Estabelecimento de modelos ortotópicos de xenoenxerto derivados de pacientes para tumores cerebrais usando um dispositivo estereotáxico

Em minha pesquisa, nos concentramos no desenvolvimento de novos tratamentos para cânceres cerebrais infantis agressivos, como gliomas difusos da linha média, gliomas de alto grau, ependimomas e ameloblastomas. Nosso objetivo é encontrar novos alvos de drogas e desenvolver terapias que possam fazer a diferença nos pacientes, ao mesmo tempo em que estudamos como esses tumores podem afetar o ambiente cerebral circundante. Na pesquisa de tumores cerebrais pediátricos, desenvolvemos modelos de xenoenxerto derivados de pacientes usando injeções intracranianas, imagens avançadas e triagem de drogas de alto rendimento.

Técnicas como transcriptômica de célula única e especial nos ajudam a entender como o tumor afeta o ambiente cerebral e os efeitos do tratamento, permitindo-nos explorar novas terapias. Nosso grupo de tumores cerebrais no Children's Cancer Institute desenvolveu muitos modelos pediátricos de tumores cerebrais pediátricos por meio do Programa de Medicina Personalizada Zero Childhood Cancer. Descobrimos que os gliomas difusos da linha média são resistentes a tratamentos medicamentosos devido a uma barreira hematoencefálica intacta.

Terapias promissoras direcionadas às vias epigenéticas e oncogênicas melhoraram a sobrevida pediátrica e agora estão em desenvolvimento clínico. Usando modelos ortotópicos de tumores cerebrais, gostaríamos de entender como os tumores afetam a vasculatura cerebral. Ao aplicar técnicas como transcriptômica especial, gostaríamos de identificar vias afetadas por tumores cerebrais.

Esse conhecimento nos ajudará a identificar moduladores da barreira hematoencefálica que podem afrouxar a barreira, permitindo que os tratamentos medicamentosos penetrem de forma mais eficaz. Para começar, descongele as células tumorais cerebrais formadoras de neuroesferas cultivadas. Numa cabina de biossegurança, pipetar cuidadosamente as células cultivadas e o meio de cultura do balão de cultura de tecidos para um tubo cónico de 50 ml com uma pipeta serológica.

Centrifugue o tubo cônico a 300 G por até cinco minutos à temperatura ambiente. Com uma pipeta de 25 mililitros, aspire o meio acima do pellet, deixando aproximadamente 0,5 mililitros no tubo. Pipete suavemente as células para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de um mililitro para dissociar o pellet celular.

Adicione azul de tripano à suspensão celular e conte com um hemocitômetro. Alíquota Adicione 0,5 mililitro de PBS à suspensão celular.

Em seguida, centrifugue a 300 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente. Após a lavagem final, aspire o máximo de PBS possível.

Em seguida, coloque o pellet celular e 50 microlitros de hidrogel de matriz extracelular no gelo. Misture o pellet celular com o hidrogel da matriz extracelular imediatamente para se preparar para a injeção intracraniana. Para começar, monte um mouse anestesiado em um dispositivo estereotáxico.

Certifique-se de que os dentes da frente estejam fixados na barra incisiva e que o cone do nariz prenda o animal no lugar. Desinfete a cabeça do rato com uma ponta de algodão embebida em iodo, seguida de um lenço umedecido em isopropanol. Em seguida, aplique pomada para os olhos da córnea em ambos os olhos para evitar o ressecamento.

Faça uma incisão na base do cerebelo e estenda-a pelo crânio até o ponto médio para criar um corte de um centímetro de comprimento ao longo da face superior do crânio. Aperte a pele entre as orelhas para expor o crânio e, em seguida, aperte os bardos para prender a cabeça. Limpe a superfície do crânio e seque-a bem com um cotonete.

Prenda a broca na estrutura estereotáxica e localize a estrutura bregma ou lambdoid usando a broca. Uma vez que as coordenadas sejam estabelecidas, faça cuidadosamente um pequeno orifício no osso no local designado. Ressuspenda a suspensão de células de injeção de tumor cerebral preparada várias vezes usando uma pipeta, garantindo que as bolhas de ar sejam evitadas.

Puxe dois microlitros da mistura de células para uma microsseringa de vidro fria pré-lavada e conecte a seringa à estrutura estereotáxica. Ajuste a agulha na ponta do crânio para se preparar para a injeção. Dentro de 30 segundos, injete as células na região perfurada.

Limpe qualquer suspensão de células refluídas com um pano de isopropanol durante a injeção. Deixe a seringa no lugar por um minuto para evitar o refluxo e permitir que o hidrogel da matriz extracelular assente. Em seguida, remova a seringa e limpe a ferida com um pano de isopropanol.

Sele a incisão com cola de pele ou clipes de ferida, se necessário. Coloque o mouse em uma posição reclinada em uma gaiola de recuperação limpa com uma lâmpada de calor ou almofada de aquecimento para manter o calor. Monitore o animal continuamente até que ele comece a se mover de forma independente e normal.

Após a injeção intracraniana, monitore os camundongos cinco dias por semana para avaliar seu bem-estar geral. Registre parâmetros como perda de peso, nível de atividade, postura, sinais de desidratação e condição do pelo em uma folha de monitoramento designada. Os animais exibiram sintomas distintos com base no tipo de tumor e no local da injeção, como inclinação da cabeça em tumores do tronco encefálico e aumento do prosencéfalo para gliomas corticais ou ependimomas.

Injeções intracranianas de células de meduloblastoma D425 em diferentes densidades revelaram uma correlação direta entre a densidade celular e a velocidade de enxerto tumoral com 100.000 células, levando à menor sobrevida média de 15 dias. As células de glioma de alto grau injetadas no córtex resultaram em uma sobrevida média de aproximadamente 25,5 dias, com análise imuno-histoquímica revelando uma grande massa tumoral altamente nucleada e aumento da vascularização, bem como abundantes células proliferativas positivas para Ki-67. Injeções de tronco encefálico de células de glioma de alto grau resultaram em uma sobrevida média de aproximadamente 26 dias com análise imuno-histoquímica indicando uma massa tumoral na ponte superior e infiltração leptomeníngea, bem como células proliferativas positivas para Ki-67 em áreas infiltradas.