Realizando uma triagem nocaute CRISPR em todo o genoma in vitro em células T receptoras de antígeno quimérico

A terapia com células T Car é um tipo inovador de imunoterapia contra o câncer que levou a remissões que duram mais de uma década. No entanto, as taxas de respostas duradouras ainda são limitadas. Com este protocolo, pretendemos melhorar nossa compreensão dos mecanismos por trás da resistência e criar ferramentas para melhorar a resposta à terapia com células T CAR.

Muitas abordagens estão sendo empregadas atualmente para melhorar a terapia com células T CAR, incluindo terapias combinadas e otimização do design do CAR. No entanto, devido às crescentes evidências de que o perfil epigenético dos produtos de células T CAR pré-infusão é uma resposta determinante importante, as tecnologias de edição genética tornaram-se ferramentas populares.

A edição genômica de células T CAR mostrou sucesso na prevenção de toxicidades e no aumento da expansão e persistência de células T CAR em estudos pré-clínicos e clínicos. Nosso protocolo para uma triagem de nocaute CRISPR em todo o genoma fornece uma abordagem eficiente e imparcial para determinar as melhores edições genéticas para melhorar a função das células T CAR.

As perturbações gênicas em todo o genoma requerem condições de seleção adequadas e em larga escala para serem eficazes. Para estudar o desenvolvimento da exaustão das células T CAR, aprendemos que devemos estimular mais de 80 milhões de células T CAR por duas semanas para selecionar as edições genéticas ideais.

Embora nosso protocolo tenha sido projetado para avaliar o desenvolvimento de exaustão, este protocolo pode ser ajustado para avaliar o desenvolvimento de outros mecanismos de resistência. Ao completar as telas de todo o genoma em diferentes configurações, podemos eventualmente determinar as melhores edições para melhorar as respostas gerais à terapia com células T CAR.

[Narrador] Depois de transduzir as células CAR T com a biblioteca CRISPR, centrifugue as amostras a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius para lavá-las. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 20 mililitros de meio de células T. Para preservar amostras para sequenciamento de próxima geração, alíquota de células T CAR suficientes em um tubo cônico de 50 mililitros para manter uma representação de RNA guia de 500 células por RNA guia. Centrifugue a amostra a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de PBS e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Lave o tubo cônico de 50 mililitros com um mililitro de PBS e transfira a lavagem para o mesmo tubo de microcentrífuga. Em seguida, centrifugue as amostras a 500g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e armazene os grânulos celulares a -20 graus Celsius. Para iniciar a co-cultura, adicione células T CAR às células JeKo-1 CD19-positivas na proporção de um para um. Traga o volume total da co-cultura para 160 mililitros com meio de células T e armazene as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para reestimular as células T CAR, colete as co-culturas em tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue as amostras a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Ressuspenda cada amostra em 80 mililitros de meio de células T e adicione 80 vezes 10 à potência de seis células JeKo-1 em 80 mililitros de meio de células T. Armazene as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia 15, para isolar as células T CAR da co-cultura, primeiro conte as células. Combine um kit de seleção positiva para células T CD4-positivas com um kit de seleção positiva para células T CD8-positivas para isolar células T das co-culturas CAR T JeKo-1. Em seguida, conte as células T isoladas. Para preservar as amostras para sequenciamento de próxima geração, alíquota 33 vezes 10 elevado à potência de seis células T CAR em um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue a amostra a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius. Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de PBS e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Em seguida, lave o tubo cônico de 50 mililitros com um mililitro de PBS e transfira a lavagem para o mesmo tubo de microcentrífuga. Depois de centrifugar as amostras e remover o sobrenadante, armazene os grânulos celulares a -20 graus Celsius. Para começar, isole o DNA genômico de pellets de células T CAR congelados usando um kit de isolamento de DNA genômico. Purifique o DNA genômico isolado por meio da precipitação de etanol, pré-resfriando primeiro o etanol 100% a -20 graus Celsius. Aliquota o DNA eluído igualmente em vários tubos de microcentrífuga, garantindo que cada alíquota tenha de 200 a 250 microlitros. Adicione dois volumes de etanol 100% pré-resfriado, 0,1 volume de acetato de sódio de três molares e um microlitro de 20 miligramas por mililitro de glicogênio. Incube as amostras durante a noite a -20 graus Celsius. No segundo dia, gire as amostras a 13.000g por 20 minutos para granular o DNA precipitado. Remova o sobrenadante e lave os pellets com um mililitro de etanol a 70% girando a 7.500g por 10 minutos. Depois de secar completamente os pellets, ressuspenda-os em 50 microlitros de água estéril. Para preparar o DNA genômico para o sequenciamento de próxima geração, configure um PCR com a mistura de reação especificada mostrada aqui. Em seguida, execute a PCR usando as seguintes condições de ciclagem. Puxe as reações de PCR para cada amostra e purifique o produto de PCR usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Execute três microgramas do produto de PCR para cada amostra em um gel de agarose a 2%. Remova o produto de PCR do gel extraindo o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante. Armazene as amostras extraídas a -20 graus Celsius.