Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

As vesículas extracelulares circulantes como biomarcadores são um campo relativamente novo na pesquisa de biomarcadores com imenso potencial. Nosso protocolo visa fornecer uma abordagem prática para implementar a descoberta e detecção de biomarcadores ligados a vesículas extracelulares em um ambiente de departamento de emergência. Evidências emergentes mostraram que a carga molecular encontrada nas vesículas extracelulares e na circulação contém proteínas e RNA de interesse em múltiplos contextos de doenças.

Várias novas vesículas extracelulares, biomarcadores fechados têm sido associados ao diagnóstico e prognóstico de várias entidades de doenças cardiovasculares. Os principais desafios no campo da descoberta de biomarcadores de vesículas extracelulares circulantes são a preservação de vesículas extracelulares e a aquisição de plasma dependente da dinâmica de liberação de EV. Portanto, um protocolo rigoroso incorporado à rotina clínica é necessário para evitar a degradação do EV e manter resultados reprodutíveis, particularmente ao aplicar métodos de análise em larga escala, como a proteômica.

A descoberta de biomarcadores proteicos contidos no EV circulante depende fortemente do tempo de coleta de sangue inicial em relação ao início dos sintomas e da duração do armazenamento da amostra devido à degradação natural do EV. Este protocolo oferece um protocolo prático de isolamento de EV de plasma e introdução à análise proteômica para ser integrado ao fluxo de trabalho clínico de um departamento de emergência. Nossa próxima pesquisa se concentrará na integração de diferentes coletivos de pacientes em nossa metodologia, entre os quais pacientes com insuficiência cardíaca descompensada, arritmias ou taquicardia, cardiomiopatia, bem como estudos longitudinais de pacientes submetidos a cirurgia de ponte de safena.

Usando este protocolo, pretendemos identificar novos biomarcadores ligados a EV que contribuem para o diagnóstico e prognóstico das patologias acima mencionadas. Para começar a centrifugar o plasma sanguíneo humano, usando uma ultra centrífuga com um rotor de ângulo fixo sem quebrar. Depois que os detritos e o corpo apoptótico assentarem, transfira o sobrenadante para um novo tubo e ultracentrifugue a 100.000 G por duas horas a quatro graus Celsius sem quebrar para isolar as vesículas extracelulares.

Remova o tubo cuidadosamente após a ultracentrifugação. Usando uma pipeta eletrônica, aspire suavemente o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro de plasma empobrecido de vesícula extracelular. Mude para uma pipeta de 1000 microlitros para pipetar cuidadosamente o plasma restante sem perturbar o pellet da vesícula extracelular.

Incline gradualmente o tubo durante a pipetagem para garantir que não resta plasma e ressuspenda o pellet em PBS. Em seguida, dilua a solução estoque de vesículas extracelulares com PBS gelado em diferentes proporções para atingir uma faixa de contagem final de 10 a 100 nanopartículas por quadro durante o rastreamento. Ligue o instrumento NTA e inicie o software aplicável no computador conectado.

Insira a câmara no caixão de laser e clique em iniciar câmera para ativá-la. Puxe um mililitro de PBS em uma seringa e conecte-o ao tubo frontal. Lave bem o sistema de tubulação, garantindo que não haja bolhas de ar na câmara.

Monitore a câmera para detectar bolhas de ar ou partículas contaminantes. Agora retire a diluição de trabalho da vesícula extracelular preparada em uma seringa de um mililitro e injete-a na câmara. Vá para as guias de captura e processo para ajustar o ganho da tela para corresponder ao brilho do monitor.

Modifique o nível da câmera para melhorar a diferenciação de nanopartículas na tela. Defina um limite de detecção apropriado na guia do processo para diferenciar as partículas do ruído de fundo. Foque a câmera usando a roda de foco em cada lado do instrumento até que as nanopartículas apareçam nítidas na tela.

Depois de definir uma temperatura constante de 22 graus Celsius para todas as medições nas configurações de hardware, clique no botão executar para iniciar a medição. Grave pelo menos três vídeos de 30 segundos cada para cada execução de amostra. Clique em alterar para inserir o fator de diluição das amostras e, finalmente, clique em exportar para salvar os resultados.

Usando análise de rastreamento de nanopartículas, vesículas extracelulares foram identificadas e visualizadas com base em brownie e movimento. A análise revelou uma concentração média de partículas de 1,2 vezes 10 elevado a 10 partículas por mililitro no plasma de indivíduos saudáveis, demonstrando a presença de vesículas extracelulares. O tamanho médio das vesículas extracelulares plasmáticas foi medido em 184,7 nanômetros, consistente com as dimensões típicas das vesículas extracelulares.