Name: Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda a criar um modelo multicelular da barreira das vias aéreas usando células derivadas de iPSC, incluindo epitélio, mesênquima, endotélio e macrófagos. Este método permite estudar a remodelação pulmonar e respostas a toxinas ambientais.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modelo de vias aéreas para estudar a integridade da barreira pulmonar, doenças e descoberta de medicamentos

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
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<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
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<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
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<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de 12 poços, 0.4 &micro; m, translúcido&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Célula Inovadora Tecnologia</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R & D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans ácido retinóico (RA)&nbsp;</td>Ácido ascórbico <td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 sem ácido retinóico&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) Fração V, solução a 7,5%&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& D System</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Exibicionista Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>R& D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Médio</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Fisher</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Presunto' s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtil-1-metilxantina)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado ' s Médio (IMDM) + Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol&nbsp;</td><td>Kit Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus (10/caixa)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Médio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Inibidor de Rocha)&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de ipsc para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

Existem vários estágios nos quais a diferenciação de organoides das vias aéreas derivadas de iPSC, células endoteliais, células imunes e co-culturas pode ser avaliada como concluída com sucesso. As diferenciações podem ser realizadas em diferentes linhagens de iPSC, e este protocolo foi testado em pelo menos cinco linhagens diferentes. O protocolo precisa ser adaptado a cada nova linha de iPSC, especificamente modificando e otimizando a densidade de semeadura.
O rendimento bem-sucedido de organoides das vias aéreas derivados de iPSC pode ser avaliado via campo claro e terá quatro características: limites/bordas definidos, morfologia translúcida/cística, capacidade de proliferar/expandir e falta de células necróticas. Os organoides das vias aéreas que parecem difusos não aumentam de tamanho ao longo das 2 semanas de cultura e têm necrose não devem ser usados para experimentos de cocultura. Organoides com uma camada luminal espessa na periferia vs. Os organoides translúcidos/císticos ainda podem ser usados para experimentos subsequentes. No entanto, os organoides translúcidos/císticos das vias aéreas são compostos predominantemente por células basais, enquanto os organoides de membrana dupla espessa são compostos predominantemente por células de clube. Como as células basais proliferam e se expandem facilmente, elas são mais adequadas para cultura e polarização de interfase ar-líquido. Outros métodos para avaliar o rendimento bem-sucedido de organoides pulmonares derivados de iPSC são a análise de citometria de fluxo no estágio de progenitor pulmonar (dia 16 da diferenciação) para o marcador de superfície CPM (Tabela 1), um rendimento de diferenciação bem-sucedido &gt;50% de células CPM+.
Para a dissociação do organoide das vias aéreas e a cultura de interfase ar-líquido, certifique-se de que todo o polímero ECM foi removido, ou isso impedirá que as células se expandam na membrana. As células devem ser confluentes no dia 3 da cultura, antes do levantamento de ar. A confirmação dos tipos de células no iAirways pode ser avaliada pela coloração dos respectivos marcadores específicos do tipo de célula: células basais (p63+), células do clube (SCGB1A1+), células caliciformes (MUC5AC+) e células ciliadas (AcTub+). A caracterização e os marcadores específicos do tipo de células pulmonares são verificados no LungMAP21. O mesênquima pode ser detectado com anticorpos contra vimentina ou actina de músculo liso. Para gerar mais células ciliadas, as culturas podem exigir levantamento de ar por um longo período de tempo ou a adição de DAPT.
O rendimento bem-sucedido de células endoteliais derivadas de iPSC pode ser avaliado por meio de campo claro, mostrando uma morfologia semelhante a paralelepípedos (Dia 6 da diferenciação endotelial derivada de iPSC). Uma cultura endotelial derivada de iPSC bem-sucedida conterá &gt;50% de células CD31 +, e células suficientes devem ser geradas para que, após a classificação, o rendimento seja superior a 500.000 células. As células podem ser passadas ou criopreservadas, e o marcador CD31 deve ser testado via fluxo a cada passagem ou nova cultura. As células não devem ser passadas além de P4. Para referência, consulte a classificação de células endoteliais derivadas de iPSC pré / pós CD31 (Figura 1C). As células endoteliais serão planas com um grande corpo celular com morfologia alongada e fusiforme.
Para a diferenciação de macrófagos, os corpos embrióides devem permanecer no fundo do poço ULA e apenas um EB deve estar em cada poço. Eles devem mostrar alterações císticas no dia 5-7. Se eles não formarem um EB após a centrifugação, semeie os iPSCs na placa ULA de 96 poços sem girar. Pode ser necessário aumentar o número de iPSCs. O rendimento bem-sucedido de células imunes derivadas de iPSC depende inteiramente da capacidade dos corpos embrióides (EBs) de se desenvolverem em cistos (Dia 7 de diferenciação). EBs imunes derivados de iPSC que não desenvolvem cistos não formarão estroma quando semeados na gelatina e não produzirão progenitores mieloides. Após a transferência para a placa revestida de gelatina, os EBs devem permanecer presos ao fundo da placa. O movimento da placa deve ser feito com cuidado para não desalojá-los. As placas devem ser trocadas duas vezes por semana manualmente e as células suspensas devem ser passadas para Mac-CM2 ou criopreservadas. Além disso, após a colheita dos progenitores mielóides suspensos, eles devem aderir ao frasco plástico não revestido e gerar células brilhantes sob campo claro com vacúolos, indicando macrófagos. O marcador para monócitos, CD14+, deve ser &gt;90% nas células suspensas. O marcador de macrófagos, CD68, deve aumentar com o tempo, com ~ 50% dos macrófagos expressando CD68 + após 2 semanas (Figura 1D). A eficiência de adesão deve ser determinada para cada linha celular. Alcançamos uma média de 20% de eficiência de adesão. Para polarização, os macrófagos M0 são polarizados para macrófagos M1 (iPSC-M1) ou M2 (iPSC-M2) por 48 h em meio de diferenciação II suplementado com diferentes estímulos: 100 ng/mL LPS e 20 ng/mL IFN-g para polarização M1 ou 50 ng/mL IL-4 e 20 ng/mL IL-13 para polarização M2. O marcador para polarização M1 é CD80+ e a polarização M2 é CD206+.
A geração bem-sucedida da co-cultura tripla pode ser avaliada por imunofluorescência para marcadores de junção epitelial EPCAM, ECAD ou ZO-1, ou marcador de junção endotelial CD31 (Figura 2C, Tabela 1). A funcionalidade da co-cultura tripla também pode ser avaliada por meio da resistência epitelial/endotelial transelétrica (TEER). Coculturas organoides e endoteliais das vias aéreas bem montadas terão maior resistência elétrica, indicando comunicação e conexão celular ideais. Insultos ambientais, como cigarros eletrônicos ou desafio viral, comprometerão a integridade da barreira epitelial e endotelial, resultando em redução da resistência elétrica da co-cultura (Figura 3A, B) e junções apertadas desorganizadas ( Figura 3C ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Diferenciação e caracterização do epitélio das vias aéreas derivado de iPSC, endotélio e culturas imunes. (A) Esquema de diferenciações direcionadas por iPSC para a montagem do iAirway. (B) Organoides do epitélio das vias aéreas derivados de iPSC caracterizados por campo claro (esquerda) e análise de citometria de fluxo (direita) para EPCAM e ECAD. (C) endotélio das vias aéreas derivado de iPSC caracterizado por campo claro (esquerda), imunofluorescência e análise de citometria de fluxo (direita) para CD31. O respectivo campo claro após a classificação CD31 é mostrado à direita. (D) Os macrófagos derivados de iPSC são caracterizados por análise de campo claro (esquerda) e citometria de fluxo (direita) para o marcador pan-hematopoiético CD45, fabricante de monócitos CD14 e marcador de macrófagos CD68. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
Figura 2: Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e macrófagos derivadas de iPSC. (A) Esquema da montagem do iAirway. (B) Imagens de campo claro da respectiva monocultura epitelial e endotelial, da bicultura epitelial e endotelial e da cocultura epitelial, endotelial e de macrófagos. Macrófagos marcados com citorastreador vermelho. Barras de escala: 100 μm. (C) Coloração imunofluorescente para marcador de junção apertada ZO-1 no lado apical do inserto de cultura de células e CD31 no lado basolateral. Barras de escala: 100 μm. (D) Seção transversal do inserto de cultura de células com organoides dissociados das vias aéreas no lado apical, 1 semana após o levantamento de ar. O painel esquerdo com coloração H &amp; E com a seta preta mostra células ciliadas. O painel do meio, com imagem de imunofluorescência, mostra o marcador epitelial E-caderina (ECAD). O painel direito, com imagem de imunofluorescência, mostra marcadores mesenquimais como vimentina (VIM) e actina de músculo liso (AMS). Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
Figura 3: Alterações na função de barreira das vias aéreas dos iAirways expostos a cigarros eletrônicos e vírus. (A) Esquema da ferramenta de medição de resistência epitelial/endotelial transelétrica (TEER). (B) Gráfico de barras de TEER após 7 dias de adição de cigarro eletrônico mentolado à mídia. Intervalo de confiança médio de +/- 95%. N = 5 réplicas biológicas e 3 réplicas técnicas; Valor de p &lt;0,001. (C) Coloração imunofluorescente para proteína de junção apertada ZO-1 antes e depois da infecção por SARS-CoV-2. Observe o layout desordenado do ZO-1 pós-infecção. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo</td>
			<td>Aplicação</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 PECAM-1 (APC)</td>
			<td>citometria de fluxo (FC)</td>
			<td>10 μl em tampão de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl em tampão de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPM</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl em tampão de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 14 (FITC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl em tampão de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl em tampão de 100 ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>Imunofluorescência (IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentina</td>
			<td>SE</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>SE</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Anticorpos usados em FACS e Imunofluorescência.
Arquivo Suplementar 1: Composições de mídia e buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

O presente protocolo descreve células pluripotentes pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tipo 2 (iAT2s). Essas células podem ser cultivadas como esferas de auto-renovação na cultura 3D ou adaptadas à cultura de interface ar-líquido (ALI).

Gerando esferas 3D e culturas de interface ar-líquido 2D de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica 

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Aprenda a criar um modelo multicelular da barreira das vias aéreas usando células derivadas de iPSC, incluindo epitélio, mesênquima, endotélio e macrófagos. Este método permite estudar a remodelação pulmonar e respostas a toxinas ambientais.

Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal

Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar

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