Ativação optogenética de neurônios autônomos cardíacos intrínsecos em corações de camundongos perfundidos excisados

Apresentamos uma abordagem experimental valiosa para investigar a cinética da ativação súbita de neurônios autonômicos intrínsecos em corações perfundidos e a interação entre a atividade catecolaminérgica cardíaca e colinérgica. Corações de camundongos perfundidos podem ser muito sensíveis a mudanças no ambiente, como temperatura, oxigenação e concentração de perfusato. Eles exigem um monitoramento mais próximo do que modelos animais maiores.

Além disso, o micro-LED pode levar algumas tentativas e erros no início para obter resultados consistentes. Estamos trabalhando para entender o que acontece no coração quando os sistemas simpático e parassimpático são ativados ao mesmo tempo. A novidade é que estamos estudando esse tópico usando optogenética para fotoestimular os gânglios cardíacos e os neurônios dentro do próprio coração.

O micro-LED mostrado aqui é de baixo custo e relativamente simples de replicar. Devido ao seu tamanho, o micro LED é manobrável e pode atingir áreas do coração com mais precisão do que fontes de luz maiores. Para começar, sob um microscópio de dissecação em uma área bem ventilada, solde as extremidades descascadas de dois fios de cobre isolados nos pontos de contato de um micro-LED de 465 nanômetros.

Conecte o micro-LED a uma fonte de alimentação e ligue-o para testar a solda. Corte o centímetro inferior de uma ponta de pipeta filtrada de 200 microlitros. Empurre o filtro para fora usando uma haste de pequeno diâmetro.

Insira o micro-LED com os fios conectados na ponta da pipeta de forma que o LED fique nivelado com a extremidade da ponteira. Recoloque o filtro na parte superior da ponta da pipeta para prender o LED e os fios. Em seguida, cole as bordas do LED na ponta da pipeta.

Deixe a supercola secar. Para preparar o elastômero de silicone, misture a base e o agente de cura até que a solução fique uniforme. Remova todas as bolhas da mistura usando uma câmara de vácuo.

Em seguida, pegue um tubo de centrífuga de 0,5 mililitro e marque as laterais para facilitar a remoção do LED. Prenda a parte externa do tubo da centrífuga para evitar vazamentos. Despeje aproximadamente 0,2 mililitros de elastômero de silicone no tubo.

Coloque a ponta da pipeta micro-LED no tubo, garantindo pelo menos um milímetro de espaço entre o LED e a parte inferior do tubo. Coloque o micro-LED do tubo da centrífuga na vertical em um forno a 50 graus Celsius por oito horas ou durante a noite. Assim que o elastômero estiver endurecido, remova o LED do tubo.

Depois de curado, corte qualquer excesso de elastômero da ponta do LED com uma faca de precisão, deixando no máximo um milímetro. Para começar, adicione 175 mililitros de solução de Krebs-Henseleit ou KH ao sistema de perfusão. Coloque um filtro de membrana de 10 micrômetros no sistema de perfusão Langendorff.

Em seguida, inicie a circulação. Ligue os banhos-maria e ajuste-os para manter a temperatura do perfusato em 37 graus Celsius. Para calibrar o medidor de vazão, interrompa o fluxo no sistema de perfusão usando uma torneira.

Em seguida, pressione o botão zero no medidor de vazão para realizar a calibração. Abra o software de aquisição de dados LabChart. Configure o software para incluir 12 canais.

Configure canais para temperatura do banho cardíaco, temperatura do perfusato aórtico, derivações de ECG de um a três para derivações computadas adicionais, cálculo da frequência cardíaca, taxa de fluxo e uma saída de gerador de função para rastrear pulsos de LED. Em seguida, use o canal designado para frequência cardíaca para calcular a frequência cardíaca. Ative o recurso de medições cíclicas, configurando-o para detectar o ECG do camundongo na derivação.

Use a extensão Cardiac Access do LabChart para calcular as derivações três aVR, aVL e aVF com base nas derivações um e dois. Depois de anestesiar e sacrificar o camundongo, segure o processo xifóide com uma pinça e corte a cavidade abdominal usando uma tesoura cirúrgica. Corte cuidadosamente o diafragma para abrir a cavidade torácica.

Em seguida, corte as costelas para expor o coração e os pulmões. Agarre suavemente os pulmões e excise o coração e os pulmões. Coloque o coração em um prato contendo solução de KH heparinizada.

Remova os pulmões e quaisquer grandes depósitos de gordura. Sob um microscópio de dissecação, defina para ampliação de 2x. Transfira o coração limpo para um segundo prato de solução heparinizada de KH.

Localize a aorta e deslize-a sobre a cânula usando uma pinça fina. Prenda o coração à cânula com uma sutura de seda 4-0. Em seguida, lave a cânula com um bolus de KH heparinizado para remover o sangue dos vasos coronários.

Conecte o coração canulado ao sistema de perfusão e coloque-o no prato PDMS cheio de perfusato. Coloque os eletrodos da agulha de ECG no prato PDMS de acordo com o triângulo de Einthoven. Gire o coração para que o átrio esquerdo fique acessível.

Use uma tesoura de micro abertura automática para criar uma incisão de um milímetro no átrio esquerdo. Insira um tubo de um milímetro de diâmetro na incisão para permitir que o perfusato preso no ventrículo esquerdo seja drenado. Em seguida, gire o coração para que o átrio direito fique voltado para cima e o nó sinoatrial fique acessível para iluminação.

Ajuste os eletrodos de ECG conforme necessário, aproximando-os do coração para melhorar a relação sinal-ruído. Para ativação optogenética, conecte o dispositivo micro-LED a um gerador de funções e configure-o para produzir ondas de pulso com frequência de 10 hertz, largura de pulso de 30 milissegundos e amplitude de 10 volts pico a pico. Coloque o micro-LED suavemente no nó sinoatrial.

Em seguida, ligue o gerador de funções e observe as alterações na frequência cardíaca da fotoestimulação. Alterações imediatas na frequência cardíaca indicam ativação eficaz. Desligue o gerador de funções.

Permita que a frequência cardíaca retorne aos níveis de pré-ativação. Se a ativação optogenética resultar em uma alteração da frequência cardíaca inferior a 100 BPM, reposicione o micro-LED para iluminar os neurônios no átrio direito. A estimulação optogenética dos neurônios ChAT reduziu a frequência cardíaca em mais de 100 BPM durante a estimulação com luz sem que a norepinefrina sustentasse a redução durante a estimulação.

Com 2.000 nanomoles de norepinefrina, a frequência cardíaca caiu 40 BPM e começou a se recuperar antes que a luz fosse apagada. A supressão optogenética da frequência cardíaca pela fotoestimulação do neurônio ChAT foi menos eficaz na superação dos aumentos da frequência cardíaca induzidos por altas doses de norepinefrina, resultando em tempos de supressão mais curtos e menores diminuições na frequência cardíaca.