Name: Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica. Este método sensível permite monitorar enzimas em tempo real sob diferentes condições de pH e temperatura.

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A abordagem de fluorescência raciométrica é um método analítico que usa proporções de sinais de fluorescência em vez de depender apenas da intensidade de um único sinal 1,2. A vantagem de usar as proporções é que elas fornecem calibração interna e compensam muitos fatores aleatórios, como variações nas concentrações de amostras e sondas, parâmetros do instrumento, etc. Isso aumenta a precisão e a sensibilidade das sondas fluorescentes.
No contexto específico das sondas de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), o termo "raciométrico" refere-se ao fato de que a medição é baseada na razão de dois sinais de emissão do par de fluoróforos doadores e aceptores de FRET. Para quantificar a atividade do analito alvo, as sondas FRET raciométricas usam a razão das intensidades de emissão do aceptor/doador (ou, em alguns casos, a relação doador/aceitador invertida). A razão está diretamente relacionada à eficiência do FRET. Ele fornece um mecanismo de autonormalização que minimiza o ruído de fundo e leva em conta as variações nas condições de iluminação e na concentração da sonda3.
Aplicações interessantes recentes do método raciométrico incluem seu uso em biossensores eletroquímicos raciométricos para a detecção de DNA tumoral circulante (ctDNA) 4 , 5 , em bio-nanomáquinas movidas a movimento browniano para detecção de FRET da fase fagocítica da apoptose6 e para marcação expressa de FRET e análise da depuração fagocítica7. A abordagem raciométrica FRET descrita neste trabalho é útil para a avaliação quantitativa da atividade da DNase. As medições do ensaio são baseadas nas proporções das emissões do par FRET. Devido à sua capacidade de detectar até mesmo clivagem de DNA menor e lenta, o ensaio é particularmente adequado para a investigação de atividade nucleolítica fraca que requer períodos de observação mais longos e para experimentos em diferentes níveis de pH.
Aqui, algumas vantagens específicas do ensaio raciométrico FRET são ilustradas por sua aplicação para estudar a atividade da DNase de um inibidor fraco da nuclease-leucócitos elastase (LEI). O relatório inclui um protocolo detalhado com instruções passo a passo e uma descrição da análise de dados raciométricos.
Descrição da sonda FRET raciométrica
A sonda FRET raciométrica é um oligo de DNA de 38 meros auto-complementar que transporta o par FRET doador-aceitador de FAM-TAM (Fluoresceína-Tetrametilrodamina). Sua sequência é 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. O 38-mer auto-hibridizante assume uma conformação em forma de grampo, compreendendo dois grampos de cabelo conectados de 23 e 15 nucleotídeos, que posicionam seus dois fluoróforos a 23,8 Å um do outro. Isso é significativamente mais próximo do que o raio de Förster para este par, R0 = 55 Å8. Tal posicionamento corresponde a uma eficiência muito alta de transferência de energia do doador para o aceptor7: EFRET = 0,993477. Como resultado, quando iluminada no comprimento de onda de excitação FAM (488 nm), a sonda FRET emite fluorescência no comprimento de onda de emissão do aceptor TAM (580 nm), enquanto a emissão FAM (525 nm) é suprimida.
A Figura 1A mostra a estrutura secundária da sonda prevista pela UNAF, com pequenos loops em ambos os ápices do gancho de cabelo devido ao impedimento estérico da curvatura apertada. O esquema de detecção de quebra de DNA pela sonda FRET é apresentado na Figura 1B. Isso mostra que a quebra da oligossonda por uma DNase separa seu par FRET. Essa separação produz mudanças drásticas nos espectros de emissão de ambos os fluoróforos na sonda. A Figura 1C apresenta os espectros de emissão da sonda antes e depois de sua clivagem e demonstra que a divisão do par FRET após a clivagem da sonda DNase II aumenta a emissão do doador a 525 nm (ID 525 nm) e simultaneamente diminui a emissão do aceptor a 580 nm (IA 580 nm). A Figura 1D mostra as razões PAGE gel e FRET correspondentes aos espectros de emissão. A clivagem da sonda DNase II produziu duas bandas largas correspondentes a fragmentos FAM de 12-16 mer (verde) e TAM de 20-24 mer (vermelho), indicando cortes aleatórios do 38-mer em ambos os lados do T23 nas proximidades da área de conexão entre os grampos de cabelo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Estrutura e operação da sonda FRET raciométrica. (A) Estrutura secundária prevista da sonda FRET gerada pela UNAFold. (B) Representação esquemática da sonda FRET em funcionamento. A sonda FRET raciométrica é um oligonucleotídeo de 38 mer em forma de grampo marcado com um doador FRET (FAM) e um aceptor (TAM) a uma distância FRET efetiva de 23,8 Å, garantindo &gt;99% de eficiência FRET. A clivagem da oligossonda por uma DNase separa o par FRET, abolindo o FRET. (C) Espectros de emissão da sonda FRET antes e depois da clivagem mediada por DNase II. Antes da clivagem, a emissão de FAM é suprimida e a emissão de TAM é proeminente. A clivagem mediada por DNase separa FAM e TAM, restaurando a emissão de FAM (pico de 525 nm) e abolindo a emissão de TAM (queda de 580 nm). λ excitação = 488 nm. (D) Avaliação raciométrica e eletroforética da sonda FRET antes e depois da clivagem da DNase II. Painel superior: Razões FRET (RD / A = ID 525 nm / IA 580 nm), representando uma medida quantitativa do estado da sonda. Vermelho: não cortado; verde: DNase II-clivada. Painel inferior: Gel PAGE desnaturante correspondente aos dados fluorométricos. A clivagem da DNase II produz fragmentos marcados com FAM (12-16 nt, verde) e fragmentos marcados com TAM (20-24 nt, vermelho), indicando clivagem perto da conexão entre grampos de cabelo, flanqueando T23. O controle não clivado mostra fluorescência amarela. Escada: Oligonucleotídeos marcados com FAM e TAM correspondentes aos segmentos 5 'e 3' da sonda de 38 meros, com marcadores fluorescentes em suas posições originais. Condições de reação: tampão acetato de sódio 10 mM (pH 5,2), sonda FRET de 1 pmol/μL, DNase II 0,0033 U/μL, 24 h a 37 °C. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λ excitação = 488 nm. UNAFold condições: sonda FRET de 1 μM, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Embora as mudanças nos espectros de emissão de teste individuais sejam óbvias, as comparações quantitativas entre um grande número de espectros de emissão requerem um parâmetro quantitativo mais fácil de usar e compacto. Este papel é desempenhado pelo rácio FRET. O método de fluorescência apresentado pertence a um grupo de abordagens raciométricas que dependem das razões diretas (dois canais) de emissões de fluorescência dos membros do par FRET para suas avaliações quantitativas 2,9.
A abordagem utiliza a razão de emissões doadores/aceitadores (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), que está relacionada à eficiência do FRET e caracteriza quantitativamente a condição do 38-mer (quebrado ou intacto). A relação ID / IA fornece um mecanismo de autonormalização que inerentemente explica variações em fatores como concentração da sonda, intensidade de excitação e fotobranqueamento3. A abordagem é adequada apenas para sondas FRET que têm doador e aceitador ligados na mesma sonda, onde sua proporção é conhecida e constante. Por esse motivo, a abordagem não precisa considerar a excitação direta da diafonia do aceitador ou do doador2. A estequiometria fixa doador-aceitador da sonda garante que as taxas de emissão doador/aceitador não sejam afetadas por essas variações e reflitam diretamente a condição da sonda. Como resultado, a proporção de emissões doador-aceitador fornece um parâmetro quantitativo de clivagem de DNA com normalização de sinal embutida 2,3.
O ensaio emprega a razão ID / IA ( em vez da relação IA /I D oposta) porque essa proporção descreve a cessação da FRET após a clivagem da sonda e, portanto, muda na mesma direção que o aumento da atividade da DNase com o aumento da clivagem. Isso é ilustrado pela Figura 1D, que mostra a razão FRET da sonda raciométrica e sua eletroforese PAGE antes e depois de sua clivagem por DNase II, ambas correspondendo aos espectros da Figura 1C. Para demonstrar a conveniência, a economia de tempo e a facilidade de uso do ensaio FRET raciométrico, ele foi aplicado para descobrir e estudar a atividade da DNase de um inibidor fraco da nuclease-leucócitos elastase (LEI).
LEI de nuclease fraca
O inibidor de protease LEI é naturalmente metaestável, ou seja, topologicamente desequilibrado. Esse recurso é essencial para seu mecanismo inibitório. Quando sua protease alvo cliva a alça de sítio reativo LEI (RSL), a molécula inibidora de protease sofre uma mudança conformacional drástica, esticando mecanicamente a protease em uma forma inativa10,11. Notavelmente, isso também quebra e distende a própria molécula de LEI e desmascara um sítio DNase críptico que é coberto por sua dobra nativa, convertendo assim o LEI em uma endonuclease ativa L-DNase II (DNase II derivada de LEI)11,12. O sítio DNase críptico também pode ser exposto pela desnaturação e quebra do LEI causada por sua incubação noturna em pH 2 em ácido sulfúrico10,13. A utilização deste ensaio FRET para estudar o LEI demonstrou que os tratamentos de desnaturação química agressivos e a clivagem enzimática direcionada não são estritamente necessários para desmascarar a atividade nucleolítica latente do LEI.
A aplicação e o protocolo apresentados da abordagem RACIOMÉTRICA FRET descrevem a descoberta de uma atividade fraca de DNase inerentemente presente em LEI normal e não desnaturado. A descoberta da capacidade nucleolítica intrínseca do LEI não clivado e sua análise foi possível devido à adequação do ensaio para longos períodos de observação em diferentes níveis de pH ácido.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Falcão</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de DNA FRET</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; Fluoresceína-dT; &nbsp; TAM &ndash; Tetrametilrodamina-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital SLR EVOLT</td><td>Olimpo</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel com fonte de alimentação</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoproteína</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel LiCOR</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Gel PAGE pré-moldado</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão de acetato de sódio pH 5,2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro</td><td>Tecano</td><td></td><td>Saffire 2</td></tr></tbody></table>

avaliação da atividade da dnase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

Este estudo representativo destaca as vantagens específicas da abordagem RACIOMÉTRICA FRET para investigar reações enzimáticas lentas que requerem longos períodos de observação. Em particular, o aplicativo demonstra a detecção e análise da atividade DNase inerente do LEI usando um sistema FRET raciométrico. Os resultados deste estudo são apresentados na Figura 2.
Usando essa abordagem, demonstramos ...

Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

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