Name: Visualizando a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a visualizar a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares de camundongos. Este método avança a compreensão da degeneração cerebelar na ataxia-telangiectasia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Células cerebelares de Purkinje: resposta a danos no DNA em culturas organotípicas

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente e Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm Placa de Petri</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas adesivas para microscópio</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Lâminas para chopper</td><td>TED PELLA</td><td>Modelo TC752-1</td><td>&nbsp; Lâminas de barbear estilo</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>Sem L-Glut</td></tr><tr><td>Inserções de cultura de células</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Biological Indo.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sem fenol vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>Sem Ca+, Sem Mg+</td></tr><tr><td>HBSS com vermelho de fenol</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo&nbsp;</td><td>Pinça de</td> íris <td>inativada por calor</td>GIBCO <td>26050088</td></tr><tr><td>CellPath</td><td></td><td>GZX-0100-00A</td> Espátula de íris <td>serrilhada romba de 130mm</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Microscópio Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem sem</td><td>GRIGENE. Ltd, Israel</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Dicloreto de paraquat (Metil viologênio)</td></tr><tr><td>PARG- Poli(ADP-Ribose) Inibidor da glicohidrolase</td><td>Tocris Bioscience, Reino Unido</td><td>PDD 00017273</td><td>sensível à luz&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão fosfato</td><td>Biological Indo.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura, tecido</td><td></td><td></td><td></td>de pele</tr><tr><td>Placas de seis poços</td><td>Corning incorporated</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Discos de Corte de Reposição&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>Modelo 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tecidos</td><td>McIlwain</td><td>Modelo TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Pinças, pontiagudas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copos urinários</td><forte>Anticorpos<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 burro anti Coelho IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; secundário ab; Tampão de diluição secundário; &nbsp; Incubação por 2 h em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Prótien ácido fibrilar antiglial</td><td>Miliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; ab primário; bloqueio; Host:mouse</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; ab primário; bloqueio; hospedeiro: rabbit&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-calbindina-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; abdominais primários; bloqueios&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente anti-pan-ADP-ribose</td><td>Milliphore</td><td>MABE1016</td><td>1:800; ab primário; bloqueio; incubação por 2 h à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DAPI (dicloridrato de 4',6-diamidina-2'-fenilindol)</td><td>Sinalização celular</td><td>4084</td><td>1:1000; tampão de diluição secundário; incubação por 20 min em temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

visualizando a resposta ao dano do dna em células de purkinje usando culturas organotípicas cerebelares

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

A Figura 1 ilustra a aparência geral das culturas organotípicas cerebelares. A linha superior da Figura 1A mostra a foliação cerebelar, que é mantida em cultura, enquanto a linha inferior mostra os PCs corados para Calbindina D-28k (verde) e os núcleos neuronais corados para NeuN (vermelho). Na Figura 1B, os astrócitos nos PCs (vermelho) são corados para GFAP (verde), uma proteína intermediária do tipo III do filamento. As Figuras 2 e 3 mostram a coloração PAR observada após o tratamento dessas culturas com dois agentes que danificam o DNA, ambos oxidantes fortes: bromato de potássio (uma concentração final de 10 mM por 12 h) e paraquat. A resposta PAR foi marcada nos PCs tratados no fólio cerebelar em comparação com o controle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral das culturas organotípicas cerebelares murinas. (A) A linha superior ilustra a foliação cerebelar, que é mantida na cultura. A linha inferior se concentra na camada do PC. Os PCs são destacados por Calbindin D-28k (verde). A coloração NeuN (vermelho) identifica núcleos neuronais através das camadas. (B) Um olhar mais atento aos PCs (vermelho). GFAP (verde), uma proteína de filamento intermediário tipo III, que destaca os astrócitos. Barras de escala = 968,8 μm (A, linha superior), 42,1 μm (A, segunda linha), 72,7 μm (B, linha superior), 18,2 μm (B, segunda linha). Abreviaturas: PC = células de Purkinje; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> Figura 2: Coloração PAR em fatia cerebelar tratada com bromato de potássio. A fatia cerebelar foi tratada com bromato de potássio (KBrO3) - um potente agente oxidante, na concentração final de 10 mM por 12 h. Barras de escala = 775 μm. Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> Figura 3: Resposta PAR em fatias cerebelares expostas ao paraquat, um forte produtor de ânions superóxido. (A) Uma visão geral de um fólio cerebelar. Observe a resposta robusta do PAR, particularmente em PCs, em comparação com o controle. (B) Um exame mais detalhado mostra a resposta PAR em PCs e outros tipos de células. Barras de escala = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abreviaturas: PAR = poli(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluções e buffers</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solução  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Ingredientes</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Meio de dissecção</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Solução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo 0,5% de D-glicose. Adicione 0,5 mL de solução de D-glicose a 50% a 50 mL de HBSS sem Mg2+ e Ca2+.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Meio de cultura BME</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Misture 100 mL de Basal Medium Eagle (BME) contendo vermelho de fenol, mas não L-glutamina ou HEPES, com 50 mL de HBSS com vermelho de fenol, 50 mL de soro de cavalo inativado pelo calor, 2 mL de D-glicose a 50% e 1 mL de L-glutamina 200 mM. Misture e filtre através de um filtro de 0,22 μm em um ambiente estéril. Conservar a 4 °C</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solução de bloqueio para imunocoloração</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">em 0,1 M Tampão fosfato: adicione 0,5% Triton X-100, 10% de soro de cabra</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampão de diluição de anticorpos secundários</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">tampão do fosfato de 0,1 M, 0.2%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampão de lavagem</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">tampão do fosfato de 0,1 M, 0.2%Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solução fixadora</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe: metanol (1: 1 v: v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solução de permeabilização</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M tampão de fosfato, 1% Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solução DAPI</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Solução estoque (2 mg/mL) diluída a 1 μg/mL em 1x PBS</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampão de fosfato</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Prepare duas soulutions A e B (veja abaixo). Misture as soluções de acordo com as proporções especificadas abaixo para fazer tampão fosfato 0,2 M. Em seguida, dilua a solução 0,2M com DDW (1:1) para fazer tampão fosfato 0,1 M (solução de trabalho).</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">solução A (para 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g de fosfato de sódio monobásico anidro (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL de DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solução B (para 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14,2 g de fosfato de sódio diabásico anidro (Na2HPO4 FW 141,96) 500 mL de DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Soluções mistas para fazer 0,2 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Prepare 1 L: 230 mL de solução A e 770 mL de solução B</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampão fosfato 0,1 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Diluir a solução misturada com DDW (1:1)</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Soluções e sua composição.

Visualizando a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este método descreve a geração de organotípicas culturas cerebelar eo efeito de determinados estímulos apoptóticos sobre a viabilidade de diferentes tipos de células do cerebelo.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

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Analisando a sobrevivência das células de Purkinje em culturas de fatias cerebelares organotípicas

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Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

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Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

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As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.

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