Name: Microfluídica na avaliação da função plaquetária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a avaliar a função plaquetária em condições fisiológicas utilizando dispositivos microfluídicos e superfícies biológicas. Este método oferece uma abordagem mais relevante fisiologicamente para a medicina transfusional.

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Todas as pesquisas foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais. A aprovação do Escritório de Proteção à Pesquisa Humana da Universidade de Pittsburgh foi obtida e o consentimento informado de voluntários humanos saudáveis foi obtido.
1. Preparação do dispositivo microfluídico
<ol>
	<li>Para fabricar a parte PDMS do dispositivo, prepare um molde mestre usando latão por meio de microusinagem de controle numérico computadorizado (CNC). NOTA: Dependendo das dimensões do canal, técnicas de fotolitografia podem ser usadas para criar um molde mestre. O dispositivo usado neste protocolo inclui oito canais microusinados paralelos com aproximadamente 480 μm de largura, 140 μm de altura na entrada e saída do dispositivo e 40 μm de altura na estenose do dispositivo, com um comprimento de rampa de/para a região estenótica de aproximadamente 0,3 mm. Os comprimentos dos canais são de aproximadamente 6 mm.</li>
	<li>Com um molde mestre obtido, despeje a Base de Elastômero de Silicone (obtida do kit de elastômero) em um prato de pesagem. Adicione o Agente de Cura de Silicone (obtido a partir do kit de elastômero), que facilita a reticulação das cadeias de polímero de silicone para transformar o PDMS líquido em um sólido durável e flexível, na proporção de 10:1 (agente base) e agite bem a mistura.</li>
	<li>Coloque o molde em uma placa de Petri e despeje o PDMS não curado no molde. Coloque a placa de Petri dentro de um dessecador a vácuo por 30 min para remover as bolhas.</li>
	<li>Termine de curar o PDMS no molde mestre, colocando-o em um forno regulado para 70 °C por 90 min.</li>
	<li>Após a cura completa do PDMS, corte o molde microfluídico usando uma lâmina de barbear ou bisturi. Faça furos nas bordas dos canais (1,5 mm de diâmetro em ambos os lados).</li>
	<li>Usando fita adesiva de laboratório, limpe a superfície de uma lâmina de vidro e o lado gravado do molde microfluídico. Use ar comprimido conforme necessário para remover os detritos restantes.</li>
	<li>Coloque a lâmina de vidro e o molde microfluídico com o lado gravado para cima em um limpador de plasma. Ligue a bomba de vácuo, sele a câmara e ligue o limpador de plasma para a configuração alta. Deixe a lâmina e o PDMS no limpador de plasma por 30 s, depois desligue o limpador de plasma e remova o vácuo.</li>
	<li>Amarre o molde limpo de plasma e a lâmina de vidro pressionando suavemente os lados que estavam voltados para cima no limpador de plasma. Em seguida, coloque o dispositivo microfluídico em um forno/placa de aquecimento a 70 °C por 10 min. NOTA: Não aplique muita pressão ao unir o molde e a lâmina de vidro, pois isso pode levar a uma perda na morfologia do canal.</li>
	<li>Enxágue cada câmara com 10-30 μL de etanol a 70% para esterilizar e deixe o dispositivo microfluídico secar em uma placa quente a 70 °C. NOTA: Os dispositivos devem ser feitos com pelo menos 24 horas de antecedência, mas podem ser feitos com semanas a meses de antecedência. Os dispositivos devem ser armazenados em um recipiente hermético ou placa de Petri coberta em temperatura ambiente.</li>
	<li>No dia anterior à experimentação com o dispositivo microfluídico, enxágue novamente cada câmara com 10-30 μL de etanol a 70% para esterilizar e deixe o dispositivo microfluídico secar em uma placa de aquecimento a 70 ° C.</li>
	<li>Cubra a câmara com reagente de colágeno fibrilar equino tipo 1 (1 mg / mL), diluído em NaCl a 0,9% em uma proporção volumétrica de 1: 5 através de uma saída designada para a entrada designada. Certifique-se de que a direcionalidade seja conservada em um experimento. Armazene o dispositivo em um recipiente fechado quente e úmido para evitar a evaporação do colágeno revestido dentro do canal.</li>
	<li>Após 1 h, enxágue com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover a solução de colágeno. Nivele na direção oposta do revestimento. Quando não estiver em uso, guarde o dispositivo novamente em um recipiente quente, úmido e fechado.</li>
</ol>
2. Preparação da amostra de sangue
<ol>
	<li>Obter uma amostra de sangue total citrato por punção venosa. Incubar sangue total citrato com solução de bloqueio do receptor FC (1:600). NOTA: As amostras de sangue são armazenadas em temperatura ambiente antes e durante a experimentação.</li>
	<li>Incubar sangue total citrato com anticorpo CD41 conjugado com fluorescência (usando um fluoróforo de escolha) (1:600). Manchar por 30 min em um balancim nutatório.</li>
	<li>Como controle positivo para a inibição plaquetária, adicione Ticagrelor, um antagonista do receptor P2Y12 reconstituído em uma solução de 30% p / v de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD) em PBS. NOTA: Estoques de ticagrelor de até 6,4 mM devem ser preparados e diluição adicional dos estoques de ticagrelor em solução de HP-β-CD (30% de HP-β-CD dissolvido em PBS) pode ser feita antes da experimentação (recomenda-se concentrações de estoque de 1.000x).</li>
	<li>Incubar a amostra citrada com Ticagrelor (concentração final até 6,4 μM) durante 30 min para observar a inibição plaquetária.</li>
	<li>Se misturar o hemoderivado com a amostra citrata, corar o hemoderivado com solução de bloqueio do receptor FC (1:600) e anticorpo CD41 conjugado com fluorescência (usando um fluoróforo separado e distinto para a amostra citrato) (1:600).<ol>
		<li>Misturar um equivalente volumétrico das unidades de produto transfundido com a amostra citrada. Por exemplo, para simular 2 unidades de produtos plaquetários transfundidos em uma pessoa com hemorragia (aproximadamente 250 mL por produto em um volume total de sangue de 5.000 mL), misture 100 μL de hemoderivado em 1.000 μL de amostra de sangue citrato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imediatamente antes da experimentação, filtre a amostra de sangue através de um filtro de 40 μm em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.</li>
</ol>
3. Teste da função plaquetária sob fluxo (Método 1)
<ol>
	<li>Ligue o microscópio e o software associado.</li>
	<li>Defina o nível da bomba da seringa de retirada com o estágio do microscópio. Ajuste as configurações na bomba de seringa.<ol>
		<li>Calcule uma taxa de fluxo volumétrico (Q) para uma taxa média de cisalhamento da parede desejada (γ) de 3.500 s-1 na região estenótica do canal usando as equações (1) e (2)21. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">Características (1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) Onde A é a área da seção transversal do canal, P é o perímetro molhado, λ é o fator de forma, b é o lado curto do retângulo (altura) e a é o lado longo do retângulo (largura). NOTA: O valor de 3.500 s-1 é escolhido devido ao cisalhamento crítico do FVW e está no regime arterial 7,22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque o dispositivo microfluídico no microscópio stage. Cole as bordas do dispositivo microfluídico no palco para evitar movimento. Certifique-se de que a saída esteja voltada para a parte traseira do microscópio.</li>
	<li>Conecte uma extremidade do tubo de 1/16" ID (aproximadamente 30 cm de comprimento) a um conector de cotovelo e a outra extremidade a uma seringa de 10 mL com conector de 1/16" ID.</li>
	<li>Encha a seringa com PBS estéril e conecte-a à bomba da seringa.</li>
	<li>Coloque o conector de cotovelo na saída do dispositivo.</li>
	<li>Prepare linhas de entrada com aproximadamente 10 cm de comprimento com o conector de cotovelo em uma extremidade e o corte angular na outra extremidade.</li>
	<li>Conecte o conector do cotovelo de entrada na entrada do dispositivo.</li>
	<li>Posicione a linha de entrada em um tubo de microcentrífuga residual em um suporte angular.</li>
	<li>Use a objetiva de 10x para dimensões de canal de aproximadamente 500 μm de largura e concentre-se nas bordas do canal do dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Prepare as linhas com PBS e limpe o canal de qualquer PDMS/detritos avançando a bomba de seringa manualmente. Certifique-se de verificar perto da entrada e saída do canal.</li>
	<li>Abra as configurações de captura de imagem salva ou crie um procedimento de captura de imagem para imagens de séries temporais capturadas a cada 1–2 s com um canal de campo claro e canais fluorescentes correspondentes aos anticorpos CD41 fluorescentes usados na amostra de sangue.</li>
	<li>Obter a amostra de sangue citrato filtrado e misturar pipetando para cima e para baixo imediatamente antes da experiência. Coloque a amostra no suporte da microcentrífuga angular.</li>
	<li>Posicione a linha de entrada na amostra.</li>
	<li>Comece a gravar a captura de imagem.</li>
	<li>Lentamente, retire a seringa para preencher o volume morto no tubo. Assim que o sangue atingir o canal, aperte imediatamente o play na bomba da seringa para retomar o fluxo na taxa de cisalhamento desejada.</li>
	<li>Ajuste o foco, se necessário.</li>
	<li>Execute o experimento até que as plaquetas tenham ocluído completamente a região estenótica do dispositivo microfluídico ou até um ponto final experimental (ou seja, 10 min).</li>
	<li>Certifique-se de que o tubo de entrada esteja submerso na amostra de sangue durante o experimento.</li>
	<li>Quando o experimento estiver concluído, pare a captura de imagem e pare a bomba de seringa. Salve a captura de imagem.</li>
	<li>Remova o conector do cotovelo de entrada e esvazie o conteúdo da tubulação em uma cônica de resíduos. Esvazie também o conteúdo da seringa e das linhas de saída na cônica de resíduos.</li>
	<li>Substitua os conectores de entrada e saída e a tubulação conforme necessário para amostras subsequentes.</li>
</ol>
4. Teste da função plaquetária sob fluxo com amostras de baixo volume (abaixo de 1 mL) (Método 2)
<ol>
	<li>Repita as etapas 1.1 a 1.4 como acima.</li>
	<li>Perfure uma saída de 1,5 mm de diâmetro e uma entrada de 3 mm de diâmetro nas bordas dos canais.</li>
	<li>Repita as etapas 1.6 a 3.6 como acima.</li>
	<li>Use a objetiva de 10x para dimensões de canal de aproximadamente 500 μm de largura e concentre-se nas bordas do canal do dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Limpe o canal de qualquer PDMS/detritos avançando a bomba da seringa manualmente e absorvendo o fluido de acesso com um lenço de laboratório. Remova quaisquer detritos com fita adesiva na parte superior do dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Avance manualmente a bomba para encher o reservatório de entrada de 3 mm com PBS.</li>
	<li>Abra as configurações de captura de imagem salva ou crie um procedimento de captura de imagem para imagens de séries temporais capturadas a cada 1–2 s com um canal de campo claro e canais fluorescentes correspondentes aos anticorpos CD41 fluorescentes usados na amostra de sangue.</li>
	<li>Inicie a retirada na bomba de seringa (manualmente ou com velocidade definida) e assim que o PBS estiver avançando para o canal e a linha de enchimento no reservatório estiver diminuindo, pause a retirada na bomba.</li>
	<li>Remova o excesso de PBS do reservatório com uma pipeta.</li>
	<li>Inicie a captura de imagem.</li>
	<li>Pipetar a amostra de sangue para o reservatório (aproximadamente 40 μL) e iniciar imediatamente a seringa de retirada. Certifique-se de que o fluxo comece. NOTA: Se o motor da bomba de seringa para retirada não foi preparado na etapa 4.8, o fluxo não começará imediatamente e o experimento deve ser repetido.</li>
	<li>Reabasteça o reservatório de sangue durante o experimento, garantindo que nenhuma bolsa de ar entre no canal.</li>
	<li>Execute o experimento até que as plaquetas tenham ocluído completamente a região estenótica do dispositivo microfluídico ou até um ponto final experimental (ou seja, 10 min).</li>
	<li>Quando o experimento estiver concluído, pare a captura de imagem e pare a bomba de seringa. Salve a captura de imagem.</li>
	<li>Remova o excesso de sangue no reservatório pipetando. Esvazie o conteúdo do tubo de extração em um tubo cônico de resíduos.</li>
	<li>Substitua os conectores e a tubulação conforme necessário para amostras subsequentes.</li>
</ol>
5. Descontaminação
<ol>
	<li>Limpe as linhas de entrada e saída de sangue lavando em uma solução de alvejante a 10%.</li>
	<li>Se todos os canais do dispositivo microfluídico tiverem sido usados, descarte o dispositivo no recipiente de resíduos biológicos perigosos Sharps. NOTA: Todos os resíduos biológicos devem ser descartados adequadamente em resíduos de risco biológico.</li>
</ol>
6. Análise de imagem
<ol>
	<li>Exporte as imagens de experimentos cinéticos usando software clicando em Arquivo | Exportação/Importação | Exportação.</li>
	<li>Selecione os seguintes parâmetros: tipo de arquivo: Formato de arquivo de imagem marcada (TIFF); compressão: LZW; verifique os dados originais e o deslocamento de pixel; desmarque Aplicar curva de exibição e cor do canal; marque Definir subconjunto (região, região do retângulo e selecione a área do canal com uma medida de conservação de largura e altura entre as condições). Exporte para a pasta desejada e marque Criar pasta.</li>
	<li>Observe os valores experimentais abaixo no software: iniciar o quadro quando o sangue entrar no canal; taxa de quadros (Info, Série Temporal).</li>
	<li>Meça a intensidade média de fluorescência normalizada de cada quadro em um experimento utilizando o código Matlab fornecido como Arquivo Suplementar 1, alterando as seguintes entradas para cada experimento: quadro inicial/quadro final com base na duração do experimento (certifique-se de que o comprimento do experimento seja conservado entre as condições); nome do experimento/nome da pasta; recortando os parâmetros X, Y, H e W. Execute o código uma vez para o canal fluorescente de plaquetas receptoras e uma vez para o canal fluorescente de plaquetas do produto. Relate os valores de MFI normalizados (coluna 2) e AUC normalizados (normalizados para o quadro inicial). Subtraia o valor de duração do experimento do valor de AUC normalizado.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Plataforma para Avaliação da Função Plaquetária em Trauma e Transfusão

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<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver Dessecadores a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Agitador de placa de aquecimento digital Fisher</td><td>Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de nutação</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>Balança de Balança OHAUS Scout</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr> <tr><td>Bomba de seringa (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMÁVEL) Aparelho</td> <td>Harvard</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue Edition</td><td>Software</td></tr><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>1<tr><td>/16 polegada ID - Conectores de cotovelo farpado</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroxipropil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16169</td><td>30% Dissolvido em Fosfato tamponado salina</td></tr><tr><td>40-mícron filtros</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>anticorpo CD41</td><td>Novus Biologicals</td><td>&nbsp; NB100-2614</td><td>Proporção 1:600 em Reagente</td></tr> de <tr><td>Colágeno Chrono-Par</td> de Sangue Total <td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>Proporção 1:5 em Microscopia Eletrônica Salina a 0,9%</td></tr><tr><td>Ciências Miltex Punção de Biópsia com Êmbolo, 3,0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox Alvejante Germicida</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>70%</td></tr><tr><td>Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Gás Comprimido</td><td>Supra</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>Humano TruStain</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Proporção 1:600 em Sangue Total</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatula Espátula Descartável de Polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solução salina</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi de segurança</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>Millipore</td><td>salino</td><td>567442</td><td>0,90%</td></tr> <tr><td>Barcos de pesagem de poliestireno Sartorius</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas Superslip - Superslip No. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit de Elastômero</td><td>de Silicone Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td></tr><tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Usinável 360 Latão Barra</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>para fabricação de moldes mestres</td></tr><tr><td>Vacutainers</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1,5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluídica na avaliação da função plaquetária

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Experimentos microfluídicos após o uso deste método devem mostrar a formação de trombos ricos em plaquetas na região de estenose do canal de fluxo (Figura 1). A Figura 1A ilustra resultados representativos em que as plaquetas funcionais formaram um trombo na região estenótica do canal para bloquear o fluxo sanguíneo através do canal. As curvas de intensidade média de fluorescência (MFI) das imagens cinéticas obtidas durante o experimento ilustram uma fase de atraso, crescimento e platô da incorporação plaquetária no trombo em crescimento (Figura 2A, C). O aumento das concentrações de um antagonista P2Y12, o ticagrelor, diminui o MFI plaquetário, bem como a área calculada sob a curva (AUC) das curvas MFI ( Figura 2B , D ). São necessários tempos de incubação mais longos (30 min em comparação com 5 min) para observar disfunção plaquetária pronunciada, de acordo com uma relação dose-resposta mais pronunciada utilizando agregometria de impedância de sangue total após uma incubação de Ticagrelor de 30 min em comparação com 5 min de incubação (Figura Suplementar S1). Sob diferentes condições do veículo, efeitos dependentes do tempo semelhantes da inibição de P2Y12 foram observados no modelo microfluídico (Figura Suplementar S2).
A visualização de duas populações de plaquetas no método de ressuscitação hemostática simulada ilustra a incorporação de ambas as populações de plaquetas no trombo (Figura 3A). A incorporação de ambas as populações de plaquetas em seu sinal fluorescente correspondente pode ser quantificada cineticamente ao longo da duração do experimento por meio de medições de MFI (Figura 3B). Inclinações mais íngremes na fase de crescimento, bem como o aumento das medições de MFI de desfecho, demonstram aumento da funcionalidade plaquetária e potencial hemostático, que pode ser visto na quantificação de plaquetas receptoras quando a amostra de sangue foi induzida com disfunção plaquetária via inibição P2Y12 e, em seguida, ressuscitação simulada pela mistura de sangue total autólogo fresco em uma proporção volumétrica de 1:10 corada com um fluoróforo plaquetário distinto. Com a mistura autóloga de sangue total, mais plaquetas foram incorporadas do produto transfundido simulado em comparação com um produto plaquetário por aférese no dia 5 de armazenamento em temperatura ambiente, que mostrou incorporação mínima do produto no trombo em formação. A mistura de produtos plaquetários à temperatura ambiente do dia 5 também mostrou menor incorporação de plaquetas receptoras em comparação com a mistura com sangue total autólogo fresco (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
Figura 1: Representação do teste da função plaquetária usando microfluídica. (A) A configuração experimental microfluídica esquemática para testes de função plaquetária usando amostras de sangue de baixo volume é mostrada, incluindo uma bomba de seringa de retirada puxando sangue através de uma câmara de fluxo estenótico, permitindo a captura de imagens em tempo real. (B) Uma vista lateral de uma câmara de fluxo estenótico é mostrada, incluindo uma superfície revestida de colágeno na qual as plaquetas irão aderir, ativar e agregar, resultando em um trombo crescente na região estenótica. (C) Captura de imagem em tempo real de uma amostra de sangue citrato sob fluxo em um canal microfluídico estenótico (3.500 s-1) e um trombo crescente formado ao longo de 300 s. Barras de escala = 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
Figura 2: Redução das alterações nas dobras do IMF plaquetário e na área sob a curva após 30 min de incubação com o antagonista P2Y12 Ticagrelor. (A) A incubação com o antagonista P2Y12 por apenas 5 min demonstra fases de atraso ligeiramente estendidas das curvas MFI e (B) ligeiras diminuições na AUC do MFI. (C) A incubação por 30 min com antagonista P2Y12 resulta em fases de atraso prolongadas e valores reduzidos de MFI de endpoint, bem como (D) disfunção mais robusta demonstrada via MFI AUC. Os pontos de dados individuais representam réplicas biológicas e a média ± desvio padrão é mostrada. Abreviaturas: MFI = intensidade média de fluorescência; AUC = área sob a curva; HP-β-CD = 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
Figura 3: Mistura de hemoderivados com inibição coagulopática de P2Y12 na amostra receptora, simulando disfunção plaquetária do paciente, na câmara microfluídica. (A) Unidade plaquetária por aférese (plasma, dia de armazenamento 7) (CD41 em ciano) misturada na proporção de 1:10 com sangue citrato pré-incubado com 0,8 μM de Ticagrelor por 30 min (CD41 em vermelho). (B) Curvas de intensidade de fluorescência média normalizadas representativas da amostra de sangue do receptor que recebeu unidade de plaquetas por aférese (dia de armazenamento 5) ou sangue total fresco autólogo (proporção de 1:10) junto com a cinética plaquetária do receptor ao longo do tempo. O sangue citrato do receptor foi pré-incubado com 0,8 μM de Ticagrelor por 30 minutos antes de ser misturado com hemoderivados. (C) Imagem representativa da pilha z de um dispositivo modificado colado a uma lamínula para microscopia confocal. O produto plaquetário por aférese foi misturado com uma amostra de sangue trombocitopênico na proporção volumétrica de 1:5 (produto:sangue), além de um anticorpo do fator de von Willebrand (1:600). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Código Matlab para análise de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S1: Agregometria de impedância de sangue total dependência do tempo de inibição de P2Y12 com Ticagrelor. A incubação por 30 min resulta em uma relação dose-resposta mais pronunciada em comparação com 5 min. As soluções veiculares e medicamentosas foram utilizadas a 0,1% v/v. Os pontos de dados individuais representam réplicas biológicas e a média ± desvio padrão é mostrada. Abreviaturas: AUC = área sob a curva; HP-β-CD = 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S2: Inibição P2Y12 dependente do tempo com Ticagrelor em um modelo microfluídico da função plaquetária. Curvas representativas de MFI e valores de área sob a curva para réplicas técnicas de um doador saudável individual são mostradas com etanol veículo (1% v/v) utilizado para solubilidade do medicamento. Abreviaturas: MFI = intensidade média de fluorescência; AUC = área sob a curva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

microfluidics-in-assessing-platelet-function

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Descreve-se um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano seguido por meio de medições de agregação plaquetária induzida por agonistas por turbidimetria. Como exemplo, aplicam-se este método para estudar a resposta de agregação de plaquetas humanas a colagénio depois de uma pré-incubação com o inibidor do canal Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

Um protocolo para um novo ensaio funcional de plaquetas multiparâmetro dinâmico usando um biossensor capacitivo é apresentado aqui. Essa abordagem, projetada em um microambiente semirrígido para aumentar a relevância fisiológica, fornece três parâmetros de saída sensíveis à contagem de plaquetas, forças de estimulação e vias de ativação.

Avaliação dinâmica da função plaquetária multiparamétrica usando um biossensor capacitivo

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Um procedimento não-invasivo para avaliar a função endotelial é demonstrada através dos 2000 Endo-PAT.

Avaliação da função endotelial com a Vasodilatador 2000 Endo-PAT

Aprenda a avaliar a função plaquetária em condições fisiológicas utilizando dispositivos microfluídicos e superfícies biológicas. Este método oferece uma abordagem mais relevante fisiologicamente para a medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

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