Name: Cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a isolar células gliais entéricas de intestino equino para estudar sua função na inflamação intestinal e complicações pós-operatórias. Este protocolo auxilia pesquisadores a compreender a homeostase intestinal.

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<meta charset="utf8"></head><body>Estudando as interações glial-epiteliais entéricas na inflamação relacionada à cólica

<ol><li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>Morton, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+and+postoperative+factors+influencing+short-term+survival+of+horses+following+small+intestinal+resection%3A+92+cases+%281994-2001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001).</a> Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).</li>
<li>French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+surgical+colic%3A+risk+factors+for+postoperative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications.</a> Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).</li>
<li>Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+the+local+inflammatory+response+in+the+intestinal+mucosa+and+muscularis+of+horses+undergoing+small+intestinal+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection.</a> Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).</li>
<li>Sheats, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+equine+SIRS%2C+sepsis%2C+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils.</a> Front Vet Sci. 6, 69(2019).</li>
<li>Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+and+postoperative+gastrointestinal+tract+dysfunction%3A+pathogenic+mechanisms+and+novel+treatment+strategies+beyond+colorectal+enhanced+recovery+after+surgery+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharm%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols.</a> Front Pharm. 11, 583422(2020).</li>
<li>Stoffels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+involves+interleukin-1+receptor+signaling+in+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia.</a> Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li>
<li>Savidge, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+regulate+intestinal+barrier+function+and+inflammation+via+release+of+S-nitrosoglutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Hellman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+equine+enteroids+and+enteroid-derived+2D+monolayers+that+are+responsive+to+microbial+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics.</a> Vet Res. 52 (1), 108(2021).</li>
<li>Al-Sadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+permeability+is+mediated+by+JNK+pathway+activation+of+claudin-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene.</a> PLoS One. 9 (3), e85345(2014).</li>
<li>Ochoa-Cortes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells%3A+A+new+frontier+in+neurogastroenterology+and+clinical+target+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases.</a> Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).</li>
<li>Ziegler, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cell+network+function+is+required+for+epithelial+barrier+restitution+following+intestinal+ischemic+injury+in+the+early+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).</li>
<li>Grubišić, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia%3A+the+most+alimentary+of+all+glia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES buffer</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>2 mM GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>25050-061</td><td></td></tr><tr><td>4' 6-Diaminidino-2-Phenylindol</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de actina de músculo liso alfa</td><td>Abcam</td><td>7817</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>AA9529</td><td>4,4 g/mL alíquotas de estoque, concentração final 1,1 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>Anti-Antimicótico 1x</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma</td><td>AA3311</td><td></td></tr><tr><td>BSA 50 mg / mL solução estoque</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>ACROS Organiics</td><td>206791000</td><td>Componente do Equine Ringer ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma</td><td>9891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 mídia</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>burro anti-coelho IgG Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>21207</td><td></td></tr><tr><td>EVOM EndOhm eletrodo duplo Câmara de medição TEER</td> World <td>Precision Instruments</td><td>EVM-EL-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Manual EVOM para medição TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>G5</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td>Concentração final 20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de anticorpo GFAP</td><td>Abcam</td><td>4674</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-camundongo de cabra Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>28175</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta; ELISA</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESIL1B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>P330-500</td><td>Componente da campainha equina ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>Solução de L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-00-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33-500</td><td>Componente da campainha equina ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP332-1</td><td>Componente do Equine Ringer ' s Stock 2: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Estoque 1 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td>Componente da campainha equina ' s Estoque 1: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Stock 2 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP329-500</td><td>Componente da campainha equina ' s Stock 2: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Estoque 1 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>S637-212</td><td>Componente do Equino Ringer ' s Stock 2: combine com outros ingredientes, adicione 100 mL deste caldo a um cilindro graduado e dilua para 1L com água deionizada. Ajuste o pH para 7,4 com 5% de CO2. Combine com Equine Ringer' s Estoque 1 para fazer completo " Campainha' 's Solução".</td></tr><tr><td>Solução de caneta / estreptococo</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>0,5 mg / mL em 1x tampão de borato</td></tr><tr><td>Software Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td>Solução de estoque de 7,5%</td></tr></tbody></table>

cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

A microdissecção do jejuno equino para a camada submucosa (Figura 1) com posterior digestão enzimática e mecânica, poderia produzir culturas celulares viáveis de glia entérica equina. As células demonstraram um pleomorfismo com dominância de células fusiformes consistentes com a glia entérica de outras espécies (Figura 2A). As culturas foram positivas para o marcador glial seletivo, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), com baixa contaminação por fibroblastos (alfa SMA, Figura 2B). Em alguns casos, a microdissecção das camadas submucosas não foi controlada em grau suficientemente alto, e as culturas foram contaminadas com altas porcentagens de fibroblastos observadas por meio da imunofluorescência da actina do músculo liso marcador de fibroblastos (Figura 3).
Em seguida, como exemplo da utilidade da cultura glial entérica equina, foi avaliado o impacto da glia entérica exposta à IL-1β na função da barreira epitelial intestinal. A exposição basolateral a meios de cultura de glia entérica submucosa equina exposta a 10 ng e 25 ng IL-1β por 24 h aumentou significativamente a permeabilidade (p = 0,05 e 0,04, respectivamente, média do meio controle = 0,9, média do grupo glial 10 ng IL-1β = 0,8, intervalo de confiança de 95% = -0,2 a 0,02, média do grupo glial 25 ng IL-1β = 0,8, intervalo de confiança de 95% = -0,1995 a 0,01060, n = 3-4) (Figura 4A). No entanto, a exposição de monocamadas epiteliais equinas a 10-25 ng de IL-6 equina basolateral, uma citocina inflamatória que demonstrou ser produzida pela glia entérica exposta à IL-1β e induzir aumento da permeabilidade dos enterócitos em modelos de roedores12, não aumentou significativamente a permeabilidade da monocamada de enterócitos equinos (Figura 4B)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento da glia entérica do jejuno equino por microdissecção e digestão enzimática e mecânica. (A) O jejuno foi cortado ao longo da borda antimesentérica e fixado com o lado da mucosa para cima. (B) As vilosidades intestinais foram visualizadas por microscopia e removidas com raspagem suave até que a lâmina própria fina fosse visualizada. (C) A camada de lâmina própria foi então removida até que as fibras musculares lisas fossem visíveis através da submucosa translúcida. (D) A submucosa foi colocada em tenda e retirada da camada muscular, fazendo cortes em marcas fibrosas conforme necessário. As imagens foram obtidas por um microscópio de dissecção de 10x (B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig02.jpg"> Figura 2: Imagem das culturas da glia entérica submucosa equina. (A) A morfologia estrelada (setas), fusiforme (ponta de seta aberta) e ganglionar (ponta de seta fechada) da glia entérica equina foi apreciada por microscopia de contraste de fase. (B) A pureza das culturas foi avaliada por coloração para GFAP, e para o marcador de fibroblastos, actina de músculo liso Barras de escala = 100 mm (A), 400 mm (B). Abreviaturas: GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig03.jpg"> Figura 3: Imagem de culturas de glia entérica submucosa equina malsucedidas. A pureza das culturas foi avaliada pela coloração para GFAP (vermelho) e para o marcador de fibroblastos, actina de músculo liso (verde), demonstrando uma grande porcentagem de contaminação por fibroblastos. A ponta da seta amarela denota GFAP e a actina do músculo liso da ponta da seta branca. Barra de escala = 400 mm. Abreviatura: GFAP = proteína ácida fibrilar glial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig04.jpg"> Figura 4: TEER de monocamada epitelial equina após exposição a citocinas inflamatórias e produtos gliais inflamatórios. (A) A exposição basolateral a meios de cultura de glia entérica submucosa equina, exposta a 10 ng e 25 ng de IL-1β por 24 h, aumentou significativamente a permeabilidade (* p = 0,05 e 0,04, respectivamente, n = 3-4). (B) A exposição aguda de monocamada de enterócitos equinos a 25 ng de IL-1β basolateral e 10-25 ng de IL-6 equina não aumentou significativamente a permeabilidade da monocamada epitelial equina (n = 2-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Reagentes para isolamento e cultura. Os seguintes reagentes foram utilizados para formular meios para isolamento da glia entérica equina, cultura da glia entérica e cultura de células-tronco epiteliais intestinais equinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina

Inflammatory postoperative conditions of equine colic (acute abdomen) contribute not only to increased client cost, patient discomfort, and ...

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