Name: Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprenda a gerar organoides vasculares homogêneos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando inibidores de ROCK e confinamento em micropoços. Este método melhora a reprodutibilidade e aplicações em modelagem de doenças.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Organoides vasculares derivados de hiPSC para triagem de drogas e modelagem de doenças

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
<li>Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKosyakova%2C+N+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2019).</li>
<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>reconstitui com 0,25 mL de glicerol a 50%,&nbsp; armazene a -20 &deg; C por até 1 ano, razão de diluição para uso: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>reconstitui com 0,25 mL de glicerol a 50%, armazene a -20&deg; C por até 1 ano, taxa de diluição para uso: suplemento de B27 1:1000</td></tr><tr><td>menos vitamina A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>descongelar a 4 &deg; C, alíquota e armazene a -20 & C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td><td>reconstituir com ddH2O estéril a uma concentração de 100 ng/&micro; L, alíquota e armazene a -20 &deg; Anticorpo C</td></tr><tr><td>CD31</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>taxa de diluição: 1:400</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td><td>faça a solução estoque a 12 mM com DMSO e armazene a -20 &deg; C por até 1 ano.</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td><td>faz a solução estoque em 100 &micro; M com DMSO e armazene a -20 &deg; C por até 1 ano.</td></tr><tr><td>Colágeno I&nbsp;</td>Microscópio Confocal <td>Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Elplasia Corning Contador</td> de células automatizado <td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, pó</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>faça 10x solução estoque com ddH2O biograu e esterilize-a com um 0,2 &micro; m. Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>fazer a solução estoque a 1 mM com DMSO e armazenar a -20 &graus; C por até 1 ano.</td></tr><tr>Razão de diluição do <td>anticorpo ERG</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>: 1:400</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>descongela a 4 &deg; C&nbsp; e alíquota, loja em&nbsp; -20 & graus; C por até cinco anos, ou armazene a 4 & C por até um mês</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td><td>reconstituir com ddH2O estéril a uma concentração de 100 ng/&micro; L, alíquota e armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fluorodish Cell Culture Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td>reconstituir com DMSO a uma concentração de 12 mM, alíquota e armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td><td>Suplemento</td><td>Gibco 15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparina, 100 kU</td><td>MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>reconstituir com ddH2O estéril na concentração de 4 kU/mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>Substituição de Soro Knockout</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>descongelar a 4 &deg; C, alíquota e loja em -20&deg; C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>descongelar a 4 &deg; C, alíquota e loja a -80&deg; C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (NEAA, 100x)</td> <td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>descongelar a 4 &deg; C, alíquota e loja em -20&deg; C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>suplemento N2 (100x)</td> <td>Gibco</td><td>17502048</td><td>descongelar a 4 &deg; C, alíquota e loja em -20&deg; C, evite o ciclo de congelamento e descongelamento</td></tr><tr><td>Solução de NaOH (1 M)</td><td>Cytiva&nbsp; HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>reconstituir com 10 mL de ddH2O estéril, armazenar a 4 &deg; C por até duas semanas</td></tr><tr><td>paraformaldeído, 20%</td> <td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15713S</td><td>diluído com</td></tr><tr><td>PBS PBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta; anticorpo</td><td>R& Relação</td> de diluição D <td>AF385</td><td>: suplemento de poliamina 1:400</td></tr><tr><td>(1000x)</td><td>Reagente de limpeza Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Rapiclear, 1,49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio monohidratado</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td><td>dissolver com ddH2O para solução estoque a 1% (peso / v)</td></tr><tr><td>TBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>faça a solução estoque a 1 mM com DMSO e armazene a -20&deg; C por até 1 ano.</td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td><td>reconstituir com ddH2O estéril a uma concentração de 100 ng/&micro; L, alíquota e loja a -20&deg; O</td></tr></tbody></table>

geração de organoides vasculares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

A Figura 1A apresenta o esquema deste protocolo, incluindo os principais componentes usados em cada estágio. A diferenciação iniciou-se com a formação de EB, seguida pela indução do mesoderma e especificação da linhagem vascular (Figura 1B-D). Os agregados cresceram maiores e menos esféricos ao longo do tempo. Os organoides começaram a mostrar arestas no dia 5. Depois de incorporadas na mistura de matriz de membrana basal de colágeno I, as células endoteliais vasculares e pericitos brotaram e cresceram para formar redes vasculares complexas já no dia 7 (Figura 1E). Como o principal objetivo desse método modificado é minimizar as variações entre os diferentes lotes de geração, medimos o tamanho do EB a partir de dois lotes independentes, e tanto as medidas de tamanho quanto a análise estatística confirmaram a consistência e uniformidade com esse método (Figura 1F).
Para validar a diferenciação vascular, os organoides foram coletados no dia 5 antes da inclusão e corados com marcadores vasculares, incluindo CD31, ERG1 e PDGFRβ. Os organoides expressaram CD31, ERG1 e PDGFRβ (Figura 2), indicando a presença de células endoteliais vasculares e pericitos.
Após a clareação do tecido, as redes vasculares foram analisadas com microscopia de imunofluorescência total (Figura 3A). Os organoides maduros foram corados com CD31, ERG1 e PDGFRβ no dia 17 (Figura 3B, amostra no bloco de gel) e no dia 28 (Figura 3C, a amostra foi recuperada do bloco de gel e cultura individualmente em uma placa de 96 poços; observe que a rede vascular nas bordas envolveu os esferoides em vez de se expandir radialmente após a recuperação do bloco de gel).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg"> Figura 1: Geração de organoides vasculares. (A) Esquema das etapas e cronograma para geração de organoides vasculares. (BE) Imagens representativas de campo claro de organoides vasculares em diferentes estágios. Barras de escala: 100 μm. (F) Análise estatística em tamanho de EB de dois lotes diferentes de geração de EB utilizando o método de micropoços apresentado neste trabalho. Para a geração de EB, foram utilizadas 1.000 células por micropoço, e para os lotes 1 e 2, n = 42 e n = 40, respectivamente. A significância é apresentada como ns, não significativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg"> Figura 2: Imunomarcação de organoides vasculares antes da incorporação em gel. Imagens fluorescentes representativas de organoides corados com os marcadores endoteliais (A) CD31 (verde) e (B) ERG1 (verde), bem como (C) o marcador pericito, PDGFRβ (verde), respectivamente. Os núcleos foram contracorados com DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg"> Figura 3: Caracterizações imunofluorescentes da rede vascular em organoides vasculares. (A) Uma imagem representativa mostra organoides vasculares embebidos em gel no prato de vidro após a limpeza do tecido. Os organoides eram transparentes, mas visíveis sob uma luz UV de 385 nm. (B) Uma imagem 3D representativa de montagem total do organoide vascular no dia 17. O organoide vascular foi corado com DAPI (azul), o marcador de células endoteliais vasculares, CD31 (verde) e o marcador de pericito, PDGFRβ (magenta). (C) Uma imagem 3D representativa de montagem total de um organoide vascular recuperado no dia 28, corado com os marcadores endoteliais CD31 (vermelho) e ERG1 (verde). Barras de escala: 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>meio de expansão hiPSC</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plus meio basal</td>
			<td>400 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento mTeSR Plus</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Composição do meio de expansão hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>meio de semeadura hiPSC</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>Meio de expansão PSC</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>Croman 1 (100 μM)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Emricasan (1 mM)</td>
			<td>30 μL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de poliamina (1000x)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Composição do meio de semeadura hiPSC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>N2B27 médio</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td>
			<td>48,6 mL</td>
		</tr><tr><td>Meio neurobasal</td>
			<td>48,6 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX (100x)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (NEAA, 100x)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (1000x)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento N2 (100x)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de B27 sem vitamina A (50x)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Heparina 4 kU/mL</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Composição do meio N2B27.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Meio de indução mesoderma (MIM)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 médio</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>BMP4 (100 ng/μL)</td>
			<td>0,9 μL</td>
		</tr><tr><td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Composição do meio de indução do mesoderma (MIM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Meio de diferenciação vascular 1 (VDM1)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 médio</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>Forsklin (12 mM)</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 5: Composição do meio de diferenciação vascular 1 (VDM1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mistura de colágeno I</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Colágeno I (3,61g/mL)</td>
			<td>2,77 mL</td>
		</tr><tr><td>10x DMEM/F12 médio</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Bicarbonato de sódio, 7,5%</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES, 1 M</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>0,73 mL</td>
		</tr><tr><td>NaOH, 1M</td>
			<td>75 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 6: Composição da mistura de colágeno I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Colágeno I - mistura de matriz de membrana basal</td>
			<td>6,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Colagem I mistura</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Matrigel (10 mg/ml)</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 7: Composição da mistura de matriz de membrana basal de colágeno I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Meio de diferenciação vascular 2 (VDM2)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX™</td>
			<td>3,67 ml</td>
		</tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (1000x)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Heparina 4 kU/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Reposição de soro nocaute</td>
			<td>0,75 mL</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>FGF2 (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 8: Composição do meio de diferenciação vascular 2 (VDM2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer de bloqueio</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Soro de burro</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr><tr><td>Pré-adolescente 20</td>
			<td>0,25 mL</td>
		</tr><tr><td>Tritão X-100</td>
			<td>0,25 mL</td>
		</tr><tr><td>Solução de desoxicolato de sódio (1%, p/v)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>46,5 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 9: Composição do tampão de bloqueio para imunocoloração.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

vascular-organoid-generation-from-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O vídeo demonstra um método para gerar organoides cerebrais humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas. Ele mostra como a neuroesfera forma uma camada neuroectodérmica, que suprime a formação de outras camadas germinativas. As neuroesferas são incorporadas em uma matriz de gel 3D e formam brotos neuroepiteliais. Quando incubados com meios organoides, esses brotos neuroepiteliais se diferenciam em regiões cerebrais específicas, resultando na formação de organoides cerebrais...

Um método in vitro para gerar organoides cerebrais humanos

Este vídeo descreve a criação de organoides do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs), demonstrando a progressão de agregados de células-tronco para estruturas complexas que imitam o córtex do cérebro e se diferenciam em vários tipos de neurônios.

Geração de organoides cerebrais do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.

Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Aprenda a gerar organoides vasculares homogêneos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando inibidores de ROCK e confinamento em micropoços. Este método melhora a reprodutibilidade e aplicações em modelagem de doenças.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Explorar mais vídeos