Name: Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a otimizar a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica usando Methanocaldococcus jannaschii. Este método prático melhora a distribuição de partículas e a resolução estrutural de macromoléculas.

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<ol><li>Faruqi, A. R., Mcmullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+detectors+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Electronic detectors for electron microscopy.</a> Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).</li>
<li>Hamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cryo-EM+system+for+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new cryo-EM system for single particle analysis.</a> J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).</li>
<li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+cryo-Em+single-particle+analysis+in+relion-4.0%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0.</a> Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li>
<li>Punjani, A., Fleet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3Dflex%3A+Determining+structure+and+motion+of+flexible+proteins+from+cryo-Em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em.</a> Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).</li>
<li>Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+resolution+and+resolvability+of+single-particle+cryo-EM+structures+using+gaussian+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models.</a> Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).</li>
<li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturizing+em+sample+preparation%3A+Opportunities%2C+challenges%2C+and+%26%2334%3Bvisual+proteomics%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and &#34;visual proteomics&#34;.</a> Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).</li>
<li>Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+making+ideal+cryo-Em+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Challenges in making ideal cryo-Em samples.</a> Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).</li>
<li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+cryo-em+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis.</a> J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li>
<li>Naydenova, K., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+effects+of+particle+orientation+to+improve+the+efficiency+of+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy.</a> Nat Commun. 8 (1), 629(2017).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-em+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+preferred+orientation+problem+in+cryo-EM+reconstruction+with+self-supervised+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning.</a> Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).</li>
<li>Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+10-year+meta-analysis+of+membrane+protein+structural+biology%3A+Detergents%2C+membrane+mimetics%2C+and+structure+determination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).</li>
<li>Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+charge+on+protein+preferred+orientation+at+the+air-water+interface+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).</li>
<li>Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+effects+of+particle+adsorption+to+the+air%2Fwater+interface+in+single-particle+cryo-electron+microscopy%3A+Bacterial+RNA+polymerase+and+CHAPSO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO.</a> J Struct Biol X. 1, 100005(2019).</li>
<li>Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+the+conformation+of+a+substrate+analogue+in+the+human+20s+proteasome+core%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core.</a> Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).</li>
<li>Nguyen, T. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+yeast+u4%2Fu6.U5+tri-snrnp+at+3.7+%C3%A5+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution.</a> Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids.</a> J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+improve+protein+distribution+on+holey+carbon+cryo-EM+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports.</a> Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).</li>
<li>Patel, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+human+tfiid+and+mechanism+of+TBP+loading+onto+promoter+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA.</a> Science. 362 (6421), eaau8872(2018).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+subunit+architecture+of+the+proteasome+regulatory+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle.</a> Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-em+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em.</a> J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Xu, Y., Dang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+technical+advances+in+sample+preparation+for+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em.</a> Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).</li>
<li>Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-em+structure+of+a+16.5-kda+small+heat-shock+protein+from+Methanocaldococcus+jannaschii%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii.</a> Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).</li>
<li>Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+small+heat-shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a small heat-shock protein.</a> Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J Vis Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kim, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crystallization%2C+and+preliminary+x-ray+crystallographic+data+analysis+of+small+heat+shock+protein+homolog+from+Methanococcus+jannaschii%2C+a+hyperthermophile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile.</a> J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).</li>
<li>Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+chaperone+activity+of+the+small+heat-shock+protein+of+Methanococcus+jannaschii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).</li>
<li>Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoelectron+microscopy+and+EPR+analysis+of+engineered+symmetric+and+polydisperse+hsp16.5+assemblies+reveals+determinants+of+polydispersity+and+substrate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding.</a> J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).</li>
<li>Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+protein+of+Methanococcus+jannaschii%2C+a+hyperthermophile%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
<li>Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+optimum+solubility+screening%3A+Using+crystallization+results+to+identify+the+optimal+buffer+for+protein+crystal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).</li>
<li>D'arcy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+proteins+-+A+rational+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallizing proteins - A rational approach.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+solubility+%28os%29+screening%3A+An+efficient+method+to+optimize+buffer+conditions+for+homogeneity+and+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).</li>
<li>Zhang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+selecting+the+ph+of+protein+solutions+to+enhance+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).</li>
<li>Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+glycerol+as+an+acceptable+additive+for+single-particle+cryo-EM+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).</li>
<li>Michon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+surfactants+in+electron+cryo-microscopy+film+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation.</a> Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).</li>
<li>Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+human+erythrocyte+catalase+with+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM.</a> Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).</li>
<li>Vinothkumar, K. R., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+electron+cryomicroscopy%3A+Trends%2C+issues+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective.</a> Q Rev Biophys. 49, e13(2016).</li>
<li>Kim, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+cryo-em+single+particle+analysis+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow.</a> Front Mol Biosci. 5, 50(2018).</li>
<li>Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+button+test%3A+A+small+scale+method+using+microdialysis+cells+for+assessing+protein+solubility+at+concentrations+suitable+for+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+NMR%22%5BJournal%5D)">The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR.</a> J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).</li>
<li>Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Know+your+detergents%3A+A+case+study+on+detergent+background+in+negative+stain+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy.</a> J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em.</a> Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+Beyond+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: Beyond the microscope.</a> Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de Fundo Redondo de 14 mL</td><td>SPL Life Sciences</td><td>40114</td><td></td></tr><tr><td>250 &micro; L Seringa à Prova de Gás Modelo 1725 LTN</td><td>Hamilton</td><td>81100</td><td>Agulha Cimentada, calibre 22s, 2 pol, estilo de ponta 2</td></tr><tr><td>50 &micro; L Botão de Diálise</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-326</td><td></td></tr><tr><td>Copo de Vidro de 50 mL</td><td>DIAMOND</td><td>HA.1010D.50</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Unidade de Filtro Centrífugo KTA pure 25 L</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>50-KDa NMWL</td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Supelco</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Dumoxel Style N5</td><td>Dumont</td><td>0103-N5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Glacios 2 Cryo-TEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GLACIOSTEM</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>Tubo</td> de Microcentrífuga <td>Cytiva 28989335</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>HD Micro</td><td>H23015</td><td></td></tr><tr><td>Tubos PCR 0,2 mL, tampa plana</td> Unidade de descarga <td>de brilho Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de suporte de grade PELCO TEM</td><td>Ted Pella</td><td>16820-25</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh,</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>Q2100CR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 RC Tubo de Membrana de Diálise&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>086705B</td><td>3500 Dalton MWCO</td></tr><tr><td>Superose 6 Aumento 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VITROBOT</td><td></td></tr><tr><td>VitroEase Kit de triagem de tampão e detergentes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A49856</td><td></td></tr></tbody></table>

otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Para identificar as condições ideais da grade para MjsHSP16.5, foi realizada uma triagem inicial de crio-EM, concentrando-se principalmente no exame de várias condições de tampão proteico: (1) o tampão de purificação final, que garante a estabilidade e homogeneidade de MjsHSP16.5 e é importante para sua cristalização30; (2) tampões adaptados das condições necessárias para o crescimento de cristais MjsHSP16.5 de alta qualidade de difração30; e (3) tampões anteriormente empre...

Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

É apresentado um instrumento e métodos para a preparação dos volumes de nanolitros de tamanho de amostra para microscopia eletrônica de transmissão. Sem papel-mancha passos são necessários, evitando assim as consequências prejudiciais que isso pode ter para proteínas, reduzindo a perda de amostra significativamente e permitindo a análise do lisado para proteômica visual única célula.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.

Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

As técnicas de Feixe de Íons Focados Criogênicos (FIB) e Microscopia eletrônica de varredura (SEM) podem fornecer insights-chave sobre a química e a morfologia de interfaces de líquido sólido intacto. Os métodos para preparar mapas espectroscópicos de raios-X dispersivos de alta qualidade (EDX) de tais interfaces são detalhados, com foco em dispositivos de armazenamento de energia.

Caracterização em nanoescala de interfaces líquidas sólidas acoplando fresagem de feixe de íons focada em crio-focal com microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia

A relação sinal-ruído dos dados é uma das considerações mais importantes na realização de medições de difração de raios-X a partir de microcristais. A linha de feixe VMXm fornece um ambiente de baixo ruído e micróbios para tais experimentos. Aqui, descrevemos métodos de preparação de amostras para montagem e resfriamento de microcristais para VMXm e outras linhas de cristalografia macromolecular microfocus.

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Este manuscrito descreve o método de mancha e mergulho para congelar manualmente espécimes biológicos para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas.

Congelamento manual de amostras biológicas para microscopia eletrônica criogênica de partículas únicas

Aqui, apresentamos um pipeline para fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D na orientação da preparação de amostras celulares para tomografia crio-eletrônica. A posição 3D das proteínas fluorescentemente marcadas de interesse é primeiramente determinada por microscopia de criofluorescência e, em seguida, direcionada para moagem. O protocolo é adequado para células de mamíferos, leveduras e bactérias.

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Este método fornece um protocolo acessível e flexível para a preparação de grades de microscopia eletrônica (ME) para criotomografia celular in situ e microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM).

Preparo de Amostras para Criotomografia In Situ de Células de Mamíferos

Aprenda a otimizar a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica usando Methanocaldococcus jannaschii. Este método prático melhora a distribuição de partículas e a resolução estrutural de macromoléculas.

Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

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