrich</td><td>C5789-100ML</td><td>Para colheita de células do frasco T75</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>Antibacteriano para meios de cultura</td></tr><tr><td>Tamponamento fosfato Salino (PBS), pH 7,2, Estéril filtrado</td><td>1ª BASE</td><td>CUS-2048-1x1L</td><td>Use como solução de lavagem para células</td></tr><tr><td>Pierce Kit de ensaio BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Para medir a concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Inibidor de protease e fosfatase</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td>Para digestão de proteínas na preparação de amostras para western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrana (Immobilin-P)</td> <td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Para transferência de proteínas em western blotting</td></tr><tr><td>Coelho anti-rato IgG, Fc&gamma; Anticorpo secundário conjugado com HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-035-046</td><td>Anticorpo secundário em Western blotting</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-XA</td><td>Meios de cultura de células</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Promega</td><td>G7080</td><td>Inclui no kit de núcleo de bioensaio do repórter ADCC (Promega G7010), 1 x 36 mL</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Merck Millipore</td><td>70166-500G</td><td>Para bloqueio de membrana em western blotting</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>1ª BASE</td><td>BIO-2050-500g</td><td>Para preparação de gel</td></tr><tr><td>SDS SW-1736</td><td>Cytion</td><td>300453</td><td>Linha celular de câncer de células escamosas da tireóide humana</td></tr><tr><td>Frascos de cultura T75 SPL</td><td>Lifesciences</td><td>70075</td><td>Frasco de cultura de células</td></tr><tr><td>Tecan Multimode Reader modelo Spark 10M</td><td>Tecan</td><td>1607000294</td><td>para quantificação de luminicência</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610801</td><td>Para preparação de gel SDS</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega</td><td>H5151</td><td>Para lavagem de membrana em western blotting</td></tr><tr><td>Analisador de viabilidade de células Vi XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>AL15072</td><td>Contador de células</td></tr></tbody></table>

avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Assessing Antibody-dependent, Cell-mediated Cytotoxicity in Cancer Cells using Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Reporter Bioassay

A expressão de EGFR e VEGFR nas células-alvo BHT-101 e SW-1736 foi detectada usando western blotting. A expressão de EGFR foi detectada em células BHT-101 e SW-1736, mas não a expressão de VEGFR (Figura 3).
Usando o kit de bioensaio ADCC, detectamos a reação ADCC do anticorpo anti-EGFR, cetuximabe, usando linhagens celulares positivas para EGFR, BHT-101 e SW-1736, como células-alvo. O bevacizumabe, um inativador do VEGF, foi usado como anticorpo de controle negativo. Diferentes concentrações de anticorpos e células efetoras foram incubadas com as células-alvo. O sinal de luminescência foi detectado por meio de um leitor de placas (Figura 2). Uma maior dobra de indução de atividade de ADCC foi encontrada em grupos de cetuximabe (anticorpo anti-EGFR), mas nenhuma atividade de ADCC foi observada em bevacizumabe (antagonista de VEGF) para ambas as linhagens celulares. Isso demonstrou o efeito ADCC direcionado aos antígenos da membrana extracelular do EGFR para ambas as linhagens celulares. Usando este método, a reação ADCC foi validada na presença de Cetuximabe em duas linhagens celulares anaplásicas de câncer de tireoide (BHT101 e SW1736) (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig01.jpg"> 
Figura 1: Um diagrama esquemático mostrando a reação do ADCC com o kit de bioensaio do ADCC. Os locais de ligação ao antígeno no anticorpo terapêutico se ligam aos antígenos de superfície nas células-alvo. Essa ligação leva à ligação da porção Fc do anticorpo aos receptores FcƳRIIIa das células efetoras, que foram geneticamente modificadas com NFAT-RE luc, produzindo um sinal de luminescência nas células efetoras. Esta figura foi modificada do manual do kit ADCC Reporter Bioassay Core com permissão12. Abreviaturas: ADCC = Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos; Fc = Região cristalizável do fragmento; NFAT = Fator Nuclear de Célula T Ativada; RE = Elemento de resposta; luc = Luciferase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig02.jpg"> 
Figura 2: Leitura de luminescência e diagrama experimental do projeto de placa de 96 poços do sistema de co-cultura ADCC. Os sinais de luminescência são lidos por um leitor de luminescência. Linha A: 1st-9 th poços contêm ADCC Bioassay Buffer. Linha B: 3rd-8 th poços contêm o sistema de reação ADCC do BHT101 (células-alvo + anticorpo + células efetoras). O2º poço está sem anticorpos. O9º poço contém apenas tampão de bioensaio ADCC. Linha C: 3poços rd-8 contêm o sistema de reação ADCC do SW-1736 (célula-alvo + anticorpo + células efetoras). O2º poço está sem anticorpos. O9º poço contém apenas tampão de bioensaio ADCC. Linha D: 1st-9 th poços contêm tampão de ensaio. Abreviaturas: ADCC = Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos; AB = tampão de bioensaio ADCC; VEGFR = Receptor do Fator de Crescimento Epitelial Vascular; EGFR = Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico; mAb = anticorpo monoclonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig03.jpg"> 
Figura 3: Detecção da expressão de EGFR e VEGFR no carcinoma de tireoide BHT-101 e SW-1736 usando western blotting. A expressão de EGFR, mas não de VEGFR, foi detectada em ambas as linhagens celulares. A B-actina foi usada como controle de carga. Abreviaturas: EGFR = receptor do fator de crescimento epidérmico; VEGFR = fator de crescimento epidérmico vascular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67077/67077fig04.jpg"> 
Figura 4: Indução de dobras da atividade do ADCC. (A) A linhagem celular de câncer de tireoide BHT-101 exibe um efeito ADCC na presença do anticorpo anti-EGFR Cetuximab. (B) A linha celular de câncer de tireoide SW-1736 exibe um efeito ADCC na presença do anticorpo anti-EGFR Cetuximab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67077/67077fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

The method for antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity (ADCC) represents an important tool to assess the efficacy of therapeutic antibodies in ...

assessing-antibody-dependent-cell-mediated-cytotoxicity-cancer-cells

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